DB13-T 1080-2009 乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定

DB13T10802009乳及乳制品中β内酰胺酶的测定1范围本标准规定了乳及乳制品中β内酰胺酶的测定方法。本标准适用于生鲜乳、灭菌乳、调制乳、发酵乳、乳粉、炼乳、奶油、干酪等乳及乳制品中β内酰胺酶的测定。2原理β内酰胺酶能够水解β内酰胺类抗生素的β内酰胺环，使其失去抗菌活性。本方法基于β内酰胺酶对头孢硝噻吩的显色反应原理，利用头孢硝噻吩作为底物，在β内酰胺酶的作用下水解产生有色化合物，通过分光光度法测定其吸光度值，从而计算出样品中β内酰胺酶的活性。3试剂和材料除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。3.1头孢硝噻吩（Nitrocefin）：纯度≥90%。3.2磷酸二氢钾（KH₂PO₄）。3.3磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）。3.4二甲基亚砜（DMSO）。3.5磷酸盐缓冲液（pH7.0）：称取磷酸二氢钾0.68g，磷酸氢二钠1.42g，溶于900mL水中，用磷酸或氢氧化钠溶液调节pH至7.0，加水定容至1000mL。3.6头孢硝噻吩溶液（0.5mg/mL）：准确称取5mg头孢硝噻吩，用10mL二甲基亚砜溶解，临用现配。3.7β内酰胺酶标准品：纯度≥1000U/mg。3.8β内酰胺酶标准储备液（1000U/mL）：准确称取10mgβ内酰胺酶标准品，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至10mL，4℃保存，有效期1个月。3.9β内酰胺酶标准工作液：用磷酸盐缓冲液将标准储备液稀释成10U/mL、20U/mL、50U/mL、100U/mL、200U/mL的标准系列，临用现配。4仪器和设备4.1分光光度计：波长范围340800nm，配备1cm比色皿。4.2恒温水浴锅：控温精度±0.5℃。4.3电子天平：感量0.0001g。4.4均质器：转速800015000r/min。4.5离心机：转速≥4000r/min。4.6涡旋混合器。4.7微量移液器：10100μL、1001000μL。4.8pH计：精度±0.01。4.9超声波清洗器。4.10恒温培养箱：控温精度±1℃。5试样的制备与保存5.1液体乳制品（生鲜乳、灭菌乳、调制乳、发酵乳等）：取代表性样品约50mL，充分混匀后备用。如需保存，应置于4℃冷藏条件下，不超过24h。5.2乳粉：取代表性样品约10g，加入90mL40℃温水，充分溶解后冷却至室温，定容至100mL，混匀备用。5.3炼乳：取代表性样品约10g，加入90mL水，充分混匀后备用。5.4奶油：取代表性样品约10g，置于40℃水浴中加热融化，混匀后冷却至室温备用。5.5干酪：取代表性样品约10g，切碎后加入90mL磷酸盐缓冲液，用均质器以10000r/min均质2min，混匀备用。5.6所有试样在测定前应恢复至室温（20±2℃），并充分混匀。6分析步骤6.1标准曲线的绘制分别吸取β内酰胺酶标准工作液（10U/mL、20U/mL、50U/mL、100U/mL、200U/mL）各100μL，置于10mL比色管中，加入2.9mL磷酸盐缓冲液，混匀。加入1mL头孢硝噻吩溶液，立即混匀，置于37℃恒温水浴中反应10min。以磷酸盐缓冲液为空白对照，在4nm波长处测定吸光度值。以β内酰胺酶活性为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。6.2试样测定6.3结果计算试样中β内酰胺酶活性按式（1）计算：X=(AA₀)×V×N/(m×k)式中：X——试样中β内酰胺酶活性，单位为U/g或U/mL；A——试样溶液的吸光度值；A₀——试剂空白的吸光度值；V——试样溶液总体积，单位为mL；N——稀释倍数；m——试样质量或体积，单位为g或mL；k——标准曲线斜率。计算结果保留三位有效数字。7精密度7.1重复性在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。7.2再现性在再现性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8检出限和定量限本方法的检出限为0.5U/g（或U/mL），定量限为1.5U/g（或U/mL）。9注意事项9.1头孢硝噻吩溶液应临用现配，避光保存，避免反复冻融。9.2反应温度和时间应严格控制，温度波动不应超过±0.5℃，反应时间应准确计时