DB34∕T 4198-2022 梨黑斑病菌的LAMP检测方法

ICS01.040.65

CCSB16

34

安徽省地方标准

DB34/T4198—2022

梨黑斑病菌的LAMP检测方法

DetectionofAlternariaspeciesinvolvedinpearblackspotusingLAMP

2022-06-29发布2022-07-29实施

安徽省市场监督管理局发布

DB34/T4198—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提出。

本文件由安徽省农业农村厅归口。

本文件起草单位：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所、巢湖市农机管理中心、安

徽省农业科学院园艺研究所、怀远县农业技术推广中心。

本文件主要起草人：杨雪、谷春艳、潘锐、翟承勋、徐会永、臧昊昱、戚仁德、高正辉、齐永杰、

王同岁。

I

DB34/T4198—2022

梨黑斑病菌的LAMP检测方法

1范围

本文件规定了梨黑斑病菌的LAMP检测方法。

本文件适用于梨黑斑病菌检测的组织和人员。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

梨黑斑病pearblackspot

由链格孢类（Alternariaspp.）真菌引起的一种重要病害，已报道病原菌主要包括Alternaria

gaisenK.Nagan、A.alternata(Fr.)Keissler、A.tenuissima(Fr.)Wiltsh、A.infectoria、

A.yaliinficiensR.G.Roberts和A.ventricosaR.G.Roberts。

4方法原理

根据梨黑斑病病原菌的cytb序列设计的特异性引物进行LAMP（Loop-mediatedisothermal

amplification,环介导等温扩增技术）检测作为判断梨黑斑病菌的依据。

5仪器设备

高速离心机：转速≤15000r/min

涡旋振荡器

恒温金属浴

光照培养箱：20℃～30℃

超低温冰箱：-80℃

电泳仪

凝胶成像仪

可调移液器：1-10μL，10μL-100μL，100μL-1000μL

6试剂和培养基

1

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培养基

WA培养基（琼脂粉20g，加水1000mL），PDA培养基（去皮马铃薯200g，蔗糖（或葡萄糖）

20g，琼脂粉20g，加水补足至1000mL）。

DNA提取试剂

2％CTAB提取液（100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，2％(w/v)

CTAB，40mmol/L巯基乙醇（用时加入）），无水乙醇，10％SDS，酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，氯仿，

异丙醇，TE（10mmol/LTris-HCL(pH8.0)，1mmol/LEDTA）。

LAMP检测试剂

BstDNA聚合酶，甜菜碱（Betaine），显色剂SYBRGreenI，TAE电泳缓冲液(Tris4.84g，

Na2EDTA·2H200.75g，冰乙酸1.142mL，加水至1000mL，pH8.5)，琼脂糖。

除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682中三级水的标准。

7检测方法

病原菌分离与纯化

将梨病果用75％乙醇表面消毒30s后，于病健交界处取少量组织置于WA培养基中28℃培养。

待长出菌丝后，切取一小块放在PDA培养基中于培养7d左右，收集菌丝于4℃备用。

供试DNA提取

7.2.1CTAB法：取少量菌丝粉，加入900μL2％CTAB提取液和90μL10％SDS，涡旋混匀，于60℃

水浴1h，期间每隔10min上下颠倒几次。常温条件下12000rpm离心10min；取上清，加入等体

积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，常温条件下12000rpm离心5min；将上清转移至新的

EP管中，加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，常温条件下12000rpm离心5min；上清转移至新EP管

中，加入1倍于上清体积的异丙醇，-20℃条件沉淀15min；常温条件下12000rpm离心5min，倾

去上清，沉淀用70％乙醇洗涤2次，37℃条件下待乙醇挥发干；加适量灭菌超纯水或者TE（pH8.0）

溶解沉淀（含20μg/mlRNase），37℃消解30min后电泳检测，-20℃保存备用。

7.2.2试剂盒法：采用市售真菌DNA提取试剂盒，按照相应操作说明书提取DNA备用。

所用引物

所用引物设计参见附录A.1。

F3：5’-GGCTCCTTTGAATGGTAAC-3’；

B3：5’-TGTCTTCAACCAAGCATCA-3’；

FIP：5’-CGCTGCAAGTAATCTATAAATCGGATTCAATAGGCAAATGGGGA-3’；

BIP：5’-AATGGATCAAGAACGTTCAACGAATTGGTTGTGGGGTACTC-3’。

检测体系

LAMP扩增反应体系总体积为20μL，由下列浓度体积的组分组成：

名称浓度加入量

F310μM0.6μL

B310μM0.6μL

2

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FIP40μM0.6μL

BIP40μM0.6μL

MgCl225mM3.2μL

Betaine4M1.6μL

dNTPs10mM2.0μL

BstDNA聚合酶8U/μL0.8μL

10×ThermoPol2.5μL

DNA模板40ng/μL1μL

用无菌双蒸水补充扩增体系体积至20μL，65℃保温60min。

8结果判定

LAMP扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果：

a)向扩增产物中加入显色剂SYBRGreenI，轻晃混匀，观察颜色变化；如果LAMP扩增产物显示

黄绿色，表明含有梨黑斑病菌；如果扩增产物为橙红色，表明不含有梨黑斑病菌（参见附录

A.2）。

b)取扩增产物在3％琼脂糖凝胶电泳中低压电泳，观察扩增条带；如果电泳图谱为梯状条带，表

明含有梨黑斑病菌；如果电泳图谱无扩增条带，表明不含有梨黑斑病菌（参见附录A.3）。

3

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附录A

（资料性）

实验结果参考图

A.1引物设计示意图

见图A.1。

图A.1

A.2LAMP产物凝胶电泳图

见图A.2。

标引序号说明：

M：2000bp；

泳道1、2、6：表示含有链格孢菌；

泳道3、4、5：表示不含链格孢；

N：阴性对照。

图A.2

4

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A.3LAMP产物显色图

见图A.3。