肿瘤转移专题知识讲座培训课件

第一部分

肿瘤的生长方式和生长速度一、肿瘤的生长方式

大多数良性肿瘤呈膨胀性生长。常有纤维性包膜，容易手术切除，切除后不复发。但血管瘤是一个例外，不呈膨胀性生长，而呈浸润性生长。1.膨胀性生长(Expansivegrowth)：

恶性肿瘤常呈浸润性生长。肿瘤无包膜形成，境界不清。局部切除后，常有肿瘤残留，容易复发。浸润是恶性肿瘤的标志之一。2.浸润性生长(Infiltrativegrowth)

良性肿瘤、恶性肿瘤都可以有这种生长方式。良性肿瘤基底部无浸润，而恶性肿瘤则伴有基底浸润。3.外生性生长(Exophyticgrowth)：二、肿瘤的生长速度肿瘤的生长速度主要取决于：1、肿瘤的分化成熟程度 一般说，良性肿瘤分化好，生长缓慢；而恶性肿瘤分化差，生长较快。2、倍增时间： 即肿瘤细胞增加一倍所需要的时间3、生长分数（增殖指数）： 即处于增殖状态（S、G2、M）的细胞比例 生长最旺盛的肿瘤增殖指数也仅有20%左右。4、肿瘤细胞的生成与丢失 增多=生成-丢失 丢失：凋亡、坏死5、血管生成（Angiogenesis)肿瘤生长的关键因素血管形成的机制：肿瘤细胞产生血管生成因子vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)basicfibroblastgrowthfactor(bFGF)肿瘤/间质产生血管生成抑制因子 血管生成生成抑制恶性肿瘤由于生长快，但血管形成慢，造成供血不足，常易发生坏死、溃疡、出血等继发性改变。第二部分肿瘤的扩散良性肿瘤仅在原发部位生长扩大，而具有浸润性生长的恶性肿瘤，不仅可以在原发部位继续生长、蔓延(直接蔓延)，而且还可以通过各种途径扩散到身体其他部位(转移)。一、直接蔓延肿瘤沿组织间隙、淋巴管、血管、神经束向邻近组织和器官侵袭蔓延。二、转移(Metastasis)肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，被带到其他部位继续生长，并形成与原发部位肿瘤组织学类型相同的肿瘤，这个过程叫转移。原发部位的肿瘤叫原发瘤，所形成的新肿瘤叫继发瘤或转移瘤。转移是恶性肿瘤最本质的表现。良性肿瘤不转移，只有恶性肿瘤才发生转移。恶性肿瘤中，只有少数肿瘤不发生或很少发生转移，如皮肤的基底细胞癌、脑的恶性胶质细胞瘤。应当指出，浸润是转移的基础。1.淋巴道转移：淋巴道转移是癌转移的重要途径，少数肉瘤如滑膜肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤也可发生淋巴道转移。淋巴道转移与淋巴引流的方向相同，但少数情况下也可发生跳跃转移或逆行转移。瘤细胞侵入淋巴管，随淋巴液进入局部淋巴结，先聚集在边缘窦，逐渐累及破坏整个淋巴结，并可进一步转移到下一站引流淋巴结，最终经胸导管进入体循环。受累的淋巴结肿大、变硬、互相粘连成团，切面灰白而干燥。2.血道转移：血道转移是肉瘤转移的重要途径，少数癌如肾细胞癌、肝细胞癌、肺癌以及其它癌的晚期也发生血道转移。肝、肺是两个血道转移的靶器官。肿瘤侵入血管，随血流运行，到达远隔器官。肿瘤栓子进入门静脉引起肝转移；进入体静脉引起肺转移；进入肺静脉引起全身性转移；进入胸、腰、盆腔静脉，可通过吻合支，进入脊椎静脉丛引起脊椎、脑转移。3.种植性转移：体腔内器官的肿瘤累及到器官的表面时，瘤细胞可脱落并种植到体腔各器官的表面，形成种植性转移瘤。腹腔、胸腔最常受累，心包腔、蛛网膜下腔亦可受累。常在浆膜面形成多数转移结节，很少侵入器官的深层，并常伴血性积液，积液内可查到肿瘤细胞。4.接触转移：非常罕见。如下唇肿瘤转移到上唇的接触部位。（二）浸润转移的机制1、浸润的机制1）肿瘤细胞解离(Detachment)：细胞间连接分子E-cadherin表达下降2）肿瘤细胞附着(Attachment)于基底膜:细胞表面的整合素（Integrin)的量和分布改变:laminin受体,fibronectin受体3）消化基底膜和细胞外基质（ExtracellularMatrix):肿瘤/间质细胞分泌酶：IV型胶原酶（金属蛋白酶，Metalloproteinase[MP]）等消化基底膜、间质的胶原、糖蛋白、蛋白多糖4）肿瘤细胞移动（Migration):阿米巴运动：自主、趋化2、转移的机制浸润是转移的基础转移过程： 1）穿过基底膜： 细胞解离、消化、移动 2）穿过细胞外基质：消化、移动 3）穿过血管壁：消化、移动4）入血循环： 大部分被清除、血小板粘附、瘤栓5）附着血管壁/栓塞6）穿过血管壁：消化、移动7）血管生成：转移瘤形成3、抑制浸润可抑制转移增加E-cadherin的表达金属蛋白酶(MP)抑制因子：

TissueInhibitorofMetalloproteinase(TIMP)消化抑制4、抑制血管生成也可以抑制转移

因为血管生成是转移瘤形成和生长的关键因素之一第三部分肿瘤的分级与分期一、肿瘤的分级

恶性肿瘤的分级是根据其分化程度的高低来确定恶性程度的级别。比较广泛使用的是三级分法，即将恶性肿瘤分为高分化、中分化、低分化三级。这种分级对于决定治疗方案和判定预后有一定意义。分化、异型性、间变、浸润/转移能力

分化 异型性 间变 浸润/转移良性肿瘤 高 小 无 无恶性肿瘤 较差 明显 可有 有

高： 较小者 无 较低 中： 中等 可有 中等 低： 大 可有 高二、肿瘤的分期较为常用的是TNM分期。T：Tumor，表示肿瘤，根据一个特定肿瘤的体积，分为四级，分别用T1、T2、T3、T4表示，肿瘤越大，级别越高。N：LymphNode，表示淋巴结转移的情况。M：Metastasis，表示有无远隔转移。

Mo、M1、M2No：没有淋巴结转移。N1：只有少数淋巴结转移。N2：很多淋巴结转移。第四部分肿瘤的微转移一、前言肿瘤治疗失败的主要原因——不能早期发现和控制微转移。实体恶性肿瘤来说，血转移是最严重和最常见的。外周血肿瘤微转移的检测对于肿瘤患者治疗方案的选择具有重要意义。肿瘤细胞的富集可大大提高流式细胞术、RT-PCR、免疫组织化学和端粒酶活性分析等的灵敏度和特异度。血液循环中肿瘤细胞的检测有2个问题需要解决：①寻找特异性高的肿瘤标志物；②建立灵敏度高的实验方法。2肿瘤细胞血行转移的原理3外周血中检测微量肿瘤细胞面临的难题一是肿瘤特异性的生物标记二是高灵敏度的实验方法4免疫磁珠技术免疫磁珠（Immunomagneticbeads,IMB）是包被有单克隆抗体的磁性微粒。分离富集——骨髓细胞、血液细胞、肿瘤细胞核酸细菌有2种形式：1）阳性筛选：IMB与与被选物质结合2）阴性筛选抗CD-45免疫磁珠阴性去除白细胞Ber-EP4免疫磁珠阳性富集上皮性癌细胞LS174T用RT-PCR技术检测肿瘤细胞逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）——

优点：敏感性高、特异性强的使检测外周血中的少量癌细胞成为可能。理论依据：血浆中含有大量的RNA酶，一旦血浆中出现RNA立即会被水解掉，血浆中就不可能有游离的mRNA，通过RT-PCR检测到的mRNA必然是来自外周血中完整的循环细胞。单独使用RT-PCR检测外周血肿瘤细胞的方法具有一定的假阳性率。如：以CK19基因作为上皮性肿瘤标志物的假阳性率高达50%。免疫磁珠

RT-PCR灵敏度

、特异度

解链温度测定二、材料与方法研究对象：胃癌41例，良性胃病10例，5例对照。参照模型的建立：胃癌MGC-803细胞10倍稀释，加入至4ml健康人血液中。单核细胞的分离实验方法分类：①A方法（对照）：非免疫磁珠法。②B方法：阴性免疫磁珠筛选法。CD45免疫磁珠（宁波新芝生物科技股份有限公司生产）③C方法：阳性免疫磁珠筛选法。Ber-EP4免疫磁珠（挪威Dynal公司生产）④D方法：联用阴性和阳性免疫磁珠筛选法。免疫磁珠富集后，癌细胞的检测方法——荧光定量RT-PCR检测以下2个基因的mRNA：β2微球蛋白（β2mircoglobulin,β2M）癌胚抗原（carcinoembryonicantigen，CEA）相对CEAmRNA值=Cp(CEA)/Cp(β2M)

Cp:Crossingpoint扩增产物开始对数增加点三、结果胃癌MGC-803细胞加入到健康人血中HE400CD45免疫磁珠与白细胞结合400阳性免疫磁珠与癌细胞结合HE1000CEAmRNA的实时定量RT-PCR检测CEAmRNART-PCR扩增产物的其解曲线分析

2MmRNA的Cp值与细胞数的相关性正常人血中加入MGC-803胃癌细胞后相对CEAmRNA的定量检测结果41例胃癌病例CEAmRNA的检测结果*阳性病例与临床分期的关系*实验结果——免疫磁珠富集结肠癌细胞Ber-Ep4免疫磁珠富集的LS174T细胞(HE×400)

Ficoll分离的外周单核血细胞(HE×400)CD45免疫磁珠阴性筛选的白细胞(HE×200)实验结果——实时定量RT-PCR检测特异性mRNARepresentativeresultsofreal-timeRT-PCRforamplifying

2MmRNA.ThreemethodswereusedtosortcancercellsfromthehealthybloodspikedwithcoloncancerLS174TcellsfollowedbyquantitativeRT-PCR.Theirconcentrationsare1000cells/mlblood.negativeimmunobeadmethod;positiveimmunobeadmethod;negative-and-positiveimmunobeadmethod;(control)noRNAResultsofamplifyingCK20mRNAinrecoveryexperiment.(A)Firstly,differentconcentrationsofLS174Tcoloncancercellswerespikedintohealthyblood.Then,negativeandpositiveimmunomagneticbeadsweresuccessivelyusedtoenrichcancercells.Finally,theCK20mRNAwasdetectedbyreal-timequantitativeRT-PCR.(a)10000/ml;(b)1000/ml;(c)100/ml;(d)10/ml;(e)1/ml;(control)unspikedblood.(B)StandardcurveplotofthelogofLS174Tcellsversusthecyclenumberofcrossingpoint.

RepresentativeresultsofamplifyingCK20mRNAinperipheralbloodfrompatientswithcolorectalcancers.(a)positivecontrol:1000/mlofLS174Tcoloncancercellsspikedintohealthyblood;(b)and(c)colorectalcancerpatients;(control)noRNAwasaddedintotheRT-PCRreactionsolution.

Table1ThepositivedetectionratesofCK20mRNAinperipheralbloodfrompatientswithcolorectalcarcinomaFactorsPatients(n)Positivedetection(n)Percentage(%)Diameter≥5cm 24 23 95.8*<5cm16 6 37.5DifferentiationHigh 14 10 71.4Middle 15 11 73.3Low 11 8 72.3LymphaticmetastasisPositive 23 21 91.3**Negative17 8 47.1HepaticmetastasisPositive14 14 100.0**Negative26 15 57.7*P<0.01(vs<5cmgroup);**P<0.05(vsNegativegroup),

2analysisTable2TherelationshipofpositiveCK20mRNAdetectioninperipheralbloodandclinicopathologicalfactorsinpatientswithcolorectalcarcinomas.HepG2三组预实验结果患者血样的收集

(2003.9-2004.12)代表性病人的RT-PCR扩增图谱阳性对照HepG2(1);HCC(2,3);LC(4,5);CHA(6,7);正常对照(8,9);阴性对照(10);M为DNA标准(GeneRuler100bpDNALadder)。不同肝病患者和健康人外周血中AFPmRNA的扩增值

HCC207±276,LC30±34hepatitis13±18,normal3±5HCCvsLC:P=0.0137;HCCvs.Hepatitis:P=0.0027;LCvsHepatitis:P=0.0673;HCCvs.Normal:P=0.0028;LCvsNormal:P=0.0025;HepatitisvsNormalP=0.0284肝病患者的不同疾病期相对应的AFPmRNA的阳性率肝病患者血清AFP值与AFPmRNA及阳性率的关系HCC患者中血清AFP与AFPmRNA的关系外周血中AFPmRNA与几个反应肝功能的临床指标之间的联系四、讨论RT-PCR方法是目前用于检测外周血肿瘤细胞的常用分子生物方法当循环血中标志mRNA的拷贝数较少或者血液细胞有相应基因的低水平表达时，可出现假阳性或假阴性CEA也可低水平表达于血细胞和淋巴结。以CEAmRNA作为标志分子对外周血非造血系统肿瘤细胞进行检测时，有必要先去除血细胞。使用免疫磁珠筛选外周血存在的非造血系统恶性肿瘤细胞的策略有2种：1阴性筛选2阳性筛选CD45抗原表达于除了红细胞和血小板及其前体细胞外的所有造血源细胞。CD45免疫磁珠可去除CD45

细胞，用于富集外周血、骨髓和淋巴结中的非造血系统肿瘤细胞。国外报道：用这种阴性筛选方法可使非造血系统肿瘤细胞浓缩9倍。免疫磁珠分选技术外周血白细