DB15∕T 2044-2020 农杆菌介导甜菜遗传转化技术规程

ICS65.020.20

CCSB05

DB15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T2044—2020

农杆菌介导甜菜遗传转化技术规程

TechnicalcodeofpracticeforAgrobacterium-mediatedSugarbeetGenetic

Transformation

2020-12-24发布2020-01-24实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2044—2020

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。

本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会(SAM/TC20)归口。

本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。

本文件主要起草人：张自强、白晨、李晓东、张惠忠、王良、韩平安、张必周、付增娟、赵尚敏、

鄂圆圆、郑文哲、张辉。

I

DB15/T2044—2020

农杆菌介导甜菜遗传转化技术规程

1范围

本文件确立了培养基、灭菌、无菌苗培养、侵染液制备与叶片-叶柄预培养、遗传转化、生根培养、

移栽和目的基因检测等技术要求。

本文件适用于农杆菌介导甜菜遗传转化技术操作的全过程。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语与定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

种球bulb

甜菜的果实。

3.2

植物遗传转化plantgenetictransformation

将外源基因转移到植物体内并稳定整合、表达和遗传，从而使受体植物体现转移基因的特征的过程。

3.3

农杆菌侵染infection

农杆菌侵入并感染甜菜外植体的过程。

3.4

叶片-叶柄leaf-petiole

甜菜无菌苗叶片和叶柄相连接的部位，长约1cm。

4培养基

4.1琼脂粉培养基

用于甜菜种球的萌发。成分为（1L）：琼脂粉7.5g，pH=5.8。

1

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4.2诱导分化培养基

用于甜菜无菌苗诱导分化培养和甜菜叶片-叶柄的预培养。成分为（1L）：MS培养基4.74g，蔗糖

30g，NAA（萘乙酸）0.7mg，KT（激动素）1.2mg，琼脂粉7g，pH=5.8。

4.3生根培养基

用于甜菜无菌苗的生根培养。成分为（1L）：MS培养基4.74g，蔗糖30g，NAA1.2mg，琼脂粉

7.5g，草甘膦0.08µM，pH=5.8。

4.4YEP培养基

用于工程农杆菌的增值培养。成分为（1L）：牛肉浸膏5g，酵母提取物10g，氯化钠5g，琼脂

粉15g，rif（利福平）50mg，kan（卡娜霉素）50mg，pH=7.0。

4.5侵染液培养基

用于加入农杆菌菌液配制侵染液。成分为（1L）：MS培养基4.74g，蔗糖30g，NAA0.7mg，

KT1.2mg，AS(乙酰丁香酮)150µM，pH=6.8。

4.6共培养培养基.

用于侵染后甜菜叶片-叶柄与农杆菌的共培养。成分为（1L）：MS培养基4.74g，蔗糖30g，琼脂

粉7.5g，AS150µM，NAA0.7mg，KT1.2mg，pH=5.8。

4.7脱菌培养基

用于共培养后的脱菌。成分为（1L）：MS培养基4.74g，蔗糖30g，琼脂粉7.5g，cef（头孢霉

素）500mg，kan50mg，pH=5.8。

4.8筛选培养基

用于甜菜转化后的筛选培养。成分为（1L）：MS培养基4.74g，蔗糖30g，琼脂粉7.5g，草甘膦

0.08µM，pH=5.8。

5灭菌

5.1灭菌前准备

制备75%酒精、0.1%升汞、无菌水。

5.2种球灭菌

将甜菜种球磨光，用百菌清（烟剂型）密闭熏蒸24h后，在超净工作台中移至灭过菌的三角瓶中，

随后用75%酒精消毒2min，无菌水漂洗3次，接着用0.1%的升汞处理20min，无菌水漂洗3次，最后

将消毒后的种子接种于琼脂粉培养基上，每三角瓶（100ml）25粒。

6无菌苗培养

6.1种球萌发

2

DB15/T2044—2020

将接种后的培养瓶置于组培室，23℃条件下进行培养，7d～10d即可萌发。待芽长2.0cm～2.5cm

左右时，带子叶一起切下，接种到新的继代培养基中。培养环境：温度23℃，光照强度3000Lux，光

照时间14h。培养20d～25d成苗。

6.2诱导分化培养

在超净工作台上，将无菌苗置于无菌培养皿中，用灭菌后的手术刀将无菌苗的叶片-叶柄切下，长

度为0.8cm～1.2cm的小段，随后将叶片-叶柄接种于诱导分化培养基中进行分化诱导培养。培养环境：

温度23℃，光照强度3000Lux，光照时长为14h。培养时间2d～6d。

7侵染液制备与叶片-叶柄预培养

7.1菌液活化

超低温冰箱中取出冷冻含有目的基因的农杆菌EHA105[C58（rifR）TipEHA105（pTiBo542DT-DNA）

（strepR）Succinamopne）]菌液，将菌液在YEP培养平板中划线培养，培养温度28℃，培养时间14h。

7.2制备侵染液

将培养好的农杆菌取单菌落并扩繁，收集扩繁后菌体并放置侵染液培养基中重新悬浮，使其OD600

值在0.30～0.50之间，然后冰浴1h，备用。

8遗传转化

8.1叶片-叶柄预处理

诱导分化培养后的叶片-叶柄，沿其茎走向用手术刀划出伤口，伤口的深度以不切透叶片-叶柄为准。

8.2农杆菌侵染

将预处理后的叶片-叶柄放入侵染液中，使用真空泵抽真空，使叶片-叶柄完全浸入侵染液，侵染20

min～30min。

8.3共培养

从侵染液中取出叶片-叶柄，置于无菌滤纸上吸干表面残留的侵染液，放入共培养培养基中，进行

共培养。培养环境：温度23℃，暗培养。培养时间3d～6d。

8.4脱菌培养

共培养后，将叶片-叶柄放入脱菌培养基中，进行脱菌。培养环境：摇床转速125rpm，温度25℃，

光照强度3000Lux，光照时间14h。脱菌2d～3d。

8.5筛选培养

脱菌培养后，从脱菌培养基中取出叶片-叶柄，放入筛选培养基中，置于培养室培养。培养环境：

温度25℃，光照强度3000Lux，光照时间14h。培养15d～20d，进一步培养成转基因甜菜无菌苗。

9生根培养

3

DB15/T2044—2020

从筛选培养基中取出抗性芽，切成1cm～2cm的单芽，接种到生根培养基中，培养环境：温度25℃，

光照强度3000Lux，光照时间14h。20d～30d即可诱导出新生根。

10移栽

10.1炼苗

去掉封口膜，在组培室锻炼2d～3d。

10.2室内移栽

选择根系生长健壮的组培苗从三角瓶中移出，用自来水浸泡根部12h，洗净根部残留培养基，移栽

到花盆中（育苗土由蛭石和田园土构成，二者比例为1:1），并遮阳，定期浇水，室内培养7d～14d。

10.3大田移栽

待盆栽幼苗生长至4-6片真叶时，平均气温稳定在10℃以上时，选择早上或者傍晚移入大田。

11目的基因检测

11.1PCR扩增检测

在组培苗进行筛选培养期间，提取组培苗基因组DNA，对目的基因进行PCR扩增，扩增结果有目的基

因条带的说明目的基因转入组培苗并成功表达，没有目的基因条带的说明目的基因没有转入组培苗。

11.2