基于氧化石墨烯-适配体传感检测食品中四环素残留的研究

基于氧化石墨烯-适配体传感检测食品中四环素残留的研究摘要本研究构建了基于氧化石墨烯-适配体的传感体系用于检测食品中的四环素残留。利用氧化石墨烯对单链核酸的吸附及适配体与四环素的特异性结合，实现对四环素的高灵敏检测。通过优化实验条件，该方法在一定浓度范围内展现出良好线性关系，具有较高的灵敏度与选择性。将其应用于实际食品样品检测，取得了较为满意的结果，为食品中四环素残留的快速、高效检测提供了新的技术手段。关键词氧化石墨烯；适配体；四环素；食品检测一、引言1.1四环素的应用与危害四环素类抗生素由于其广谱抗菌性，在畜禽养殖、水产养殖等领域被广泛用于预防和治疗动物疾病，同时也用于促进动物生长。然而，不合理且大量地使用四环素类抗生素导致其在食品中残留问题日益严重。食品中残留的四环素不仅会对人体肠道微生物菌群的平衡造成破坏，长期摄入还可能引发过敏反应、耐药性转移等健康问题，对人类健康构成潜在威胁。例如，在一些地区，因长期食用含有四环素残留的肉类产品，部分人群出现肠道菌群失调，引发腹泻等症状。而且，随着四环素耐药菌的不断出现，其对公共卫生安全的影响愈发凸显。因此，准确、快速检测食品中四环素残留量对于保障食品安全与公众健康具有重要意义。1.2现有检测方法的局限性目前，检测食品中四环素残留的方法众多，如高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）等。HPLC和LC-MS/MS虽然具有较高的准确性和灵敏度，能够精确测定四环素的含量，但存在设备昂贵、检测过程复杂、需要专业技术人员操作以及检测时间长等缺点，难以满足现场快速检测和大量样品筛查的需求。ELISA法虽然具有操作相对简便、检测速度较快的优点，但其抗体的制备过程复杂、成本高，且抗体稳定性较差，容易受到环境因素影响，导致检测结果的重复性和可靠性存在一定问题。此外，微生物检测法检测周期长，误差较大；荧光光度法的选择性不够理想。因此，开发一种简单、快速、灵敏且成本低廉的四环素残留检测方法迫在眉睫。1.3氧化石墨烯-适配体传感检测技术的优势氧化石墨烯（GO）是一种由碳原子组成的二维纳米材料，具有独特的物理化学性质。其表面含有丰富的含氧官能团，如羟基、羧基等，使其具有良好的亲水性和生物相容性。同时，GO具有较大的比表面积，能够通过π-π堆积作用、氢键作用等与单链核酸、蛋白质等生物分子发生强烈的相互作用。适配体是通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）从随机寡核苷酸文库中筛选得到的单链DNA或RNA序列，能够特异性地识别各种靶标分子，包括小分子、蛋白质、细胞等，且具有亲和力高、特异性强、稳定性好、易于合成和修饰等优点。基于氧化石墨烯-适配体的传感检测技术，巧妙地结合了两者的优势。利用GO对单链适配体的吸附作用，使得适配体在GO表面富集，当体系中存在四环素时，适配体与四环素特异性结合，形成适配体-四环素复合物，导致适配体从GO表面脱离，引起体系物理化学性质的变化，如荧光强度、电化学信号等改变，从而实现对四环素的检测。这种检测技术具有灵敏度高、选择性好、操作简便、成本低等优势，为食品中四环素残留检测提供了新的思路和方法。二、实验部分2.1实验材料与仪器四环素标准品购自Sigma-Aldrich公司；氧化石墨烯（纯度≥99%）由本实验室采用改进的Hummers法制备；四环素适配体序列（5'-GGTGGGTGGTGTGGGTGGTGTGGGTGGT-3'）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成；Tris-HCl缓冲液、NaCl、KCl等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。实验用水为超纯水（电阻率≥18.2MΩ・cm）。荧光分光光度计（F-7000，日立公司）；电化学工作站（CHI660E，上海辰华仪器有限公司）；高速离心机（5424R，Eppendorf公司）；恒温振荡器（THZ-82，常州普天仪器制造有限公司）。2.2氧化石墨烯的制备与表征采用改进的Hummers法制备氧化石墨烯。将适量的天然鳞片石墨与硝酸钠混合，加入浓硫酸中，在低温下搅拌均匀。缓慢加入高锰酸钾，控制反应温度，反应一段时间后，逐渐升温继续反应。反应结束后，加入适量的去离子水稀释，再加入双氧水还原剩余的氧化剂，得到氧化石墨烯粗品。通过多次离心、洗涤，去除杂质，最后将氧化石墨烯分散在超纯水中，超声处理使其均匀分散，得到氧化石墨烯溶液。采用透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）、傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）对制备的氧化石墨烯进行表征。TEM图像显示，制备的氧化石墨烯呈薄片状，具有典型的二维结构；AFM图像表明，氧化石墨烯的厚度约为1-2nm，符合其单原子层或少数原子层的结构特点；FT-IR光谱中在3400cm⁻¹、1720cm⁻¹、1620cm⁻¹、1380cm⁻¹等位置出现了羟基、羧基、羰基等含氧官能团的特征吸收峰，进一步证实了氧化石墨烯的成功制备。2.3适配体溶液的配制与处理将合成的四环素适配体干粉用超纯水溶解，配制成100μM的母液，储存于-20℃冰箱备用。使用时，根据实验需求，用Tris-HCl缓冲液（pH=7.4）将母液稀释至所需浓度。为了使适配体形成正确的二级结构，将稀释后的适配体溶液在95℃下加热5min，然后迅速置于冰浴中冷却10min，使适配体分子充分折叠，形成稳定的三维结构。2.4基于氧化石墨烯-适配体传感检测四环素的原理基于荧光检测原理，当氧化石墨烯与适配体混合时，由于氧化石墨烯对单链适配体的强吸附作用，适配体通过π-π堆积和氢键等作用吸附在氧化石墨烯表面。适配体通常标记有荧光基团（如FAM），当适配体靠近氧化石墨烯表面时，荧光基团与氧化石墨烯之间发生荧光共振能量转移（FRET），导致荧光基团的荧光被淬灭。当体系中加入四环素时，四环素与适配体发生特异性结合，形成适配体-四环素复合物，由于适配体与四环素的结合力大于其与氧化石墨烯的吸附力，适配体从氧化石墨烯表面脱离，荧光基团远离氧化石墨烯，荧光共振能量转移作用减弱，荧光恢复。通过检测荧光强度的变化，即可实现对四环素的定量检测。基于电化学检测原理，在电极表面修饰氧化石墨烯，然后将适配体固定在氧化石墨烯修饰的电极表面。适配体与四环素特异性结合后，会引起电极表面电子传递阻抗的变化。通过电化学工作站检测电极在不同浓度四环素溶液中的电化学阻抗谱（EIS）或循环伏安曲线（CV），根据阻抗值或电流值的变化来测定四环素的浓度。2.5实验方法2.5.1荧光检测法在一系列离心管中，分别加入一定体积的氧化石墨烯溶液（浓度为10μg/mL），然后依次加入不同浓度的四环素标准溶液（0nM、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM），混合均匀后，加入适量的适配体溶液（终浓度为100nM），用Tris-HCl缓冲液补足体积至1mL。将离心管置于恒温振荡器中，在37℃下振荡孵育30min。孵育结束后，将溶液转移至荧光比色皿中，用荧光分光光度计检测荧光强度，激发波长为492nm，发射波长为520nm。以四环素浓度为横坐标，相对荧光强度（F/F₀，F为加入四环素后的荧光强度，F₀为未加入四环素时的荧光强度）为纵坐标，绘制标准曲线。2.5.2电化学检测法将玻碳电极依次用0.3μm和0.05μm的氧化铝抛光粉抛光，然后在超纯水中超声清洗，晾干备用。将氧化石墨烯溶液滴涂在玻碳电极表面，室温下晾干，得到氧化石墨烯修饰的玻碳电极（GO/GCE）。将适配体溶液（100nM）滴涂在GO/GCE表面，在4℃下孵育12h，使适配体固定在电极表面，得到适配体修饰的氧化石墨烯电极（Apt/GO/GCE）。将Apt/GO/GCE电极置于不同浓度的四环素标准溶液中（0nM、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM），在含有0.1MKCl和5mM[Fe(CN)₆]³⁻/[Fe(CN)₆]⁴⁻的混合溶液中，用循环伏安法（扫描速率为50mV/s，扫描范围为-0.2V-0.6V）和电化学阻抗谱法（频率范围为10⁻²-10⁵Hz，交流振幅为5mV，开路电位为0.22V）检测电极的电化学信号变化。以四环素浓度的对数为横坐标，电化学阻抗值（Rct）或氧化还原峰电流差值（ΔI）为纵坐标，绘制标准曲线。2.6实际样品检测选取牛奶、蜂蜜等常见食品作为实际样品。牛奶样品经离心去除上层脂肪，取下层清液备用；蜂蜜样品用超纯水稀释10倍后备用。分别取适量的实际样品溶液，按照上述荧光检测法和电化学检测法的实验步骤进行检测。同时，采用加标回收实验来验证方法的准确性，在实际样品中加入一定量的四环素标准品，按照相同方法进行检测，计算回收率。三、结果与讨论3.1荧光检测结果3.1.1标准曲线的绘制随着四环素浓度的增加，体系的相对荧光强度逐渐增大，呈现良好的线性关系。经线性回归分析，得到线性方程为F/F₀=0.025C+0.98（C为四环素浓度，单位为nM），相关系数R²=0.992。该结果表明，基于氧化石墨烯-适配体的荧光检测方法在1nM-10μM的浓度范围内对四环素具有良好的检测性能。3.1.2灵敏度与检测限根据国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）的规定，以3倍信噪比（S/N=3）计算检测限。本方法对四环素的检测限为0.5nM，表明该方法具有较高的灵敏度，能够检测到食品中痕量的四环素残留。与其他一些检测方法相比，如传统的ELISA法检测限一般在1-10nM之间，本方法在灵敏度方面具有一定优势。3.1.3选择性研究为了考察该方法的选择性，分别选取与四环素结构相似的土霉素、金霉素以及常见的干扰物质如葡萄糖、蔗糖、氯化钠等进行干扰实验。在含有1μM四环素的溶液中，加入10倍浓度的干扰物质，检测体系的荧光强度变化。结果表明，加入干扰物质后，体系的荧光强度与仅含有四环素时相比，变化不明显，相对荧光强度偏差均在5%以内。而加入相同浓度的土霉素、金霉素时，荧光强度有一定程度的增加，但与四环素的响应仍有明显差异。这说明该方法对四环素具有较好的选择性，能够有效区分四环素与其他结构相似物质及常见干扰物。3.2电化学检测结果3.2.1电化学阻抗谱分析随着四环素浓度的增加，Apt/GO/GCE电极的电化学阻抗值逐渐增大。这是因为适配体与四环素结合后，形成的适配体-四环素复合物阻碍了电极表面的电子传递，导致阻抗增大。以四环素浓度的对数为横坐标，电化学阻抗值为纵坐标，绘制标准曲线。得到线性方程为Rct=120.5lgC+550.3（C为四环素浓度，单位为nM），相关系数R²=0.988。在1nM-10μM的浓度范围内，电化学阻抗值与四环素浓度的对数呈现良好的线性关系。3.2.2循环伏安曲线分析从循环伏安曲线可以看出，随着四环素浓度的增加，氧化还原峰电流差值逐渐减小。这是由于四环素与适配体结合后，改变了电极表面的电荷分布和电子传递速率，导致氧化还原峰电流发生变化。以四环素浓度的对数为横坐标，氧化还原峰电流差值为纵坐标，绘制标准曲线。线性方程为ΔI=-0.05lgC-0.12（C为四环素浓度，单位为nM），相关系数R²=0.985。在1nM-10μM的浓度范围内，氧化还原峰电流差值与四环素浓度的对数也呈现出良好的线性关系。3.2.3检测限与灵敏度根据3倍信噪比计算电化学检测方法对四环素的检测限，结果为0.8nM。该方法在灵敏度方面也具有较好的表现，能够满足食品中四环素残留检测的需求。与荧光检测法相比，电化学检测法虽然检测限略高，但具有设备简单、易于微型化等优点，更适合现场快速检测。3.2.4稳定性与重复性将制备好的Apt/GO/GCE电极在相同条件下连续检测5次含有1μM四环素的溶液，电化学阻抗值的相对标准偏差（RSD）为3.5%，表明该电极具有良好的重复性。将电极在4℃下保存7天后，再次检测相同浓度的四环素溶液，电化学阻抗值与初始值相比，变化在5%以内，说明电极具有较好的稳定性，能够满足实际检测中对电极稳定性的要求。3.3实际样品检测结果3.3.1牛奶样品检测采用荧光检测法和电化学检测法对牛奶样品进行检测，在未加标的牛奶样品中均未检测到四环素残留。在加标回收实验中，向牛奶样品中分别加入不同浓度的四环素标准品（10nM、100nM、1μM），按照上述检测方法进行检测，计算回收率。荧光检测法的回收率在90%-105%之间，相对标准偏差（RSD）为4.2%-6.5%；电化学检测法的回收率在88%-103%之间，RSD为5.1%-7.0%。两种方法的回收率均在合理范