中风复元合剂纯化工艺研究

中风复元合剂纯化工艺研究中风复元合剂纯化工艺研究[摘要]目的：为进一步提高中风复元合剂提取液的澄清度和稳定性，使其质量更稳定，疗效更可靠，本文采用正交试验以澄清剂对纯化工艺参数进行了优选，为批量生产提供科学合理的纯化工艺。方法：通过高效液相色谱法测定芍药苷、橙皮苷含量，计算芍药苷保留率、橙皮苷保留率和固形物含量，以其三者综合评分为评价指标，通过单因素实验考察药液浓度、ztc1+1浓度和水浴温度对纯化除杂效果的影响。色谱条，色谱柱：AgilentEclipseXDB-C185nm(46*250mm)PN:990967-902SN:USNG043732流动相：甲醇-水梯度洗脱,柱温：25℃，,流速：1.0mL/min,检测波长：230nm,100%，甲醇冲柱压力：60-61bar,甲醇：水（20：80）平衡基线压力：154~155结果：优选的纯化工艺是ZTC1+1澄清剂澄清法，最佳醇沉工艺条件为:药液浓度：1.5g生药/mL，ZTC1+1浓度：4.5%，水浴温度：40℃。结论优选的纯化工艺合理可行，操作简便，且可以满足中风复元合剂的大批量生产。[关键词]中风复元合剂;中药合剂纯化工艺；澄清剂；正交试验;高效液相色谱法；芍药苷；橙皮苷

StudyonPurificationProcessofStrokeComplexMixture[Abstract]Objective:InordertofurtherimprovetheclarityandstabilityoftheextractofZhongfengFuyuanMixture,thequalityismorestableandthecurativeeffectismorereliable.Inthispaper,theorthogonaltestisusedtooptimizethepurificationprocessparameterswithclarifyingagent,whichprovidesformassproduction.Scientificandrationalpurificationprocess.Methods:Thecontentofpaeoniflorinandhesperidinweredeterminedbyhighperformanceliquidchromatography.Theretentionrateofpaeoniflorin,theretentionrateofhesperidinandthecontentofsolidswerecalculated.Thecomprehensivescoresofthepaeoniflorinwereusedasevaluationindexestoinvestigatetheliquidmedicinebysinglefactorexperiment.Theeffectofconcentration,ztc1+1concentrationandwaterbathtemperatureonthepurificationandimpurityremovaleffect.Chromatographycolumn,column:AgilentEclipseXDB-C185nm(46*250mm)PN:990967-902SN:USNG043732mobilephase:methanol-watergradientelution,columntemperature:25°C,flowrate:1.0mL/min,detectionWavelength:230nm,100%,methanolcolumnpressure:60-61bar,methanol:water(20:80)equilibriumbaselinepressure:154~155Results:ThepreferredpurificationprocessisZTC1+1clarifyingagentclarificationmethod,andtheoptimalalcoholprecipitationprocessconditionsare:chemicalsolutionconcentration:1.5gcrudedrug/mL,ZTC1+1concentration:4.5%,waterbathtemperature:40°C.ConclusionThepreferredpurificationprocessisreasonableandcanmeettheproductionofStrokeComplex.[Keywords]Strokecomplexmixture;Chinesemedicinemixturepurificationprocess;clarifyingagent;orthogonaltest;highperformanceliquidchromatography；highperformanceliquidchromatography;paeoniflorin;hesperidin

目录1062_WPSOffice_Level1引言 14252_WPSOffice_Level11文献综述 24252_WPSOffice_Level21.1中风后遗症的研究进程 26485_WPSOffice_Level21.2处方中部分药材分析 26485_WPSOffice_Level12药材、试剂与仪器 33086_WPSOffice_Level22.1药材 33435_WPSOffice_Level22.2试剂 315400_WPSOffice_Level22.3仪器 43086_WPSOffice_Level13方法与结果 46437_WPSOffice_Level23.1混合对照品溶液的制备 4391_WPSOffice_Level23.2供试品溶液的制备 422913_WPSOffice_Level23.3方法学考察 412447_WPSOffice_Level23.4纯化方法的考察 105846_WPSOffice_Level23.5正交试验方案与结果 1318286_WPSOffice_Level23.6验证试验 153435_WPSOffice_Level14讨论 1615400_WPSOffice_Level15结论 166437_WPSOffice_Level1参考文献： 16

[34]。澄清溶液的配制壳聚糖溶液的制备：取5.00g壳聚糖粉末，加入1%醋酸溶液500ml，匀速搅拌，静置溶胀24h，制备成1%壳聚糖醋酸水溶液，备用；果汁101水溶液的制备：取5.00g果汁101粉末，加入100ml水，匀速搅拌，静置溶胀24h，制备成5%果汁101水溶液，备用；ZTC1+1的制备：ZTC1+1澄清剂分A、B两组分，取1.00g组分A粉末，加入纯化水100ml，搅拌均匀，静置溶胀24h，双层纱布滤过，配制成1%的ZTC组分A水溶液；另取1.00gZTC组分B粉末，加入1%醋酸溶液100ml，搅拌均匀，静置溶胀24h，双层纱布滤过，制备成1%ZTC组分B醋酸水溶液，备用。样品的制备未纯化对照液：取提取浓缩液200ml，滤过，水浴适当浓缩，转移至1000ml量瓶中，加纯化水至刻度，作为对照溶液，备用。离心沉淀法：取提取浓缩液200ml，5000r/min离心20分钟，滤过，上清液水浴适当浓缩，转移至100ml量瓶中，加纯化水定容至刻度，备用。乙醇沉淀法：取提取浓缩液200ml，加入乙醇，边加边搅拌，使含醇量达60%，静置24h，滤过，上清液回收乙醇，转移至100ml量瓶中，加纯化水至刻度，备用。壳聚糖沉淀法：取提取浓缩液200ml(PH5.20)，滴加0.3mol/ml的盐酸溶液调节PH为5.00，置于60C水浴锅中保温，加入20%(V/V)的1%壳聚糖醋酸溶液，匀速搅拌10min，取出，静置24h，滤过，其他步骤同离心沉淀法制备。果汁101沉淀法：取提取浓缩液200ml，加入10%(V/V)的5%果汁101水溶液，匀速搅拌10min，取出，静置24h，滤过，其他步骤同离心沉淀法制备方法。ZTC1+1沉淀法：取提取浓缩液200mL，加入3%（V/V）的ZTC1+1B组分溶液，60℃水浴条件下搅拌10min，保温20min，然后加入1.5%（V/V）的ZTC1+1A组分溶液，60℃水浴条件下搅拌10min，保温20min，取出，静置24h，滤过，其他步骤同离心沉淀法制备方法。指标成分的选择该处方可以用有效成分橙皮苷、芍药苷在纯化前后量的改变为指标，根据处方中有效成分及杂质的理化性质，合理选择分离与纯化的方法。对于复方制剂而言，大多数情况下，其所含有效成分不够明确，采用化学成分量的改变作为纯化工艺的选择指标有一定困难，此时，灵敏、特异的药效指标是比较好的选择。药效指标的选择需要注意，所选指标应与所研究对象的适应症、功能主治相适应。在没有合适的药效学指标，而复方中某一有效成分明确并可以定量测定时，也可用该成分量的改变为指标。中药纯化工艺考察指标的选择，应以充分考察该方法对新药的安全性、有效性的影响为目的，具体考察指标应视具体情况确定。有时需要采用药效指标与有效成分指标相结合的方法，有时则需要采用多种有效成分为考察指标。该处方的君药为赤芍和陈皮，选取君药主要化学成分含量的变化为评价指标。由于中药复方的疗效是多种成分共同作用的结果，采用单一成分作为指标不能全面控制复方的内在质量，因此，根据方中所含成分理化性质，结合君臣佐使，经过反复摸索，最终以赤芍、陈皮的主要成分芍药苷、橙皮苷为指标性成分，采用HPLC对2种成分含量进行同时测定，为评价纯化提供依据。采用综合加权评分法将各指标转换为综合评分值，其中芍药苷，橙皮苷加权系数均为0.4，固形物含量加权系数为0.2 计算。澄清剂筛选结果澄清剂筛选结果为ZTC1+1为最佳澄清剂表8澄清剂筛选结果编号芍药苷加权评分橙皮苷加权评分固形物加权评分加权评分未纯化对照溶液100.00100.0050.98-离心沉淀法75.4972.6738.6372.29乙醇沉淀法94.7168.5425.4172.59壳聚糖澄清法101.8969.8331.9978.36果汁101澄法107.6181.2141.1988.65ZTC1+1澄法114.1877.7139.3088.95正交试验方案与结果正交试验根据单因素试验结果，以澄清剂加入量、要液浓度、温度为考察因素，各选取最佳的3水平，设计L9(34)正交试验。研究药液浓度、澄清剂加入量、水浴温度对使用ZTC1+1澄清剂澄清法纯化中风复元合剂提取液的工艺的影响。影响因素和水平见表10，试验方案设计与结果见表11，方差分析见表12。表10L9(34)正交试验因素水平水平A药液浓度BZTC1+1用量C水浴温度1230.5g/mL1.0g/mL1.5g/mL1.5%4.5%7.5%40℃60℃80℃表11正交试验方案与结果试验号因素固形物得率（%）芍药苷相对保留率（%）橙皮苷相对保留率（%）加权综合评分（Z）ABCD1111110.9663.5933.6536.312122211.7171.8838.3340.723133312.1571.3837.9740.734212321.78117.7081.7975.805223121.34123.9884.3278.096231221.85116.0478.7274.237313229.52154.78101.2097.778321330.83158.71102.21100.009332129.26148.0895.7393.76K1117.76209.88210.54208.16K2228.13218.81210.29212.72K3291.53208.73216.59216.54R173.7710.086.308.38表12方差分析结果变异来源离差平方和自由度方差FPABC误差5155.4720.298.4911.7322222577.7410.154.255.86439.571.730.72＜0.01＞0.1＞0.1注：F0.1(2,2)=9.00;F0.01(2,2)=99.00由直观分析可知，影响纯化效果的因素顺序为A>B>C,最佳纯化组合为A3B2C1方差分析结果表明,药液浓度对试验的结果有显著影响（P＜0.01），,而ZTC1+1澄清剂的用量和水浴温度对试验结果无显著影响。根据上述实验结果以及实际情况确定最优的纯化工艺为A3B2C1，即药液浓度为1.5g/mL，水与温度为40℃，ZTC1+1浓度为4.5%。验证试验由正交实验结果得出的最优纯化工艺条件，按照“3.3”项下的方法，平行3次求出芍药苷含量橙皮苷含量以及固形物含量计算加权评分，结果如表表11固形物含量编号芍药苷含量(μg/mL)橙皮苷含量(μg/mL)固形物含量加权评分平均值RSD1-13432.87591064.405426.7724%97.3706498.470.84%1-23462.03871069.341126.9598%98.020641-33481.84981073.839426.9666%98.414872-13474.60651111.652526.6232%99.440032-23412.70331087.932726.7675%97.982092-33485.18351112.705726.6208%99.597563-13470.83281106.440827.2201%99.647763-23413.98741087.753626.1623%97.545713-33415.54251086.295127.0533%98.16574由试验结果可知，验证试验的综合评分与正交试验最大值相近，且RSD值为0.84%，说明该工艺条件合理、稳定可行。因此，确定最佳纯化方法为乙醇沉淀法，工艺条件为：药液浓度为1.5g/mL，水与温度为40℃，ZTC1+1浓度为4.5%讨论陈皮的主要功能包括理气健脾、燥湿化痰。主要化学成分是挥发油、类黄酮、多糖、生物碱和其他生理活性物质，是处方中的君药之一，其主要活性成分为橙皮苷。赤芍含有多种化学成分REF_Ref535414993\r\h[6]REF_Ref535414983\r\h[7]，主要包括芍药苷、萜烯、类黄酮及挥发油，主要功能为清热凉血、化瘀止痛REF_Ref535414938\r\h[5]，也是方君药之一，其主要活性成分为芍药苷本研究比较了离心法、乙醇沉淀法以及澄清剂对水提液的纯化效果，结果离心处理及醇沉法的综合评分较低，提示药效成分可能损失较大。而ZTC1+1所得药液中芍药苷和橙皮苷的保留率相对较高、并且除杂率高、工艺简单、条件易控、稳定可行。本研究结果提示，中药制剂组成复杂，成分各异，不同的纯化方法对不同药物有效成分的影响不同，纯化技术在中药精制纯化过程中不能盲目使用，应针对具体组方药物在试验的基础上选择纯化方法、确定纯化工艺参数并拟定实施方案。结论本研究比较了离心法、乙醇沉淀法以及澄清剂对水提液的纯化效果，通过正交试验选出最优纯化工艺为确定最佳纯化方法为乙醇沉淀法，工艺条件为：药液浓度为1.5g/mL，水与温度为40℃，ZTC1+1浓度为4.5%。研究中仅考察了纯化处理对处方中芍药苷及橙皮苷保留率以及固形物含量的影响，对其他药效成分的影响尚需进一步研究；同时各纯化工艺还需深入开展药效学实验验证，进而探讨不同纯化工艺对药物药效的影响。参考文献：胡志强教授治疗中风后遗症用药经验总结[D].山东中医药大学,2013:104．黄河.穴位注射在中风后遗症的运用体会[J].保健医学研究与实践,2013,10(4):39-40.杨勤军,罗梦曦,李佩佩.中风后遗症中医分型及治疗研究进展[J].江西中医药大学学报,2016,28(1):113-117.李晓芳,张健康,王慧鸾,等.陈皮的研究进展[J].江西中医药,2014(3):76-78.国家药典委员会,中华人民共和国药典(第一部)[s].北京:中国医药科技出版社,2015.杨昌林.赤芍商品药材调查及品质评价研究[D].成都:成都中医药大学,2010.王云涛,王莉梅,金向群.赤芍的高效液相指纹图谱及液-质联用分析[J].中成药,2010,32(7):1089-1092.陆小华,马骁,王建,等.赤芍的化学成分和药理作用研究进展[J].中草药，2015，46(4):595-602.张蔷,高文远,满淑丽.黄芪中有效成分药理活性的研究进展[J].中国中药杂志,2012,37(21):3203-3207.YFWang,XFYang,BCheng,etal.ProtectiveeffectofAstragaluspolysaccharidesonATPbindingcassettetransporterA1inTHP-1derivedfoamcellsexposedtotumornecrosisfactor-al-pha[J].PhytotherRes,2010,24(3):393.XQMao,FYu,NWang,eral.Ouyang,hypoglycemiceffectofpolysaccharideenrichedextractofAstragalusmembranaceusindi-etinducedinsulinresistantC57BL/6Jmiceanditspotentialmechanism[J].Phytomedicine,2009,16(5):416.XHuang,DWang,YHu,etal.Effectofsulfatedastragaluspolysaccharideoncellularinfectivityofinfectiousbursaldiseasevirus[J].IntJBiolMacromol,2008,42(2):166.SLi,YZhang,JZhao.PreparationandsuppressiveeffectofAs-tragaluspolysaccharideinglomerulonephritisrats[J].IntImmu-nopharmacol,2007,7(1):23.HZhang,NPan,SXiong,etal.Inhibitionofpolyglutamine-me-diatedproteotoxicitybyAstragalusmembranaceuspolysaccharidethroughtheDAF-16/FOXOtranscriptionfactorincaenorhabditiselegans[J].BiochemJ,2012，441(1):417.黄兆胜.中药学[M].北京:人民卫生出版社,2002.许筱凰,李婷,王一涛,等.桃仁的研究进展[J].中草药,2015,46(17):2649-2655.马东.中药莱菔子的化学成分及药理作用研究进展[J].中国社区医师,2014(20):5-6.中国药科大学.中药辞海(第2卷)[M].北京:中国医药科技出版杜,1996:1924.宋爱英,施波,自刚.莱菔子对麻醉犬心脏血液动力学的作用研究[J].中医药学报,1990,(1):48.李炳根,李铁云,张国侠,等.莱菔子水溶性生物碱逆转SHR心血管重构的实验研究[J].长春中医药大学学报,2007,26(3):8.梁兴伦,袁爱梅,朱敏洁.黄连、水蛭、莱菔子对高血压胰岛素抵抗模型大鼠肝细胞膜胰岛素受体的影响[J].中国老年保健医学,2006,4(3):21.ZhangY,TalalayP,ChoCG,eta1.Amajorinducerofanticarcinogenicprotectiveenzymesfrombroc-coli;isolationandelucidationofstructure[J].ProcNatlAcadSciUSA,1992,89:2399.谭鹏,薛玲,吕文海.莱菔子不同炮制品对呼吸系统作用的实验研究[J].山东中医杂志,2005,24(5):300.刘继林,钟荞,张世波.莱菔子降气化痰的实验研究[J].成都中医学院学报,1990,13(2):29-30.张巍峨,梁文波,张学梅,等.莱菔子提取物镇咳祛痰平喘作用研究[J].大连大学学报,2002,23(4):93-95.郭奕文