免疫学操作规程做法总结手册

免疫学操作规程做法总结手册一、概述

免疫学操作规程做法总结手册旨在为实验室工作人员提供标准化的免疫学实验操作指南，确保实验结果的准确性和可重复性。本手册涵盖了免疫学实验的基本原则、常用技术、操作步骤及注意事项，适用于细胞培养、抗体制备、免疫印迹、流式细胞术等实验流程。通过规范操作，降低实验误差，提高工作效率。

二、免疫学实验基本原则

（一）实验环境要求

1.保持实验室清洁，定期消毒工作台面及设备。

2.使用超纯水或去离子水配制试剂，确保水质符合实验标准。

3.操作前洗手，佩戴手套，避免污染样本及试剂。

（二）试剂配制与管理

1.试剂配制需精确称量，使用高纯度化学试剂。

2.保存条件需符合说明书要求，如低温保存、避光储存等。

3.定期检查试剂效期，过期试剂及时更换。

（三）样本处理规范

1.样本采集后尽快处理，避免长时间保存导致降解。

2.细胞样本需进行无菌处理，防止微生物污染。

3.分离血清时避免溶血，影响实验结果。

三、常用免疫学技术操作规程

（一）细胞培养技术

1.**细胞复苏**

(1)将冻存细胞置于37℃水浴中快速解冻。

(2)加入预温培养基，轻柔吹打混匀。

(3)移至培养皿，37℃、5%CO₂条件下培养。

2.**细胞传代**

(1)用胰蛋白酶消化细胞，观察贴壁情况。

(2)加入培养基终止消化，用吸管吹散细胞。

(3)计数细胞密度，按1:3至1:10比例传代。

（二）免疫印迹（WesternBlot）技术

1.**样本制备**

(1)细胞裂解，提取总蛋白，BCA法测定浓度。

(2)蛋白变性，加入还原剂及上样缓冲液。

2.**电泳分离**

(1)配制SDS凝胶，调整浓度梯度。

(2)将样品上样，恒压电泳约1-2小时。

3.**转膜与封闭**

(1)将凝胶转移至PVDF膜，甲醇预浸10分钟。

(2)用TBST清洗，5%脱脂奶粉封闭2小时。

4.**抗体孵育**

(1)一抗孵育（1:1000稀释），4℃过夜。

(2)TBST清洗3次，每次10分钟。

(3)二抗孵育（1:5000稀释），室温1小时。

5.**信号检测**

(1)ECL化学发光试剂盒显色，曝光成像。

(2)使用灰度分析软件定量结果。

（三）流式细胞术（FlowCytometry）技术

1.**细胞染色**

(1)PBS清洗细胞，重悬至1×10⁶/mL。

(2)加入荧光标记抗体，避光孵育30分钟。

2.**上机检测**

(1)设置细胞门，调整电压及阈值。

(2)收集数据，至少采集1×10⁵个细胞。

3.**数据分析**

(1)使用FlowJo软件绘制散点图及柱状图。

(2)计算阳性细胞比例及平均荧光强度。

四、实验注意事项

（一）避免交叉污染

1.使用一次性吸头及移液器头。

2.不同样本使用独立工具，标记清晰。

（二）设备维护

1.定期校准流式细胞仪，检查激光器功率。

2.更换电泳仪胶板，确保导电均匀。

（三）安全防护

1.操作锐器时佩戴护目镜及手套。

2.化学试剂接触皮肤立即用大量水冲洗。

五、总结

本手册总结了免疫学实验的核心操作流程，通过标准化步骤减少人为误差。实验人员需严格遵守规程，结合实际情况调整参数。持续优化操作方法，提升实验效率与数据可靠性。

**一、概述**

免疫学操作规程做法总结手册旨在为实验室工作人员提供标准化的免疫学实验操作指南，确保实验结果的准确性和可重复性。本手册涵盖了免疫学实验的基本原则、常用技术、操作步骤及注意事项，适用于细胞培养、抗体制备、免疫印迹、流式细胞术等实验流程。通过规范操作，降低实验误差，提高工作效率。本手册的编写基于广泛接受的免疫学原理和实验室实践经验，力求内容详实、步骤清晰、易于操作。

二、免疫学实验基本原则

（一）实验环境要求

1.保持实验室清洁，定期消毒工作台面及设备。

（1）每日实验结束后，使用70-75%乙醇或含氯消毒剂擦拭工作台面、操作者接触过的设备表面（如离心机门把手、培养箱把手）。

（2）地面定期使用消毒液拖拭。

（3）空气流通应良好，必要时使用空气净化设备。

2.使用超纯水或去离子水配制试剂，确保水质符合实验标准。

（1）优先使用符合ISO3691-2标准的超纯水或去离子水（电阻率≥18.2MΩ·cm）。

（2）所有配制过程均需使用经过清洗并可能经过灭菌处理的容器和玻璃器皿。

（3）配制缓冲液时，需确认水的电导率及溶解氧含量，必要时进行脱气处理。

3.操作前洗手，佩戴手套，避免污染样本及试剂。

（1）进入实验室后，使用抗菌洗手液和流动水彻底清洗双手至少20秒。

（2）根据实验需求选择合适尺寸和材质的无菌手套（如丁腈、乳胶），操作全程保持手套清洁，避免破损。

（3）处理不同样本或试剂前后，必须更换手套，必要时进行手部消毒。

（二）试剂配制与管理

1.试剂配制需精确称量，使用高纯度化学试剂。

（1）根据试剂说明书或实验方案，使用万分之一精度的分析天平称量固体试剂。

（2）液体试剂使用精密移液器或天平精确量取，注意区分不同体积单位的换算。

（3）优先选用分析纯（AR）或更高纯度的化学试剂，确保杂质不会干扰实验结果。

2.保存条件需符合说明书要求，如低温保存、避光储存等。

（1）易挥发、易分解的试剂（如氢氧化钠、过氧化氢）需密封保存，并置于冷库（通常4℃）或冰箱（-20℃或-80℃）中。

（2）光敏感试剂（如某些酶、抗体）需使用棕色瓶储存，并避光保存。

（3）根据试剂性质选择合适的储存容器，如玻璃瓶、塑料瓶等，并标注清晰的试剂名称、浓度、配制日期及有效期。

3.定期检查试剂效期，过期试剂及时更换。

（1）建立试剂台账，记录所有试剂的采购日期和有效期。

（2）实验前核对试剂标签，确保未超过有效期。

（3）对于外观异常（如变色、沉淀、结块）或可能失效的试剂，应立即停止使用并进行妥善处理（如废弃），不得随意丢弃。

（三）样本处理规范

1.样本采集后尽快处理，避免长时间保存导致降解。

（1）生物样本（如血液、组织）应在采集后规定时间内（通常为数小时内）进行处理或冻存，具体时间取决于样本类型和后续实验要求。

（2）对于需要保存的样本，应立即加入抗凝剂（如肝素、EDTA）或固定液，并置于适宜温度（如4℃）保存。

2.细胞样本需进行无菌处理，防止微生物污染。

（1）细胞培养基、试剂及所有接触细胞物品均需灭菌（如高压蒸汽灭菌、过滤除菌）。

（2）操作环境（超净工作台或生物安全柜）需定期消毒，并保持洁净度。

（3）操作时避免说话、咳嗽等产生气溶胶的行为，防止污染。

3.分离血清时避免溶血，影响实验结果。

（1）血液采集后应静置，避免剧烈晃动。

（2）离心分离时使用合适的离心力和时间，避免细胞破裂。

（3）若需进一步纯化或分析血清，应先进行离心，取上清部分。

三、常用免疫学技术操作规程

（一）细胞培养技术

1.**细胞复苏**

(1)将冻存细胞置于37℃水浴中快速解冻。

（1）取含细胞的冻存管，在超净工作台中或手套箱内，迅速置于37℃水浴锅中，轻轻摇晃或旋转，观察管内物质逐渐融化（通常需5-10分钟）。

（2）避免直接火焰加热冻存管。

(2)加入预温培养基，轻柔吹打混匀。

（1）向融化后的细胞中加入预先在37℃预热并含血清的完全培养基，使用枪头轻柔吹打，确保细胞完全悬浮。

（2）切勿剧烈涡旋，以免损伤细胞。

(3)移至培养皿，37℃、5%CO₂条件下培养。

（1）将细胞悬液转移至合适的培养容器（如T25培养瓶）。

（2）确保培养箱状态正常，CO₂浓度和湿度符合要求。

2.**细胞传代**

(1)用胰蛋白酶消化细胞，观察贴壁情况。

（1）待细胞生长至80%-90%汇合度时，弃去旧培养基。

（2）加入含0.25%胰蛋白酶的消化液（通常含EDTA），置于37℃培养箱中消化，期间可在显微镜下观察细胞变圆、脱落。

（3）消化时间根据细胞类型调整（通常5-20分钟），避免过度消化导致细胞死亡。

(2)加入培养基终止消化，用吸管吹散细胞。

（1）当细胞大部分变圆时，迅速加入适量完全培养基终止消化。

（2）使用细胞刮刀或吸管将细胞从瓶壁刮下或吹散。

(3)计数细胞密度，按1:3至1:10比例传代。

（1）使用细胞计数板和显微镜（或自动细胞计数仪）计数细胞悬液中的细胞数量和活力（台盼蓝染色法）。

（2）根据目标细胞密度，调整细胞悬液浓度，加入新的培养容器中。

（二）免疫印迹（WesternBlot）技术

1.**样本制备**

(1)细胞裂解，提取总蛋白，BCA法测定浓度。

（1）收集细胞，用预冷PBS或缓冲液洗涤去除培养基。

(2)加入细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），使用匀浆器或浴旋振荡裂解细胞。

(3)离心收集上清，使用BCA蛋白定量试剂盒测定样品蛋白浓度，用蒸馏水或缓冲液将蛋白浓度调整至合适范围（通常0.5-1mg/mL）。

(2)蛋白变性，加入还原剂及上样缓冲液。

（1）取等量蛋白样品，加入5×上样缓冲液（含β-巯基乙醇或DTT作为还原剂），100℃变性5-10分钟。

（2）冷却后上样。

2.**电泳分离**

(1)配制SDS凝胶，调整浓度梯度。

（1）根据目标蛋白分子量范围选择合适的凝胶浓度（如12%-15%）。

(2)称量丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺，溶解于去离子水中，配制凝胶溶液。

(3)加入交联剂（如TEMED），混合均匀，灌胶于模具中，插入梳子形成上样孔。

(2)将样品上样，恒压电泳约1-2小时。

（1）在电泳槽中加入电泳缓冲液（如Tris-Glycine缓冲液），将凝胶放入电泳槽中，确保样品孔在负极侧。

(2)连接电源，设定恒压（通常20-30V/cm），上样后开始电泳。

(3)根据蛋白大小和凝胶浓度，调整电泳时间，通常分离Marker所需时间较长（约1.5-2小时）。

3.**转膜与封闭**

(1)将凝胶转移至PVDF膜，甲醇预浸10分钟。

（1）取出凝胶，用甲醇浸泡PVDF膜4-5分钟，再浸泡于转移缓冲液（含甲醇）中10分钟，使膜充分活化。

(2)准备转移装置，将活化好的PVDF膜、滤纸（2-3张）、凝胶依次放置，确保膜与凝胶接触紧密。

(2)用TBST清洗，5%脱脂奶粉封闭2小时。

（1）将转移装置放入电泳槽中，加入预冷的TBST缓冲液，覆盖膜表面。

(2)4℃条件下封闭，期间可轻摇。

(3)封闭后，用TBST洗涤3-4次，每次10分钟。

4.**抗体孵育**

(1)一抗孵育（1:1000稀释），4℃过夜。

（1）将封闭液吸除，加入TBST洗涤膜3次。

(2)配制一抗工作液（根据说明书稀释，常用浓度1:1000-1:5000），加入足够覆盖膜的抗体溶液，37℃或4℃孵育过夜（建议4℃，可降低非特异性结合）。

(2)TBST清洗3次，每次10分钟。

（1）吸除一抗，用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟，以去除未结合的一抗。

(3)二抗孵育（1:5000稀释），室温1小时。

（1）用TBST洗涤膜3次。

(2)配制二抗工作液（常用羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG，根据说明书稀释），加入足够覆盖膜的抗体溶液，室温避光孵育1小时。

5.**信号检测**

(1)ECL化学发光试剂盒显色，曝光成像。

（1）用TBST洗涤膜3次。

(2)加入新鲜配制的ECL底物溶液，避光反应1-5分钟（时间取决于抗体强度和设备灵敏度）。

(3)使用化学发光成像系统（如凝胶成像仪）拍摄图像。

(2)使用灰度分析软件定量结果。

（1）使用ImageJ、QuantityOne等软件对图像进行灰度分析，测量目标条带的相对灰度值。

(2)结合内参蛋白（如β-actin）灰度值，进行标准化处理。

（三）流式细胞术（FlowCytometry）技术

1.**细胞染色**

(1)PBS清洗细胞，重悬至1×10⁶/mL。

（1）收集细胞，用预冷的PBS洗涤1-2次，去除培养基或固定液。

(2)用细胞计数板计数，用PBS将细胞浓度调整至1×10⁶cells/mL。

(2)加入荧光标记抗体，避光孵育30分钟。

（1）根据抗体说明书，计算所需抗体量，加入细胞悬液中，混匀。

(2)将细胞-抗体混合物置于冰浴或4℃避光孵育，期间可轻柔混匀。

2.**上机检测**

(1)设置细胞门，调整电压及阈值。

（1）打开流式细胞仪，进行日常开机自检和校准（如激光功率、电压校准）。

(2)根据细胞类型和实验目的，在FSC/SSC散点图上初步设置细胞群体（GatingStrategy），排除死细胞（如根据PI染色或FSC低值）。

(3)调整各荧光通道的电压和阈值，确保信号采集在最佳线性范围。

(2)收集数据，至少采集1×10⁵个细胞。

（1）将细胞-抗体混合物上机，设置收集参数（如流速、事件阈值）。

(2)根据细胞总量和预期阳性率，确保采集足够数量的活细胞（通常至少1×10⁵个）以保证统计学可靠性。

3.**数据分析**

(1)使用FlowJo软件绘制散点图及柱状图。

（1）将原始数据文件（.FCS）导入FlowJo软件。

(2)根据需要，进行数据清洗（如去除双细胞、碎片）、补偿校正（如荧光补偿）、细胞分群（Gating）。

(3)绘制FSC/SSC散点图、直方图、密度图等，观察细胞群体分布。

(2)计算阳性细胞比例及平均荧光强度。

（1）在目标细胞群中，设置阳性细胞门（如根据抗体染色强度区分阳性与阴性）。

(2)计算阳性细胞占总细胞数的百分比（PercentPositive）。

(3)测量阳性细胞群体的平均荧光强度（MeanFluorescenceIntensity,MFI），评估抗体结合水平。

四、实验注意事项

（一）避免交叉污染

1.使用一次性吸头及移液器头。

（1）严禁在多孔板、培养皿等设备上共用吸头或移液器头。

（2）处理不同样本或实验（如细胞培养、蛋白印迹、流式染色）时，必须更换新的吸头和移液器头。

2.不同样本使用独立工具，标记清晰。

（1）每个样本应配备独立的离心管、EP管、枪头等处理工具，并清晰标记样本信息（如样本名称、编号、日期）。

（2）使用不同颜色的标签或笔区分不同组别或实验。

（二）设备维护

1.定期校准流式细胞仪，检查激光器功率。

（1）根据设备说明书，定期使用标准品校准荧光通道的波长和强度。

（2）定期检查激光器输出功率，确保稳定性。

2.更换电泳仪胶板，确保导电均匀。

（1）每次使用前检查胶板是否有划痕、破损或残留物。

(2)定期清洁电泳槽，去除电极条上的杂质。

（三）安全防护

1.操作锐器时佩戴护目镜及手套。

（1）使用刀片、注射器等锐器时，必须佩戴防护眼镜，避免飞溅物损伤眼睛。

(2)处理化学试剂或生物样本时，佩戴合适材质（如丁腈）的无菌手套。

2.化学试剂接触皮肤立即用大量水冲洗。

（1）实验过程中如不慎将酸、碱、有机溶剂等化学试剂接触皮肤，应立即脱去污染衣物，用大量流动的清水冲洗至少15分钟。

(2)冲洗后根据试剂性质，用相应的中和液（如弱酸中和强碱）进一步处理，并尽快寻求医疗帮助。

五、总结

本手册总结了免疫学实验的核心操作流程，通过标准化步骤减少人为误差。实验人员需严格遵守规程，结合实际情况调整参数。持续优化操作方法，提升实验效率与数据可靠性。在实验过程中，应时刻关注细节，加强个人防护，确保实验安全顺利进行。对于特定实验或新型技术，建议查阅相关文献和设备说明书，获取更详细的信息。

一、概述

免疫学操作规程做法总结手册旨在为实验室工作人员提供标准化的免疫学实验操作指南，确保实验结果的准确性和可重复性。本手册涵盖了免疫学实验的基本原则、常用技术、操作步骤及注意事项，适用于细胞培养、抗体制备、免疫印迹、流式细胞术等实验流程。通过规范操作，降低实验误差，提高工作效率。

二、免疫学实验基本原则

（一）实验环境要求

1.保持实验室清洁，定期消毒工作台面及设备。

2.使用超纯水或去离子水配制试剂，确保水质符合实验标准。

3.操作前洗手，佩戴手套，避免污染样本及试剂。

（二）试剂配制与管理

1.试剂配制需精确称量，使用高纯度化学试剂。

2.保存条件需符合说明书要求，如低温保存、避光储存等。

3.定期检查试剂效期，过期试剂及时更换。

（三）样本处理规范

1.样本采集后尽快处理，避免长时间保存导致降解。

2.细胞样本需进行无菌处理，防止微生物污染。

3.分离血清时避免溶血，影响实验结果。

三、常用免疫学技术操作规程

（一）细胞培养技术

1.**细胞复苏**

(1)将冻存细胞置于37℃水浴中快速解冻。

(2)加入预温培养基，轻柔吹打混匀。

(3)移至培养皿，37℃、5%CO₂条件下培养。

2.**细胞传代**

(1)用胰蛋白酶消化细胞，观察贴壁情况。

(2)加入培养基终止消化，用吸管吹散细胞。

(3)计数细胞密度，按1:3至1:10比例传代。

（二）免疫印迹（WesternBlot）技术

1.**样本制备**

(1)细胞裂解，提取总蛋白，BCA法测定浓度。

(2)蛋白变性，加入还原剂及上样缓冲液。

2.**电泳分离**

(1)配制SDS凝胶，调整浓度梯度。

(2)将样品上样，恒压电泳约1-2小时。

3.**转膜与封闭**

(1)将凝胶转移至PVDF膜，甲醇预浸10分钟。

(2)用TBST清洗，5%脱脂奶粉封闭2小时。

4.**抗体孵育**

(1)一抗孵育（1:1000稀释），4℃过夜。

(2)TBST清洗3次，每次10分钟。

(3)二抗孵育（1:5000稀释），室温1小时。

5.**信号检测**

(1)ECL化学发光试剂盒显色，曝光成像。

(2)使用灰度分析软件定量结果。

（三）流式细胞术（FlowCytometry）技术

1.**细胞染色**

(1)PBS清洗细胞，重悬至1×10⁶/mL。

(2)加入荧光标记抗体，避光孵育30分钟。

2.**上机检测**

(1)设置细胞门，调整电压及阈值。

(2)收集数据，至少采集1×10⁵个细胞。

3.**数据分析**

(1)使用FlowJo软件绘制散点图及柱状图。

(2)计算阳性细胞比例及平均荧光强度。

四、实验注意事项

（一）避免交叉污染

1.使用一次性吸头及移液器头。

2.不同样本使用独立工具，标记清晰。

（二）设备维护

1.定期校准流式细胞仪，检查激光器功率。

2.更换电泳仪胶板，确保导电均匀。

（三）安全防护

1.操作锐器时佩戴护目镜及手套。

2.化学试剂接触皮肤立即用大量水冲洗。

五、总结

本手册总结了免疫学实验的核心操作流程，通过标准化步骤减少人为误差。实验人员需严格遵守规程，结合实际情况调整参数。持续优化操作方法，提升实验效率与数据可靠性。

**一、概述**

免疫学操作规程做法总结手册旨在为实验室工作人员提供标准化的免疫学实验操作指南，确保实验结果的准确性和可重复性。本手册涵盖了免疫学实验的基本原则、常用技术、操作步骤及注意事项，适用于细胞培养、抗体制备、免疫印迹、流式细胞术等实验流程。通过规范操作，降低实验误差，提高工作效率。本手册的编写基于广泛接受的免疫学原理和实验室实践经验，力求内容详实、步骤清晰、易于操作。

二、免疫学实验基本原则

（一）实验环境要求

1.保持实验室清洁，定期消毒工作台面及设备。

（1）每日实验结束后，使用70-75%乙醇或含氯消毒剂擦拭工作台面、操作者接触过的设备表面（如离心机门把手、培养箱把手）。

（2）地面定期使用消毒液拖拭。

（3）空气流通应良好，必要时使用空气净化设备。

2.使用超纯水或去离子水配制试剂，确保水质符合实验标准。

（1）优先使用符合ISO3691-2标准的超纯水或去离子水（电阻率≥18.2MΩ·cm）。

（2）所有配制过程均需使用经过清洗并可能经过灭菌处理的容器和玻璃器皿。

（3）配制缓冲液时，需确认水的电导率及溶解氧含量，必要时进行脱气处理。

3.操作前洗手，佩戴手套，避免污染样本及试剂。

（1）进入实验室后，使用抗菌洗手液和流动水彻底清洗双手至少20秒。

（2）根据实验需求选择合适尺寸和材质的无菌手套（如丁腈、乳胶），操作全程保持手套清洁，避免破损。

（3）处理不同样本或试剂前后，必须更换手套，必要时进行手部消毒。

（二）试剂配制与管理

1.试剂配制需精确称量，使用高纯度化学试剂。

（1）根据试剂说明书或实验方案，使用万分之一精度的分析天平称量固体试剂。

（2）液体试剂使用精密移液器或天平精确量取，注意区分不同体积单位的换算。

（3）优先选用分析纯（AR）或更高纯度的化学试剂，确保杂质不会干扰实验结果。

2.保存条件需符合说明书要求，如低温保存、避光储存等。

（1）易挥发、易分解的试剂（如氢氧化钠、过氧化氢）需密封保存，并置于冷库（通常4℃）或冰箱（-20℃或-80℃）中。

（2）光敏感试剂（如某些酶、抗体）需使用棕色瓶储存，并避光保存。

（3）根据试剂性质选择合适的储存容器，如玻璃瓶、塑料瓶等，并标注清晰的试剂名称、浓度、配制日期及有效期。

3.定期检查试剂效期，过期试剂及时更换。

（1）建立试剂台账，记录所有试剂的采购日期和有效期。

（2）实验前核对试剂标签，确保未超过有效期。

（3）对于外观异常（如变色、沉淀、结块）或可能失效的试剂，应立即停止使用并进行妥善处理（如废弃），不得随意丢弃。

（三）样本处理规范

1.样本采集后尽快处理，避免长时间保存导致降解。

（1）生物样本（如血液、组织）应在采集后规定时间内（通常为数小时内）进行处理或冻存，具体时间取决于样本类型和后续实验要求。

（2）对于需要保存的样本，应立即加入抗凝剂（如肝素、EDTA）或固定液，并置于适宜温度（如4℃）保存。

2.细胞样本需进行无菌处理，防止微生物污染。

（1）细胞培养基、试剂及所有接触细胞物品均需灭菌（如高压蒸汽灭菌、过滤除菌）。

（2）操作环境（超净工作台或生物安全柜）需定期消毒，并保持洁净度。

（3）操作时避免说话、咳嗽等产生气溶胶的行为，防止污染。

3.分离血清时避免溶血，影响实验结果。

（1）血液采集后应静置，避免剧烈晃动。

（2）离心分离时使用合适的离心力和时间，避免细胞破裂。

（3）若需进一步纯化或分析血清，应先进行离心，取上清部分。

三、常用免疫学技术操作规程

（一）细胞培养技术

1.**细胞复苏**

(1)将冻存细胞置于37℃水浴中快速解冻。

（1）取含细胞的冻存管，在超净工作台中或手套箱内，迅速置于37℃水浴锅中，轻轻摇晃或旋转，观察管内物质逐渐融化（通常需5-10分钟）。

（2）避免直接火焰加热冻存管。

(2)加入预温培养基，轻柔吹打混匀。

（1）向融化后的细胞中加入预先在37℃预热并含血清的完全培养基，使用枪头轻柔吹打，确保细胞完全悬浮。

（2）切勿剧烈涡旋，以免损伤细胞。

(3)移至培养皿，37℃、5%CO₂条件下培养。

（1）将细胞悬液转移至合适的培养容器（如T25培养瓶）。

（2）确保培养箱状态正常，CO₂浓度和湿度符合要求。

2.**细胞传代**

(1)用胰蛋白酶消化细胞，观察贴壁情况。

（1）待细胞生长至80%-90%汇合度时，弃去旧培养基。

（2）加入含0.25%胰蛋白酶的消化液（通常含EDTA），置于37℃培养箱中消化，期间可在显微镜下观察细胞变圆、脱落。

（3）消化时间根据细胞类型调整（通常5-20分钟），避免过度消化导致细胞死亡。

(2)加入培养基终止消化，用吸管吹散细胞。

（1）当细胞大部分变圆时，迅速加入适量完全培养基终止消化。

（2）使用细胞刮刀或吸管将细胞从瓶壁刮下或吹散。

(3)计数细胞密度，按1:3至1:10比例传代。

（1）使用细胞计数板和显微镜（或自动细胞计数仪）计数细胞悬液中的细胞数量和活力（台盼蓝染色法）。

（2）根据目标细胞密度，调整细胞悬液浓度，加入新的培养容器中。

（二）免疫印迹（WesternBlot）技术

1.**样本制备**

(1)细胞裂解，提取总蛋白，BCA法测定浓度。

（1）收集细胞，用预冷PBS或缓冲液洗涤去除培养基。

(2)加入细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），使用匀浆器或浴旋振荡裂解细胞。

(3)离心收集上清，使用BCA蛋白定量试剂盒测定样品蛋白浓度，用蒸馏水或缓冲液将蛋白浓度调整至合适范围（通常0.5-1mg/mL）。

(2)蛋白变性，加入还原剂及上样缓冲液。

（1）取等量蛋白样品，加入5×上样缓冲液（含β-巯基乙醇或DTT作为还原剂），100℃变性5-10分钟。

（2）冷却后上样。

2.**电泳分离**

(1)配制SDS凝胶，调整浓度梯度。

（1）根据目标蛋白分子量范围选择合适的凝胶浓度（如12%-15%）。

(2)称量丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺，溶解于去离子水中，配制凝胶溶液。

(3)加入交联剂（如TEMED），混合均匀，灌胶于模具中，插入梳子形成上样孔。

(2)将样品上样，恒压电泳约1-2小时。

（1）在电泳槽中加入电泳缓冲液（如Tris-Glycine缓冲液），将凝胶放入电泳槽中，确保样品孔在负极侧。

(2)连接电源，设定恒压（通常20-30V/cm），上样后开始电泳。

(3)根据蛋白大小和凝胶浓度，调整电泳时间，通常分离Marker所需时间较长（约1.5-2小时）。

3.**转膜与封闭**

(1)将凝胶转移至PVDF膜，甲醇预浸10分钟。

（1）取出凝胶，用甲醇浸泡PVDF膜4-5分钟，再浸泡于转移缓冲液（含甲醇）中10分钟，使膜充分活化。

(2)准备转移装置，将活化好的PVDF膜、滤纸（2-3张）、凝胶依次放置，确保膜与凝胶接触紧密。

(2)用TBST清洗，5%脱脂奶粉封闭2小时。

（1）将转移装置放入电泳槽中，加入预冷的TBST缓冲液，覆盖膜表面。

(2)4℃条件下封闭，期间可轻摇。

(3)封闭后，用TBST洗涤3-4次，每次10分钟。

4.**抗体孵育**

(1)一抗孵育（1:1000稀释），4℃过夜。

（1）将封闭液吸除，加入TBST洗涤膜3次。

(2)配制一抗工作液（根据说明书稀释，常用浓度1:1000-1:5000），加入足够覆盖膜的抗体溶液，37℃或4℃孵育过夜（建议4℃，可降低非特异性结合）。

(2)TBST清洗3次，每次10分钟。

（1）吸除一抗，用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟，以去除未结合的一抗。

(3)二抗孵育（1:5000稀释），室温1小时。

（1）用TBST洗涤膜3次。

(2)配制二抗工作液（常用羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG，根据说明书稀释），加入足够覆盖膜的抗体溶液，室温避光孵育1小时。

5.**信号检测**

(1)ECL化学发光试剂盒显色，曝光成像。

（1）用TBST洗涤膜3次。

(2)加入新鲜配制的ECL底物溶液，避光反应1-5分钟（时间取决于抗体强度和设备灵敏度）。

(3)使用化学发光成像系统（如凝胶成像仪）拍摄图像。

(2)使用灰度分析软件定量结果。

（1）使用ImageJ、QuantityOne等软件对图像进行灰度分析，测量目标条带的相对灰度值。

(2)结合内参蛋白（如β-actin）灰度值，进行标准化处理。

（三）流式细胞术（FlowCytometry）技术

1.**细胞染色**

(1)PBS清洗细胞，重悬至1×10⁶/mL。

（1）收集细胞，用预冷的PBS洗涤1-2次，去除培养基或固定液。

(2)用细胞计数板计数，用PBS将细胞浓度调整至1×10⁶cells/mL。

(2)加入荧光标记抗体，避光孵育30分钟。

（1）根据抗体说明书，计算所需抗体量，加入细胞悬液中，混匀。

(2)将细胞-抗体混合物置于冰浴或4℃避光孵育，期间可轻柔混匀。

2.**上机检测**

(1)设置细胞门，调整电压及阈值。

（1）打开流式细胞仪，进行日常开机自检