疫苗专题知识讲座培训课件

疫苗疫苗简介疫苗的作用疫苗种类疫苗标准不同种类疫苗的特点疫苗简介疫苗的最初概念追溯到罗马时代，Primo认为疯狗的肝可以具有防治狂犬病的功能。人们用天花的干痂来预防天花。直到1796年爱德化.杰纳大夫在实验室中，用一种比较温和的奶牛的疾病牛痘感染人类，发现牛痘感染过的人不会再为天花所感染，从而获得了第一次真正意义上的疫苗。天花是一种致死率很高的烈性疾病，即使幸存下来，也经常产生永久性的毁容、神志错乱、失眠等后遗症。杰纳医生把牛痘脓疮中得到的渗出液注射到8岁的男孩身上，经过3次注射，这个男孩对天花有了完全的抵抗力。终于发现了疫苗的基本原则。疫苗19世纪研制了狂犬病疫苗白喉疫苗破伤风疫苗20世纪疫苗得到了广泛的应用。疫苗是医学上最潜力的用于疾病预防和治疗的防御物质,它可以使其接受者在体内建立起对入侵物质感染的免疫抗性，诱导接受者在体内产生其与诱导物发生反应的抗体并诱发产生专一性的免疫反应,从而保护接受者免受疾病的侵染。疫苗的作用注射疫苗可以激活免疫系统，使接受者诱导产生致病物质的抗体。人类免疫系统分为体液免疫和细胞免疫。体液免疫体液免疫是由血液和体液中的B淋巴细胞产生形成抗体,与抗原专一性结合使其失活而表现出的免疫能力,主要存在于体液中。细胞免疫细胞免疫是指主要由各种淋巴细胞来执行的免疫功能。分类:MHCⅠ型MHCⅡ型MHCⅠMHCⅠ是指抗原经过一系列复杂的传递过程有MHCⅠ型分子（主要是组织相容性抗原I型）加工后，产生一些传递信号的小肽激活CD8T细胞，而CD8T细胞可以通过释放水解酶和其他化合物把受病原物质感染或变异的细胞杀死。MHCⅡMHCⅡ型是指外源抗原通过细胞内吞噬，经过MHCⅡ型分子（主要组织相容性抗原II型）加工后，激活CD4T细胞。激活的CD4T细胞可辅助激活抗原专一性的B细胞，它能产生杀伤性T细胞，并进一步激活更多种类的T细胞，从而杀死外来病原物。免疫机制MHCⅡMHCⅠMHCⅡ水解酶CD8CD4体液免役细胞免役疫苗种类减毒疫苗：降低致病物的毒性的疫苗，例如小儿麻痹糖丸。效果较好，因致病物具有一定的活性，有少量的人具有副作用，不能令人很满意。灭活疫苗：致病物灭活，安全性很好，效果较差，需要多次强化免疫的疫苗基因工程疫苗：使用活体非致病性载体系统，删除致病基因，保留病原物质引起的免疫反应的能力的片段，这些片段能够携带一些与它本身完全无关的致病物质的抗原决定簇，生产基因工程活体疫苗，该方法可以针对特定的致病物质产生更强的免疫反应。DNA疫苗：1993年将DNA直接注射入小鼠骨骼肌肉细胞后可引起特异性的免疫反应，1994在日内瓦召开专题会议将这种由核酸引起的免疫反应的疫苗定义为核酸疫苗或DNA疫苗。疫苗标准一是安全性二是有效性传统疫苗减毒疫苗灭活疫苗传统疫苗的作用是灭活或降低致病物质的毒性。传统疫苗的不足局限性表现在：1）、有些致病物质无法在培养基上生长，所以很很多疾病没有方法获得疫苗2）、动物和人类的病毒需要在动物细胞中培养，其操作成本高3）、培养的动物和人类病毒其生长速度和产量一般都很低，这使得疫苗的生产成本很高4）、需要对实验室以及参加试验的操作人员采取保护措施，以保证他们不会被致病物质污染；5）疫苗中的致病物质在疫苗生产过程中有可能没有完全杀死或充分减毒，这会导致疫苗中含有高毒性致病物质，进而使得疾病在更大的范围内传播；6）、监督菌株有可能发生突变，因此必须要连续不断地对减毒菌株进行毒性检测，以保证该菌株不变成强致病性菌株7）、有些疾病（例如艾滋病）用传统的疫苗防治收效甚微；8）、绝大多数的现行疫苗的有效期都很短，并且常常需要冷冻保存，这就增大了在广大的、尚未电气化的农村推广使用疫苗的难度。基因工程疫苗基因工程疫苗：将不同的外源基因导入肿瘤细胞（杂交瘤）后，再将其制成疫苗。乙肝疫苗（无毒性、无感染能力、但具有较强的免疫原性）重组疫苗的常见种类病原物质疾病（主要医学特征）病毒类巨细胞病毒登革病毒甲肝病毒A乙肝病毒B单纯疱疹病毒ll人类免疫缺陷性病毒流感病毒A、B日本脑炎病毒副流感病毒狂犬病毒呼吸道合胞病毒轮状病毒水痘-带壮疱疹病毒黄热病毒感染婴幼儿和免疫能力低下的人出血热高烧、肝损坏、低死亡率长期肝损坏、高死亡率生殖器官溃疡获得性免疫缺陷综合症急性呼吸系统病毒脑炎上呼吸道感染脑炎出现上下呼吸道病斑急性婴幼儿肠胃炎水痘（出现轻微的内部及外部病斑）心脏、肾和肝脏病斑细菌类百日咳杆菌破伤风杆菌致腹泻大肠杆菌流感嗜血杆菌麻风分枝杆菌结核杆菌淋病奈瑟球菌脑膜炎奈瑟球菌伤寒杆菌志货菌属A组链球菌B组链球菌肺炎链球菌霍乱弧菌百日咳破伤风（颈部和额部肌肉痉挛）腹泻脑膜炎、败血症麻风病（外周神经感觉丧失、毁容）结核病淋病（性传播）脑膜炎（脑和脊髓感染）伤寒痢疾猩红热、风湿热、咽喉感染脓毒，尿道感染肺炎、脑膜炎霍乱寄生虫类利什曼原虫属盘尾丝虫疟原虫属血吸虫锥虫属吴策线虫出现内部和外部病斑失明疟疾血吸虫病（痢疾和肝损坏）昏睡病丝虫病（淋巴管和腺体发炎）基因工程疫苗的作用强调细胞免疫传统疫苗强调体液免疫直到20世纪90年代，细胞免疫的问题才受到重视。尤其是对癌症、艾滋病这样严重的疑难杂症细胞免疫比体液免疫更重要。1996年两位澳大利亚的科学家由于发现了细胞免疫及免疫系统在对抗病毒感染过程中的MHC抗原而分享了当年的诺贝尔生理奖和医学奖。基因工程疫苗设计理念新一代疫苗的设计思想有了很大的改变。表现在：尽可能同时调动细胞免疫和体液免疫两个系统以获得最佳效果删除致病基因，保留致病物引起免疫反应能力的片段安全、高效基因工程疫苗特点删除了致病基因专一性增强免役原性较好细胞免役和体液免役同时起作用安全、高效基因工程疫苗种类亚基疫苗：利用病原物的某一部分制造的疫苗。肽疫苗：利用抗原决定簇小肽作为疫苗活体重组疫苗细菌疫苗恶性疟原虫疫苗免疫避孕疫苗抗独特型抗体疫苗双特异性抗体自身免疫疫苗治疗性疫苗乙肝治疗性疫苗单纯疱疹病毒疫苗麻风病治疗性疫苗肿瘤疫苗爱滋病疫苗等等亚基疫苗的优点与不足优点避免了直接使用病原物而使受试者可能致病的危险利用纯化蛋白质作为免疫源，可以避免由于外源蛋白、核酸的混杂引起的各种副作用单独使用特异蛋白能够增强免疫效果。不足纯化单一蛋白质十分昂贵，纯化蛋白质的构象可能与体内的不同，从而使抗原性发生改变亚基疫苗不具有感染性，不能激活MHCI分子，很难激活杀伤性T细胞，免疫反应较弱亚基疫苗：利用病原物的某一部分制造的疫苗。对于那些在培养基上无法培养的致病物质，科学家可以先分离出和克隆出他们的抗原决定簇的基因，然后在其他载体系统中表达。人们把这种通过基因克隆获得的疫苗称为亚基疫苗。适合于无法培养的致病物亚基疫苗例子单纯疱疹病毒疫苗口蹄疫病毒疫苗

单纯疱疹病毒疫苗单纯疱疹病毒疫苗(HSV)：属于疱疹病毒科疱疹病毒亚科，它可以在神经节中潜伏。该病毒衣壳是类脂蛋白构成的20面体，蛋白种类至少33种，一半是糖蛋白。HSV病毒的基因组为双链线状DNA，长度为152.5kb。

它可以引起性病、严重的眼部感染以及脑炎，还是一种致癌病毒。不论是灭活的还是减毒的单纯疱疹病毒作为疫苗预防HSV感染，被接种者都会有患癌症的风险。无致癌活性的亚基疫苗就是防止HSV的最佳选择。制备亚基疫苗将抗体与HSV-1或HSV-2抗原反应，能有效的治疗HSV感染的疾病。将HVS-1的衣壳糖蛋白D分离出来注射老鼠体内产生抗体抗HSV抗体将糖蛋白D基因分离改造D基因去除C端跨膜序列区域注射疱疹病毒衣壳蛋白D定位口蹄疫病毒疫苗对于猪和牛具有很强的毒性。全世界每年要消耗10亿美元用于灭活疫苗。FMDV是单链RNA病毒。能诱导产生抗体的衣壳蛋白1（VP1）分离出来逆转录合成cDNA限制性内切酶酶解导入E.coli载体免役学方法筛选VP1基因的表达产物VP1产物是一种融合蛋白，全长396个氨基酸，包括MS2噬菌体的复制酶的一部分和FMDVVP1蛋白。融合蛋白的表达是受PL启动子-cI受体系统控制。表达的融合蛋白可以诱导产生FMDV的抗体。肽疫苗肽疫苗：利用抗原决定簇小肽作为疫苗例子：独特型肽疫苗：将肿瘤特异性抗原以融合蛋白或非融合蛋白的形式表达出来，然后制备成的疫苗。热休克蛋白（HSP）-肽复合体疫苗HSP-肽疫苗HSP-肽疫苗含有多种肿瘤特异性抗原，避免了抗原的复杂分离，克服了抗原多变性而造成肿瘤疫苗应用范围小的问题；HSP的保守性，克服由于MHC多型性而造成肿瘤疫苗无法在大量患者中通用的缺陷；HSP-肽疫苗不需要佐剂，HSP本身能够激活较强的细胞免疫；HSP-肽疫苗可诱发长效T细胞免疫，持续时间长，且具有记忆功能。热休克蛋白HSP是一类进化上十分保守存在范围十分广泛的蛋白质具有分子伴侣的作用分子伴侣概念：一类参与蛋白质的准确折叠和组装过程的辅助蛋白，是一类进化十分保守的蛋白质家族，广泛存在于生物体内。特点：保守性；无专一性；广谱性。作用：是与新生肽或部分折叠蛋白结合，加速其折叠或组装成天然构象的进程；其方式是与没有折叠或部分折叠的蛋白质疏水表面结合，诱发正确的构象，并防止其相互聚集或错误折叠。功能：胁迫保护；转运蛋白；调节基因转录和DNA复制；组装细胞骨架。动物病毒肽疫苗制备衣壳蛋白1（VP1）C端的3个肽段及N端的3个肽段C1（141~160）C2（151~160）C3（200~213）N1（9~24）N2（17~32）N3（25~41）分别连接转运蛋白提高小肽的稳定性注入豚鼠C1（141~160）肽段在豚鼠体内产生了足以抵御可蹄疫病毒FMDV感染的抗体C1（141~158）和C3（200~213）两个肽段连接成长肽免疫豚鼠可以不以内感载体蛋白就能够激发豚鼠产生高水平的抗体不足是所需肽段的剂量是灭活的FMDV的1000倍。解决办法：把VP1基因的C1（142~160）序列与具有强免疫原性的载体蛋白——乙肝核心蛋白基因连接起来，这种融合蛋白自发组装成“27nm”的颗粒，而142~160肽段刚好位于颗粒外表面，这种颗粒具有极高的免疫原性。肽疫苗结构肽疫苗的多抗原决定簇肽疫苗的不足抗原决定簇的肽段不能太长，而且要连续有的抗原决定簇的氨基酸可能分布在不同的区域，这样制造困难要求肽段构像必须与完整病毒上的抗原决定簇构像一致选择的单一抗原决定簇必须要有足够的免疫原性肽疫苗的优点具有高度特异性价格低廉良好的免疫原性可能成为传统疫苗的替代品活体重组疫苗利用基因工程方法对细菌和病毒进行改造，可以是非致病性微生物，通过基因通过改造使之携带并表达某种特定病原物的抗原决定簇基因，产生免疫性，也可以是致病性微生物，通过基因工程改造方法修饰或去掉毒性基因，保持免疫原性。活体疫苗的特点：抗原决定簇的构象与致病物抗原构象相同或相似免疫原性较好活体重组疫苗的载体条件要有稳定的减毒表型生活史中不能与宿主染色体整合可以表达出有免疫原性的外源序列操作简便接种以后不会长期保留在体内活体疫苗例子——霍乱疫苗A1肽上插入四环素抗性基因，使得A1肽失活，再制成无毒活体疫苗霍乱致病物是肠毒素，它是1个A亚基、5个B亚基构成，A亚基具有ADP糖基化的活性，能够激活腺苷环化酶，具有两个功能区，A1和A2肽，A1肽包括毒性区，由192个氨基酸构成，A2肽连接AI肽和B亚基，B亚基与肠黏膜细胞受体结合。活体疫苗制备A1肽基因中间有550bp的片段即183个氨基酸残基被删除了连接酶连接到质粒上导入含有四环素抗性的A1失活的霍乱菌中同源重组缺失A1片段含四环素抗性失活A1片段含缺失A1片段共整合细胞活体疫苗菌株无肠毒素无毒性缺失霍乱毒素A1肽示意图牛痘病毒疫苗——天花痘苗病毒是最复杂的一类病毒，属于痘病毒科。天花是曾经危险人类的最可怕病毒之一，现在已于1980年世界卫生组织宣布已经灭绝。痘苗病毒基因组187kb双链DNA构成，共编码200种蛋白质，链末端有发夹结构，约有10kb的倒置重复序列。倒置重复区独特序列区域倒置重复区10kb180kb10kb感染人类、其他脊椎动物和无脊椎动物感染细胞其病毒DNA在细胞质中复制，DNA聚合酶、RNA聚合酶以及mRNA的加帽以及多聚腺苷化酶由病毒自身编码构建重组痘苗病毒示意图痘苗病毒载体的重组过程重组活体痘苗病毒的条件外源基因不能有内含子，痘苗病毒尚无剪切功能外源基因要在痘苗病毒的非必需基因区插入，插入后不能影响痘苗病毒的正常复制、免疫原性及其他重要基因的表达，同时插入外源基因后痘苗病毒的毒性不能提高；外源基因两侧要有同源序列，以利于重组；要选择合适的攻毒量及攻毒时间，以创造在细胞内进行同源重组的最适条件；要有简便易行的方法对重组的痘苗病毒进行筛选重组痘苗病毒疫苗的优点可以在最接近于自然感染的情况下表达外源抗原；可以在宿主体内复制，从而加大抗原的量，诱导激活更多的B细胞、T细胞；在病毒基因组中插入一个或多个外源抗原进一步减弱它本身的致病性；痘苗病毒基因组较大，因而插入外源基因容量大重组痘苗病毒疫苗的缺点对免疫功能不足的受体如爱滋病患者接种后，可能引起严重的病毒感染解决方法：将人白细胞介素2的基因插入痘苗病毒载体中，白细胞介素2能够加强免疫系统T细胞的反映，从而限制病毒的扩增，减少不必要的感染流感病毒疫苗流感病毒属于正粘病毒科，它是负链RNA病毒，大小13.6kb，基因组由8个单链负链RNA组成，编码10个多肽。流感病毒表面的血凝集素与细胞表面的含N-乙酰神经氨酸酶的粘蛋白受体结合，通过细胞胞吞作用进入细胞，进入细胞后病毒脱去外壳，暴露负链RNA，该RNA进入细胞核转录出正链RNA，以此为模板复制大量的负链RNA以及病毒蛋白质，通过出芽形成病毒颗粒。流感病毒核糖核蛋白RNP有4种：NP、PB1、PB2、PA。NP是核衣壳的主要成分，PB1、PB2、PA与病毒转录和复制有关流感病毒生活史流感病毒疫苗载体的制备去污剂裂解病毒甘油梯度离心氯化铯-甘油梯度离心糖衣壳蛋白RNP纯化紫外线照射RNP破坏RNA不影响RNP活性外源基因替代NP基因重组的DNA置于T7或SP6启动子转录重组RNAT7聚合酶催化脱氧核糖核酸酶以除去DNA模板15minPBS缓冲液稀释转染细胞流感病毒疫苗载体的优越性流感病毒了解较深入应用基础广灭活或减毒流感疫苗较安全易于培养、检测、纯化流感病毒可以诱导IgA介导的黏膜免疫（黏膜免疫在人体HIV过程中起着重要的作用，利用流感病毒载体可以获得高效的HIV疫苗）流感病毒表面抗原极易变异，因此可重复利用这些变异株作用不同病原体的疫苗载体，有利于同时感染多种病原物的病人的治疗。流感病毒疫苗载体的不足基因组小，外源基因容量小基因组中与复制无关的非必需区尚不清楚细菌疫苗及其他抗细菌疫苗由于抗生素的使用，抗细菌疫苗研究进展缓慢，抗生素的不足：并非所有的细菌都能够使用抗生素治疗，抗生素的滥用出现很多抗抗生素的菌株，抗生素需要冷藏，热带地区保存比较困难。抗细菌疫苗例子：rickettsiarickettsii是一种专性生活于胞间革兰氏阴性细菌，能够引起洛基山出血热，该细菌不能培养生长，治疗很困难科学家克隆了该菌的一种主要表面抗原的编码基因，把它表达出来作为亚基疫苗，发现接种后的小鼠能够有效抵抗该病菌的侵染。其他疫苗恶性疟原虫疫苗免疫避孕疫苗抗独特型抗体疫苗双特异性抗体自身免疫疫苗治疗性疫苗乙肝治疗性疫苗单纯疱疹病毒疫苗麻风病治疗性疫苗肿瘤疫苗爱滋病疫苗DNA疫苗免疫又叫基因免疫或核酸免疫。1993年Wolff等人意外到发现将DNA直接注射入小鼠骨骼肌肉细胞后可引起特异性的免疫反应，而且这种免疫反应可以持续2个月以上。从此DNA免疫就成为全世界研究的热点。1994在日内瓦召开专题会议将这种疫苗定义为核酸疫苗，1994-1995年，世界卫生组织和美国科学院分别开会讨论DNA免疫的应用前景，认为DNA免疫开创了疫苗学的新纪元。核酸疫苗种类DNA疫苗RNA疫苗核酸疫苗的特点与优越性第一，能够诱导细胞免疫和体液免疫（B与T细胞免疫），对疑难杂症的预防和治疗有重要的意义第二，更安全（1、作为亚单位疫苗。不存在减毒疫苗所潜在转阳危险，2、裸DNA是质粒来运载，不需要使用病毒运至靶细胞，避免病毒载体的危险性，以及宿主对病毒载体的免疫性，比活疫苗更安全）第三，工艺较蛋白质的简单，提纯容易，适于大规模生产，成本相对较低。第四，稳定性较好（比蛋白质），保存时间较长，便于运输第五，一次注射可以获得对多种疾病的免疫能力（任何DNA片段都可以插入到质粒中制成疫苗，而且在同一质粒上可以同时容纳一个以上的抗原基因），所以多个病原体基因可以装载在一个质粒中，减少免疫时的多次注射的不舒适不方便第六，接种途径多样化（皮下、皮内、肌注、基因枪注射、口服、喷雾等）核酸疫苗的局限性DNA疫苗可能与宿主整合，从而有可能破坏正常的细胞的功能，目前免疫原性较低常见的核酸疫苗轮状病毒乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒单纯疱疹病毒狂犬病毒结核杆菌疟疾等开展了DNA疫苗的研究核酸疫苗的主要问题中心问题提高DNA疫苗的效力手段：隔5-6周进行一次加强免疫，加强1-2次；或VD3作为DNA疫苗佐剂可加强DNA疫苗的效力。核酸疫苗的研究状况DNA疫苗的应用研究1993年3年开始难治的感染性疾病自身免疫缺陷疾病过敏性疾病肿瘤性疾病的预防与治疗领域已经做了大量的动物实验显示出广泛的应用前景流行性感冒病毒乙肝病毒人类免疫缺陷病毒狂犬病毒淋巴细胞性脉络丛脑炎病毒疟原虫支原体及肿瘤的预防与治疗研究核酸疫苗例子将流感病毒的核心蛋白抗原（NP）基因克隆到表达载体中直接注入小鼠骨骼肌细胞产生针对多种亚型的杀伤性T细胞用流感病毒去感染免疫过的小鼠，小鼠的存活率比对照提高了50%。核心蛋白抗原（NP）非常保守包膜蛋白极易变异，难于被免疫系统逐一识别丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒（HCV）的核心抗原DNA免疫动物，获得了针对HCV核心抗原的体液免疫及细胞免疫。从这些例子中可以发现一些疑难杂症可以DNA免疫而得到治疗。比如肝炎，是现在难于控制的疾病，如果DNA免疫方法得到进一步的完善，肝炎有望得到治疗。癌症治疗的核酸疫苗用于癌症治疗：向小鼠体内注射编码抗体可变区的基因质粒产生抗独特型抗体，抗体可变区基因疫苗用于治疗B淋巴瘤细胞，T细胞受体独特型基因疫苗可治疗T淋巴瘤把编码人癌胚抗原（CEA）的质粒注入小鼠舌中，引起针对人CAE的独特型细胞免疫和体液免疫，为治疗结肠癌、乳腺癌、肺癌带来希望。埃博拉病毒的DNA疫苗1997年12月底，美国密歇根大学医学中心针对致死性埃博拉病毒的DNA疫苗动物实验获得成功并于1998年进行了灵长目动物实验Vical公司的研究表明，携带流感病毒基因的质粒免疫小鼠后能抵抗致死剂量病毒的攻击。DNA疫苗的人体实验人体实验有4种DNA疫苗进入临床I期实验，迄今，国外已有至少4种DNA疫苗被批准进入Ⅰ与Ⅱ期临床试验。1996年美国FDA批准对健康志愿者进行艾滋病DNA疫苗人体实验。1998年MacGregoretal首次报道了DNA疫苗治疗艾滋病病毒HIV-1感染者的人体实验结果。据最新消息，英国已经批准在今年8月开始进行一种专门针对非洲人的HIVDNA疫苗的I期临床试验（HIVA亚型，是肯尼亚和非洲其他地区最流行的HIV菌株）。疟疾的DNA疫苗1998年，美国海军宣布他们已经成功地在健康人体上检测了针对疟疾的DNA疫苗，他们认为这种疫苗最早得到广泛应用将可能在2005年。DNA流感疫苗默克公司已经建立了裸DNA流感疫苗候选物，其它的试验将很快得到针对疱疹、疟疾和HIV的DNA疫苗。在几年内，其它疾病，如结核病、乳头状瘤、衣原体和肝炎也可能成为靶标。目前正在进行一项患有淋巴瘤白细胞癌病人的临床试验，计划检验DNA疫苗是