DB15∕T 3359-2024 绵羊体外胚胎生产技术规程

ICS65.020.30

CCSB44

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T3359—2024

绵羊体外胚胎生产技术规程

Technicalcodeoninvitroembryoproductioninsheep

2024-02-23发布2024-03-23实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T3359—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。

本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古赛诺种羊科技有限公司。

本文件主要起草人：张家新、陈大勇、程磊、张楠、仇春娟、宋宇琨、范利宏、包梅荣、龚璐、朱

怡静。

I

DB15/T3359—2024

绵羊体外胚胎生产技术规程

1范围

本文件规定了绵羊体外胚胎生产过程中的卵母细胞体外成熟、体外受精和早期胚胎体外培养等内

容。

本文件适用于绵羊体外胚胎生产程序。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

NY/T1571羊胚胎移植技术规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

体外成熟invitromaturation（IVM）

卵母细胞在体外恢复减数分裂并发育到第二次减数分裂中期（MII）这一过程，经历细胞核成熟和

细胞质成熟。

体外受精invitrofertilization（IVF）

哺乳动物的精子和卵子置于适宜的培养条件下使之完成受精的一种技术。

体外培养invitroculture（IVC）

将受精卵置于适宜的培养条件下使其发育至囊胚期。

4体外胚胎生产培养液配制

采卵液、体外成熟培养液（IVM液）、受精液（IVF液）和胚胎发育液（IVC液）配方见附录A。

5操作前准备

1

DB15/T3359—2024

打开实验室和超净工作台紫外灯，照射20min后用酒精擦拭消毒；关闭实验室紫外灯30min

后，操作人员将双手清洗干净后，穿戴工作服、口罩、手套、帽子等，更换拖鞋进入实验室，并随手

关闭实验室门；用75%酒精喷洒消毒双手；实验室工作台、显微镜以及加热台面用酒精擦拭消毒，并

且将加热台打开预热。

6卵母细胞体外成熟

准备工作

6.1.1拣卵针

用酒精灯将采卵用玻璃管拉制成口径适宜的捡卵针，管口在火焰上烧圆钝。

6.1.2制作成熟液滴

实验开始前使用35mm培养皿制作卵母细胞成熟液滴（100µL成熟液滴，覆盖3.5mL矿物油），

并放入5%二氧化碳培养箱内平衡2h以上。

检卵

采卵液于37℃恒温板上提前预热。将含有卵母细胞的采卵液置入60mm的培养皿。在体式显微

镜下从左到右、从上到下的顺序仔细挑选，将捡出的卵母细胞放置于盛有采卵液的35mm培养皿中，

用成熟液洗涤3次。

7体外成熟

将洗涤好的卵母细胞按15枚/100µL～20枚/100µL液滴的密度，移入成熟液滴中，后放入二氧

化碳培养箱培养22h～24h。培养条件：5%CO2、95%空气、38.6℃、饱和湿度。

8卵母细胞体外受精

准备工作

体外受精实验开始前，在5%二氧化碳培养箱内，平衡受精液（IVF液）2h～3h；38.6℃预热

0.2%的透明质酸酶工作液。

体外受精

8.2.1精液选择

选择体外受精效果好的精液，并根据体外成熟卵母细胞的数量计算所需的精液量。

8.2.2精液解冻

如使用冷冻精液，将所需精液置于37℃～40℃水浴解冻。

8.2.3精液检查

取约3µL精液置于载玻片上，盖上盖玻片后，显微镜下检查精子活力和密度。

2

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8.2.4精子上游

将试管架置于37℃加热台上，移液枪吸取约100µL精液，缓慢注入装有500µL受精液的试管

底部，后置于38.6℃、5%CO2培养箱内上游30min。

卵母细胞处理

将体外成熟培养22h～24h的卵母细胞取出，观察卵母细胞成熟情况，记录卵丘细胞扩展情况；

用移卵针将全部卵母细胞移入预热的0.2%透明质酸酶液滴中，轻吹直至剩余2～3层卵丘细胞，使用

受精液洗涤3次。将洗涤后的卵母细胞按50枚/500µL～60枚/500µL受精液（四孔板）或15枚

/100µ～20枚/100µL受精液的密度移入受精液中。

体外受精

将上游30min后的精液从培养箱中取出，用移液枪沿试管壁从每管上游液中吸取200µL～300

µL上清液加入提前预热好的离心管中，1500r/min离心4min后弃掉上清液，剩余约30µL～50µL

精子沉淀液，轻轻混匀。用移液枪吸取精子沉淀液，倾斜枪头从边缘插入受精液滴或孔，对准卵母细

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胞后吹出精液，精液浓度调整至110个/mL～110个/mL，后置于38.6℃、5%CO2培养箱内孵育20

h。

9体外培养

预先将绵羊胚胎体外发育液（IVC液）在38.6℃、5%CO2培养箱中平衡2h以上。将体外受精

20h后的胚胎取出置于IVC液内，移液枪轻吹以去除黏附的精子及全部卵丘细胞，使用IVC液洗涤3

次并对受精卵进行选择（淘汰胞质不均匀、胞质发黑及死卵），之后按50枚/500µL～60枚/500µL

IVC液（四孔板）或15枚/100µL～20枚/100µLIVC液的密度移入IVC液中培养。培养条件为：90%

N2、5%O2、5%CO2、38.6℃、饱和湿度。

胚胎发育鉴定

受精后第48h统计卵裂率（卵裂的个数/总卵母细胞数）；受精后第168h统计囊胚率（囊胚的

个数/卵裂的个数）。发育至囊胚阶段的胚胎用于冷冻保存或胚胎移植。

10记录

记录抽卵时间、供体羊耳号、品种、卵泡数、回收卵总数、可用卵数（根据卵丘卵母细胞复合体形

态，将其分为A、B、C级）、退化卵数（胞质不均匀、卵丘扩散严重、裸卵数）；记录卵母细胞成熟时

间、培养的卵母细胞数量、卵丘扩展情况、卵裂率、囊胚率。

3

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A

A

附录A

（资料性）

体外胚胎生产培养液配制

A.1卵母细胞体外成熟液配制

-7

0.02IU/mLFSH、0.02IU/mLLH、1µg/mLE2、0.1mmol/L半胱胺、10mol/L褪黑素、10%FB

S、0.1ml青链霉素合剂，使用TCM-199培养基定容至10mL，混匀后用Millipore0.22µm的过滤器过

滤，在0℃～5℃条件下可保存2周。

A.2采卵液配制

0.05gBSA、0.035g肝素钠、0.5mL青链霉素合剂，使用PBS定容至50mL，混匀后用Millipore

0.22µm的过滤器过滤，在0℃～5℃条件下可保存2周。

A.3SOF液配制

3.1452gNaCl、0.2675gKCl、0.0814gKH2PO4、0.0442gMgSO4、0.2655g丙酮酸钠、1.3115

gCaCl2、0.0251g肌醇、0.0074g谷氨酰胺、300µL乳酸钠、0.5mL青链霉素合剂、1%酚红，使用胚

胎水定容至50mL，混匀后用Millipore0.22µm的过滤器过滤，在0℃～5℃条件下可保存2周。

A.4受精液(IVF液)配制

1mL发情羊血清、6IU/ml肝素钠,使用SOF液定容至50mL，混匀后用Millipore0.22µm的过滤