生鲜乳和畜肉中氨基糖苷类药物的快速检测

生鲜乳和畜肉中氨基糖苷类药物的快速检测胶体金免疫层析法国家市场监督管理总局发布1卡那霉素6种氨基糖苷类药物残留量的快速定性检测。体结合，从而抑制抗体与试纸条检测线(T3.1.3十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO₄·12H₂O)。3.1.4二水合磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)。3.2.1样品提取液(畜肉样品专用):称取3.0g三氯乙酸(3.1.5),用水溶解后转移至容量瓶内定容至3.2.3样品稀释液I(牛奶检测专用):准确称取8.765g氯化钠(3.1.2)、5.8g十二水合磷酸氢二钠(3.1.3)、0.595g二水合磷酸二氢钠(3.1.4),用水溶解后转移至容量瓶内定容至1000mL,再称取30g2即样品稀释液Ⅱ。3.2.5样品稀释液Ⅲ(新霉素/庆大霉素畜肉组织检测专用):准确称取5.843g氯化钠(3.1.2)、29.01g十二水合磷酸氢二钠(3.1.3)、2.963g二水合磷酸二氢钠(3.1.4),用水溶解后转移至容量瓶内定容至1000mL,依次加入10g脱脂奶粉(3.5.2)、50g氢氧化钠溶液(3.2.2),充分混匀，即样品稀释液Ⅲ。3.2.6样品稀释液IV(大观霉素畜肉组织检测专用):准确称取8.765g氯化钠(3.1.2)、5.8g十二水合磷酸氢二钠(3.1.3)、0.595g二水合磷酸二氢钠(3.1.4),用水溶解后转移至容量瓶内定容至1000mL,再称取10g脱脂奶粉(3.5.2),充分混匀，即样品稀释液IV。3.2.7样品稀释液V(卡那霉素猪肉组织检测专用):准确称取29.22g氯化钠(3.1.2)、43.515g十二水合磷酸氢二钠(3.1.3)、4.445g二水合磷酸二氢钠(3.1.4),用水溶解后转移至容量瓶内定容至1000mL,即样品稀释液V。3.3参考物质氨基糖苷类药物参考物质的中文名称、英文名称、CAS号、分子式、相对分子质量见表1,纯度注：或等同可溯源物质。中文名称DihydrostreptomycinSul3.4标准溶液配制3.4.15种氨基糖苷类药物标准储备液(100μg/mL):分别准确称取适量经纯度折算后的每种氨基糖苷类药物(链霉素硫酸盐、双氢链霉素硫酸盐、新霉素硫酸盐、卡那霉素硫酸盐和庆大霉素硫酸盐)标准物质(3.3),置于小烧杯中，用水溶解，转移至100mL容量瓶中，再用水定容，摇匀，配制成质量浓度为100μg/mL的标准储备溶液。4℃避光保存，有效期6个月。3.4.2大观霉素标准储备液(1mg/mL):准确称取适量经纯度折算后的大观霉素标准品(3.3),置于小1mg/mL的标准储备溶液。4℃避光保存，有效期6个月。3.4.3大观霉素标准工作液(100μg/mL):精密量取大观霉素标准贮备液(3.4.2)1.0mL于10mL容量瓶中，用甲醇(3.1.1)定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度为100μg/mL的标准工作液。2℃~8℃避光保存，有效期7d。3.5.1链霉素/双氢链霉素胶体金免疫层析试剂盒：一般包含金标微孔(含胶体金标记的特异性抗体)、胶体金试纸条等。33.5.2新霉素胶体金免疫层析试剂盒：一般包含金标微孔(含胶体金标记的特异性抗体)、胶体金试纸3.5.3大观霉素胶体金免疫层析试剂盒：一般包含金标微孔(含胶体金标记的特异性抗体)、胶体金试纸条等。3.5.4卡那霉素胶体金免疫层析试剂盒：一般包含金标微孔(含胶体金标记的特异性抗体)、胶体金试纸条等。3.5.5庆大霉素胶体金免疫层析试剂盒：一般包含金标微孔(含胶体金标记的特异性抗体)、胶体金试纸条等。3.5.6脱脂奶粉：脂肪含量小1.5%,不含氨基糖苷类药物成分。4仪器和设备4.1电子天平：感量为0.01mg和0.01g。4.4离心机：转速≥4000r/min。4.7胶体金读数仪(可选)。5环境条件温度20℃~40℃。6分析步骤称取约100g具有代表性的牛奶样品，分为2份分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记。留样置于-18℃保存。称取约200g畜肉(除去脂肪),经高速组织匀浆机均匀捣碎，均分成2份，装入清洁容器内，分别作为试样和留样，密封，标记。留样置于-18℃保存。称取制备好的试样约2g至10mL离心管，用移液器移取30μL至1.5mL离心管中，加入870μL样品稀释液I(3.2.3),涡旋混合30s,作为待测液。准确称取制备好的试样2g(精确至0.01g)至10mL离心管中，加入6mL样品提取液(3.2.1),涡4旋混合3min,4000r/min离心3min,上清液备用。6.3测定步骤用移液器吸取200μL待测液(6.2.1)于金标微孔(3.5.1)中，反复吹吸4次～5次使金标微孔试剂完全溶解。金标微孔置于孵育器中50℃温育3min,试纸条插入金标微孔至底部，反应5min～8min,取待测液准备：组织试样提取后的上清液(6.2.2)经过稀释后，制备成待测液。不同氨基糖苷类药物检测的稀释方式不同，如表2所示。表2氨基糖苷类药物待测液制备方法1.5mL离心管中加入50μL上清液，再加入600μL样品稀释液Ⅱ(3.2.4),涡旋混匀1.5mL离心管中加入100μL上清液，再加入200μL样品稀释液Ⅲ(3.2.5),涡旋混1.5mL离心管中加入50μL上清液，再加入750μL样品稀释液IV(3.2.6),涡旋混匀1.5mL离心管中加入100μL上清液，再加入400μL样品稀释液V(3.2.7),涡旋混用移液器吸取以上待测液150μL于金标微孔中，反复吹吸4次～5次使金标微孔试剂完全溶解，室温温育3min,试纸条插入金标微孔至底部，反应5min～8min,取出试纸条，刮去下端样品垫，判定结果。6.4质控试验6.4.1每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。6.4.2空白试验：称取同类基质空白试样，按照6.2和6.3步骤与样品同法操作。6.4.3加标质控试验：准确称取同类基质空白试样2g(精确至0.01g)置于10mL离心管中。牛奶试样加入氨基糖苷类药物标准溶液，使其浓度水平为：链霉素/双氢链霉素200μg/kg、新霉素1500μg/kg、大观霉素200μg/kg、庆大霉素200μg/kg、卡那霉素150μg/kg。畜肉组织试样加入氨基物标准溶液，使其浓度水平为：链霉素/双庆大霉素100μg/kg、卡那霉素100μg/kg。按照6.2和6.3步骤与样品同法操作。7结果判定7.1通则采用目视法对结果进行判读，目视判定示意图如图1所示。结果有以下几种：5b)阴性结果：T线颜色比C线颜色深或者T线颜色与C线颜色相当，表明样品中氨基糖苷类药物含量低于方法检出限，判为阴性。c)阳性结果：T线不显色或T线颜色比C线颜色浅，表明样品中氨基糖苷类药物含量高于方法图1目视判定示意图空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。质控试验结果不符合要求时，同批次所有检测结果判定为无效结果。若出现无效结果，需对同批次样品进行重新检测。当检测结果为阳性时，采用参比方法进行确证。9性能指标本方法牛奶中氨基糖苷类药物的检出限为：链霉素/双氢链霉素200μg/kg、新霉素1500μg/kg、大观霉素200μg/kg、庆大霉素200μg/kg、卡那霉素150μg/kg。猪肉、牛肉和羊肉中氨基糖苷类药物的检出限为：链霉素/双氢链霉素600μg/kg、新霉素500μg/kg、大观霉素500μg/kg、庆大霉素灵敏度≥95%。特异性≥95%。6本方法制定过程中使用的快检产品与巴龙霉素、妥布霉素存在交叉反应，相关化合物交叉反应情况见表3。表3交叉反应结果新霉素、大观霉素、庆大霉素、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、巴龙霉素、氟苯尼考、氯霉素、黄曲霉毒素M1、红霉素、多西环素、地塞米松、恩新霉素、大观霉素、庆大霉素、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、巴龙霉素、氟苯尼考、氯霉素、黄曲霉毒素M:、红霉素、多西环素、地塞米松、恩巴龙霉素链霉素、双氢链霉素、大观霉素、庆大霉素、卡那霉素、安普霉素、尼考、氯霉素、黄曲霉毒素M₁、红霉素、多西环素、地塞米松、恩诺沙星、替米链霉素、双氢链霉素、新霉素、庆大霉素、卡那霉素、安普霉素、妥素、氟苯尼考、氯霉素、黄曲霉毒素M₁、红霉素、多西环素、地塞米松、恩诺沙星、替米考星链霉素、双氢链霉素、新霉素、大观霉素、卡那霉素、安普霉素、妥素、氟苯尼考、氯霉素、黄曲霉毒素M₁、红霉素、多西环素、地塞米松、恩诺沙星、替米考星链霉素、双氢链霉素、新霉素、大观霉素、庆大霉素、安普霉素、巴龙霉素、氟苯尼考、氯霉素、黄曲霉毒素M:、红霉素、多西环素、地塞米松、恩9.5假阴性率假阴性率≤5%。9.6假阳性率假阳性率≤5%。本方法所述试剂、试剂盒信息、操作步骤及结果判定要求是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。本方法参比方法为GB29685—2013《食品安全国家标准动物性食品中林可霉素、克林霉素和大7观霉素多残留的测定气相色谱-质谱法》(大观霉素)、GB/T21323—2007《动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定高效液相色谱-质谱/质谱法》(链霉素、双氢链霉素、新霉素、庆大霉素、卡那霉素)、GB/T22969—2008《奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素和