免疫学操作规程做法总结

免疫学操作规程做法总结一、免疫学操作规程概述

免疫学操作规程是指在免疫学实验或临床检测中，为确保实验结果的准确性、可重复性及操作人员的安全而制定的一系列标准化流程。本总结旨在系统梳理免疫学常用操作规程的关键步骤、注意事项及质量控制要点，涵盖样本处理、试剂准备、实验操作及结果分析等核心环节。

二、样本处理与制备

（一）样本类型与采集

1.血清样本：静脉采血，室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟分离。

2.唾液样本：晨起收集，4℃保存，12000rpm离心10分钟取上清。

3.细胞样本：外周血分离PBMC，或组织切片经固定-脱水处理。

（二）样本保存与运输

1.低温保存：液体样本-20℃或-80℃冻存，避免反复冻融。

2.运输要求：使用保温箱，样本标识清晰，运输时间≤4小时。

三、试剂准备与校准

（一）试剂配制

1.依说明书比例稀释抗体或酶标液，使用去离子水或无菌水。

2.pH调节：使用Tris-HCl或PBS缓冲液，确保pH值在6.0-7.5。

（二）仪器校准

1.酶标仪：每日校准吸光度（A）值，使用空白对照调零。

2.移液器：定期校准量程，误差≤±2%。

四、免疫学实验操作

（一）酶联免疫吸附实验（ELISA）

1.步骤：

(1)包被：96孔板加入抗体，4℃过夜。

(2)封闭：TBST洗板3次，加入封闭液，37℃孵育1小时。

(3)孵育：依次加入样本、酶标二抗，室温避光30分钟。

(4)显色：TMB显色10-20分钟，终止液终止反应。

2.注意事项：

-每步孵育后需用TBST洗涤，避免交叉污染。

-使用酶标板振荡器混匀样本。

（二）流式细胞术操作

1.步骤：

(1)细胞染色：冰台避光染色，抗体浓度≤1μg/10^6细胞。

(2)上机：加入FACS溶血素，流式管装量100-200μL。

(3)数据采集：设置门控，采集10000个事件。

2.质控指标：

-活细胞比例≥85%，荧光信号无饱和。

五、结果分析与记录

（一）数据分析

1.ELISA：使用GraphPadPrism计算OD值，绘制标准曲线。

2.流式：分析细胞亚群比例，统计学方法使用ANOVA或t检验。

（二）记录规范

1.实验日志：记录试剂批号、操作人、环境温度等关键参数。

2.异常处理：记录实验偏差及纠正措施，如样本污染需重做实验。

六、安全与废弃物处理

（一）个人防护

1.必须佩戴手套、护目镜，操作生物样本时穿实验服。

2.使用生物安全柜处理气溶胶高风险操作。

（二）废弃物分类

1.化学废弃物：锐器放入专用锐器盒，有机溶剂单独收集。

2.生物废弃物：高压灭菌后按医疗废物处理。

七、总结

免疫学操作规程的规范化执行是保障实验质量的基础。通过标准化样本处理、试剂配制及实验流程，可降低误差并提升结果可靠性。同时，严格的安全管理措施需贯穿整个实验过程，确保操作人员与环境安全。

一、免疫学操作规程概述

免疫学操作规程是指在免疫学实验或临床检测中，为确保实验结果的准确性、可重复性及操作人员的安全而制定的一系列标准化流程。本总结旨在系统梳理免疫学常用操作规程的关键步骤、注意事项及质量控制要点，涵盖样本处理、试剂准备、实验操作及结果分析等核心环节。本规程的制定基于国内外权威实验室的实践经验，并结合了常见的免疫学技术，如酶联免疫吸附实验（ELISA）、流式细胞术（FCM）、免疫荧光（IF）等，旨在为实验室工作人员提供一套完整且实用的操作指南。

二、样本处理与制备

（一）样本类型与采集

1.血清样本：

-采集方法：采用静脉采血法，推荐使用含有肝素或EDTA的抗凝管（根据后续实验需求选择）。采血量需满足实验需求，通常为3-5mL。采血后需在室温下静置30分钟至1小时，使血液充分凝固，避免溶血。

-分离方法：将采血管置于水平面上，以3000rpm离心10分钟，分离血清。血清应尽量避免与管壁接触，小心吸取上层澄清液体，避免吸到下层血细胞。

-处理方法：吸取的血清可立即用于实验，或分装后-20℃或-80℃冻存。避免反复冻融，建议首次冻存前进行过速冷冻，以减少冰晶形成对蛋白质结构的破坏。

2.唾液样本：

-采集方法：建议在晨起空腹状态下采集，使用无菌唾液收集管或吸管。指导受试者充分漱口（使用无菌水），然后含住收集管缓慢吐出唾液，直至达到预定体积（通常为1-2mL）。

-处理方法：收集后的唾液样本需在4℃条件下保存，12000rpm离心10分钟，取上清液用于实验。若需长期保存，应先分装后-20℃冻存。

3.细胞样本：

-外周血单个核细胞（PBMC）分离：

(1)抗凝采血：使用肝素抗凝管采集外周血（采血量根据后续实验需求确定）。

(2)Ficoll-Paque密度梯度离心：将外周血与等体积Ficoll-Paque溶液（密度1.077g/mL）混合后，小心缓慢倒入专用分离管中，3000rpm离心30分钟。PBMC位于血浆与Ficoll层之间，用移液器小心吸取PBMC层。

(3)洗涤：将PBMC重悬于预冷PBS缓冲液中，1000rpm离心5分钟，弃上清。重复洗涤2-3次，直至上清液无色透明。

-组织样本处理：

(1)固定：新鲜组织立即置于4%多聚甲醛溶液中固定4-6小时。

(2)脱水：依次使用梯度乙醇（30%,50%,70%,90%,100%）脱水，每次浸泡30分钟。

(3)透明：将组织置于二甲苯中透明2次，每次30分钟。

(4)浸蜡：逐级加入石蜡（50%-60%石蜡：二甲苯=1:1，60%-70%石蜡：二甲苯=1:1，70%-80%石蜡：二甲苯=1:1，80%-90%石蜡：二甲苯=1:1，90%-100%石蜡：二甲苯=1:1，100%石蜡），每次浸蜡60分钟。

(4)包埋：将组织块放入预热的石蜡模具中，置于60℃烘箱过夜，待石蜡完全凝固。

（二）样本保存与运输

1.低温保存：

-液体样本：血清、血浆、细胞培养上清等液体样本，若短期使用（1周内），可4℃保存；若长期保存（数月至数年），需-20℃或-80℃冻存。分装保存可减少反复冻融对样本造成的损伤。在冻存前应使用预冷管吸取样本，避免样本在取用过程中发生温度变化。

-细胞样本：PBMC等细胞样本应尽快处理，若需保存，建议使用细胞冻存液（含10%FBS和10%DMSO）重悬后，分装至冻存管，-80℃冻存。冻存时需缓慢降温，并可在-20℃过夜再转移至-80℃。

2.运输要求：

-样本标识：所有样本均需贴上清晰标签，包含样本编号、采集日期、样本类型、受试者信息（如适用）等。

-保温运输：对于需在4℃保存的样本，应使用带冰袋的保温箱运输，确保运输过程中温度稳定。运输时间尽量控制在4小时内，若距离较远，建议使用冷藏车或干冰（-80℃）进行运输。

-安全运输：对于生物样本，应遵守相关生物安全运输规定，使用符合标准的生物样本运输箱，避免样本泄漏造成环境污染。

三、试剂准备与校准

（一）试剂配制

1.抗体稀释：

-根据抗体说明书推荐的浓度范围，使用PBS或Tris-HCl缓冲液进行稀释。例如，ELISA检测抗体通常使用100-200ng/mL的浓度。稀释时需使用移液器精确量取抗体和缓冲液，并充分混匀。

-对于直接免疫荧光染色，抗体浓度通常为0.5-1μg/mL。稀释后需在4℃避光孵育30分钟，使抗体充分结合。

2.酶标二抗稀释：

-酶标二抗（如HRP或AP标记的二抗）的稀释浓度需根据说明书和实际实验需求确定，通常为1-5μg/mL。稀释后需在室温避光孵育30分钟。

3.底物配制：

-TMB显色液：使用无水乙醇或甲醇配制TMB底物，浓度通常为3-5mg/mL。配制后需避光保存，避免光降解。

-DAB显色液：使用去离子水配制DAB底物，浓度通常为0.1-0.3mg/mL。配制后需立即使用，避免久置后氧化失效。

（二）仪器校准

1.酶联免疫吸附仪（ELISAReader）：

-每日校准：使用空白对照（不含样本和标准品的孔）校准吸光度（A）值，确保读数在0-1.0范围内。若读数超出范围，需调整仪器增益或更换空白对照。

-波长校准：使用已知波长的标准品（如纯净水在260nm处的A值）校准仪器波长，确保读数准确。

2.移液器：

-定期校准：使用移液器校准仪对移液器进行校准，确保其量程误差在±2%以内。校准频率建议为每月一次，高精度操作时需增加校准次数。

-校准方法：使用已知密度的标准溶液（如去离子水）进行校准，记录每次校准的结果，并对超出误差范围的移液器进行维修或更换。

3.电子天平：

-定期校准：使用标准砝码对电子天平进行校准，确保其读数误差在±0.0001g以内。校准频率建议为每周一次，高精度称量时需增加校准次数。

-校准方法：将标准砝码依次放置于天平上，记录每次校准的结果，并对超出误差范围的天平进行维修或更换。

四、免疫学实验操作

（一）酶联免疫吸附实验（ELISA）

1.步骤：

(1)包被：

-将稀释好的抗体加入ELISA板中，每孔100-200μL，4℃过夜包被。包被前需用洗涤液（如TBST）洗涤ELISA板3次，每次3分钟，以去除未结合的抗体。

-包被后需用封闭液（如5%BSA或skimmilk）封闭非特异性结合位点，37℃孵育1小时。封闭前需用洗涤液洗涤ELISA板3次，每次3分钟。

(2)洗涤：每次加入洗涤液后，需使用ELISA板振荡器振荡混匀，然后以3000rpm离心5分钟，弃上清。重复洗涤3次，以去除未结合的封闭液。

(3)孵育样本：将稀释好的样本加入ELISA板中，每孔100-200μL，室温避光孵育30分钟。孵育前需用洗涤液洗涤ELISA板3次，每次3分钟。

(4)孵育二抗：将稀释好的酶标二抗加入ELISA板中，每孔100-200μL，室温避光孵育30分钟。孵育前需用洗涤液洗涤ELISA板3次，每次3分钟。

(5)显色：将TMB底物加入ELISA板中，每孔100-200μL，室温避光孵育10-20分钟。显色时间需根据样本浓度和酶活性调整。

(6)终止：将终止液（如2MH2SO4）加入ELISA板中，每孔100-200μL，立即读取吸光度值。终止液加入后需立即在酶联免疫吸附仪上读取A值，避免底物继续反应。

2.注意事项：

-洗涤一致性：每次洗涤需使用相同体积的洗涤液，并确保洗涤时间一致，以减少误差。

-孵育条件：孵育温度和时间需根据抗体说明书和实验需求确定，并保持一致性。孵育过程中需避光，以防止底物光降解。

-空白对照：每个实验均需设置空白对照（不含样本和二抗的孔），用于校正背景吸收。

（二）流式细胞术操作

1.步骤：

(1)细胞染色：

-将细胞重悬于预冷PBS缓冲液中，调整细胞浓度至1×10^6cells/mL。

-冰台避光条件下，加入适量荧光标记抗体（如CD3-PE，CD19-FITC），抗体浓度≤1μg/10^6细胞。混合均匀后，室温孵育15-30分钟。

-孵育后需用预冷PBS洗涤细胞2次，每次500μL，1000rpm离心5分钟，弃上清。

(2)上机：

-将洗涤后的细胞重悬于500-1000μL流式细胞术专用固定液（如paraformaldehyde）中，避光孵育4-8小时，以固定细胞。

-固定后需用流式细胞术专用透化液（如PBS/0.1%SDS）透化细胞膜，避光孵育15-30分钟。透化液的使用需根据细胞类型和实验需求调整。

-透化后需用流式细胞术专用封闭液（如PBS/1%BSA）封闭非特异性结合位点，避光孵育30分钟。

(3)孵育二抗（如适用）：若需检测细胞因子等可溶性蛋白，可在封闭后加入荧光标记的二抗，避光孵育30分钟。

(4)洗涤：用流式细胞术专用固定液或PBS洗涤细胞2次，每次500-1000μL，1000rpm离心5分钟，弃上清。

(5)上机采集：将细胞重悬于流式细胞术专用染料（如PI或DAPI）中，避光孵育10分钟，以对细胞进行核染色。上机前需使用流式细胞术专用上样液调整细胞浓度至1×10^6cells/mL。设置门控，采集10000个事件。

2.质控指标：

-活细胞比例：通过设置门控去除死细胞（如使用PI染色，PI阳性细胞为死细胞），活细胞比例应≥85%。

-荧光信号：检测荧光信号是否饱和，若信号饱和需降低抗体浓度或增加细胞浓度。

-细胞活力：通过台盼蓝染色或流式细胞术专用染料检测细胞活力，细胞活力应≥95%。

（三）免疫荧光（IF）操作

1.步骤：

(1)组织切片：将石蜡包埋的组织切片置于60℃烘箱过夜，待石蜡完全软化。使用切片机将组织切片成4μm厚度的切片，置于载玻片上，60℃烤片30分钟。

(2)脱蜡：依次使用梯度乙醇（100%,95%,90%,80%,70%）脱水，每次浸泡5分钟。最后用无水乙醇透明2次，每次5分钟。

(3)固定：将切片置于4%多聚甲醛溶液中固定10分钟，然后用PBS洗涤3次，每次5分钟。

(4)封闭：将切片置于含5%BSA的PBS缓冲液中封闭1小时，以封闭非特异性结合位点。

(5)孵育一抗：将稀释好的第一抗体加入切片中，4℃孵育过夜。孵育前需用PBS洗涤切片3次，每次5分钟。

(6)洗涤：用PBS洗涤切片3次，每次5分钟。

(7)孵育二抗：将稀释好的荧光标记第二抗体加入切片中，37℃孵育1小时。孵育前需用PBS洗涤切片3次，每次5分钟。

(8)洗涤：用PBS洗涤切片3次，每次5分钟。

(9)核染色：将切片置于DAPI溶液中，避光孵育5分钟，以对细胞核进行染色。

(10)洗涤：用PBS洗涤切片2次，每次5分钟。

(11)封片：将切片置于含有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，封片剂应能增强荧光信号并减少淬灭。

2.注意事项：

-脱蜡彻底：脱蜡不彻底会导致背景高，影响结果判读。可通过观察切片是否完全透明判断脱蜡是否彻底。

-抗体稀释：抗体稀释浓度需根据说明书和实验需求确定，过高或过低都会影响结果判读。

-荧光淬灭：封片剂的选择对荧光信号的稳定性至关重要，应选择高质量的抗荧光淬灭封片剂。

-透镜清洗：使用免疫荧光显微镜观察时，需使用专用镜头纸和清洁液清洗物镜和目镜，避免污染。

五、结果分析与记录

（一）数据分析

1.ELISA数据分析：

-绘制标准曲线：使用已知浓度的标准品绘制标准曲线，通常使用4个对数浓度点，计算回归方程（y=mx+b）。

-样本定量：将样本的OD值代入回归方程，计算样本的浓度。

-统计分析：使用GraphPadPrism等软件进行统计分析，如计算均值、标准差，进行ANOVA或t检验等。

2.流式细胞术数据分析：

-设门：根据细胞形态和荧光强度设置门控，去除背景噪声和死细胞。

-计算比例：计算目标细胞亚群占总细胞数的比例。

-统计分析：使用FlowJo等软件进行统计分析，如计算均值、标准差，进行ANOVA或t检验等。

3.免疫荧光数据分析：

-图像采集：使用免疫荧光显微镜采集图像，设置合适的曝光时间和增益。

-图像处理：使用ImageJ等软件进行图像处理，如调整对比度、亮度，去除背景等。

-定量分析：使用ImageJ等软件进行定量分析，如计算荧光强度、细胞数量等。

（二）记录规范

1.实验日志：每次实验均需记录实验日志，包括实验日期、实验人员、实验目的、实验方法、试剂批号、实验结果、异常情况及处理措施等。实验日志应详细记录每一步的操作细节，如抗体稀释浓度、孵育时间、洗涤次数等。

2.异常处理：实验过程中若出现异常情况（如样本污染、抗体失效等），需立即记录并采取措施处理。处理措施应详细记录，如更换试剂、重做实验等。异常情况的处理过程和结果也应记录在实验日志中。

3.数据备份：实验数据应定期备份，备份格式应统一，并标注备份日期。数据备份可防止数据丢失，确保实验结果的完整性。

六、安全与废弃物处理

（一）个人防护

1.个体防护装备：在进行免疫学实验时，必须佩戴手套、护目镜，操作生物样本时穿实验服。对于高风险操作（如细胞培养、流式细胞术等），需佩戴防护面罩和实验帽。

2.个人卫生：实验前需洗手，实验过程中避免用手接触口、鼻、眼等部位。实验结束后需彻底清洗双手。

3.环境防护：实验应在生物安全柜中进行，以避免气溶胶和飞沫污染。生物安全柜应定期清洁和消毒，确保其正常运行。

（二）废弃物分类

1.化学废弃物：

-锐器：使用专用锐器盒收集针头、刀片等锐器，避免刺伤。锐器盒装满后需按医疗废物进行处理。

-有机溶剂：使用专用容器收集有机溶剂（如乙醇、二甲苯等），避免泄漏。有机溶剂需按危险废物进行处理。

-废弃培养基：废弃培养基需先高压灭菌后，方可倒入下水道。

2.生物废弃物：

-细胞培养废弃物：细胞培养液、细胞裂解液等需先高压灭菌后，方可倒入下水道。

-组织样本：废弃组织样本需先高压灭菌后，方可按医疗废物进行处理。

3.废弃试剂：

-废弃抗体、底物等试剂需先倒入含次氯酸钠的溶液中，浸泡24小时以上，以杀灭病毒和细菌。处理后的溶液需按化学废物进行处理。

4.废弃玻璃器皿：一次性使用的玻璃器皿（如移液管、吸管等）需按医疗废物进行处理。可重复使用的玻璃器皿需先清洗后，高压灭菌。

七、总结

免疫学操作规程的规范化执行是保障实验结果的准确性和可重复性的关键。通过标准化样本处理、试剂配制、实验操作及结果分析等环节，可显著降低实验误差，提升实验结果的可靠性。同时，严格的安全管理措施和废弃物处理流程，不仅保障了操作人员的安全，也保护了环境。本总结提供了一套完整的免疫学操作规程，涵盖了常用的免疫学技术，旨在为实验室工作人员提供参考和指导。在实际操作中，应根据实验目的和实验条件，对规程进行适当的调整和优化。

一、免疫学操作规程概述

免疫学操作规程是指在免疫学实验或临床检测中，为确保实验结果的准确性、可重复性及操作人员的安全而制定的一系列标准化流程。本总结旨在系统梳理免疫学常用操作规程的关键步骤、注意事项及质量控制要点，涵盖样本处理、试剂准备、实验操作及结果分析等核心环节。

二、样本处理与制备

（一）样本类型与采集

1.血清样本：静脉采血，室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟分离。

2.唾液样本：晨起收集，4℃保存，12000rpm离心10分钟取上清。

3.细胞样本：外周血分离PBMC，或组织切片经固定-脱水处理。

（二）样本保存与运输

1.低温保存：液体样本-20℃或-80℃冻存，避免反复冻融。

2.运输要求：使用保温箱，样本标识清晰，运输时间≤4小时。

三、试剂准备与校准

（一）试剂配制

1.依说明书比例稀释抗体或酶标液，使用去离子水或无菌水。

2.pH调节：使用Tris-HCl或PBS缓冲液，确保pH值在6.0-7.5。

（二）仪器校准

1.酶标仪：每日校准吸光度（A）值，使用空白对照调零。

2.移液器：定期校准量程，误差≤±2%。

四、免疫学实验操作

（一）酶联免疫吸附实验（ELISA）

1.步骤：

(1)包被：96孔板加入抗体，4℃过夜。

(2)封闭：TBST洗板3次，加入封闭液，37℃孵育1小时。

(3)孵育：依次加入样本、酶标二抗，室温避光30分钟。

(4)显色：TMB显色10-20分钟，终止液终止反应。

2.注意事项：

-每步孵育后需用TBST洗涤，避免交叉污染。

-使用酶标板振荡器混匀样本。

（二）流式细胞术操作

1.步骤：

(1)细胞染色：冰台避光染色，抗体浓度≤1μg/10^6细胞。

(2)上机：加入FACS溶血素，流式管装量100-200μL。

(3)数据采集：设置门控，采集10000个事件。

2.质控指标：

-活细胞比例≥85%，荧光信号无饱和。

五、结果分析与记录

（一）数据分析

1.ELISA：使用GraphPadPrism计算OD值，绘制标准曲线。

2.流式：分析细胞亚群比例，统计学方法使用ANOVA或t检验。

（二）记录规范

1.实验日志：记录试剂批号、操作人、环境温度等关键参数。

2.异常处理：记录实验偏差及纠正措施，如样本污染需重做实验。

六、安全与废弃物处理

（一）个人防护

1.必须佩戴手套、护目镜，操作生物样本时穿实验服。

2.使用生物安全柜处理气溶胶高风险操作。

（二）废弃物分类

1.化学废弃物：锐器放入专用锐器盒，有机溶剂单独收集。

2.生物废弃物：高压灭菌后按医疗废物处理。

七、总结

免疫学操作规程的规范化执行是保障实验质量的基础。通过标准化样本处理、试剂配制及实验流程，可降低误差并提升结果可靠性。同时，严格的安全管理措施需贯穿整个实验过程，确保操作人员与环境安全。

一、免疫学操作规程概述

免疫学操作规程是指在免疫学实验或临床检测中，为确保实验结果的准确性、可重复性及操作人员的安全而制定的一系列标准化流程。本总结旨在系统梳理免疫学常用操作规程的关键步骤、注意事项及质量控制要点，涵盖样本处理、试剂准备、实验操作及结果分析等核心环节。本规程的制定基于国内外权威实验室的实践经验，并结合了常见的免疫学技术，如酶联免疫吸附实验（ELISA）、流式细胞术（FCM）、免疫荧光（IF）等，旨在为实验室工作人员提供一套完整且实用的操作指南。

二、样本处理与制备

（一）样本类型与采集

1.血清样本：

-采集方法：采用静脉采血法，推荐使用含有肝素或EDTA的抗凝管（根据后续实验需求选择）。采血量需满足实验需求，通常为3-5mL。采血后需在室温下静置30分钟至1小时，使血液充分凝固，避免溶血。

-分离方法：将采血管置于水平面上，以3000rpm离心10分钟，分离血清。血清应尽量避免与管壁接触，小心吸取上层澄清液体，避免吸到下层血细胞。

-处理方法：吸取的血清可立即用于实验，或分装后-20℃或-80℃冻存。避免反复冻融，建议首次冻存前进行过速冷冻，以减少冰晶形成对蛋白质结构的破坏。

2.唾液样本：

-采集方法：建议在晨起空腹状态下采集，使用无菌唾液收集管或吸管。指导受试者充分漱口（使用无菌水），然后含住收集管缓慢吐出唾液，直至达到预定体积（通常为1-2mL）。

-处理方法：收集后的唾液样本需在4℃条件下保存，12000rpm离心10分钟，取上清液用于实验。若需长期保存，应先分装后-20℃冻存。

3.细胞样本：

-外周血单个核细胞（PBMC）分离：

(1)抗凝采血：使用肝素抗凝管采集外周血（采血量根据后续实验需求确定）。

(2)Ficoll-Paque密度梯度离心：将外周血与等体积Ficoll-Paque溶液（密度1.077g/mL）混合后，小心缓慢倒入专用分离管中，3000rpm离心30分钟。PBMC位于血浆与Ficoll层之间，用移液器小心吸取PBMC层。

(3)洗涤：将PBMC重悬于预冷PBS缓冲液中，1000rpm离心5分钟，弃上清。重复洗涤2-3次，直至上清液无色透明。

-组织样本处理：

(1)固定：新鲜组织立即置于4%多聚甲醛溶液中固定4-6小时。

(2)脱水：依次使用梯度乙醇（30%,50%,70%,90%,100%）脱水，每次浸泡30分钟。

(3)透明：将组织置于二甲苯中透明2次，每次30分钟。

(4)浸蜡：逐级加入石蜡（50%-60%石蜡：二甲苯=1:1，60%-70%石蜡：二甲苯=1:1，70%-80%石蜡：二甲苯=1:1，80%-90%石蜡：二甲苯=1:1，90%-100%石蜡：二甲苯=1:1，100%石蜡），每次浸蜡60分钟。

(4)包埋：将组织块放入预热的石蜡模具中，置于60℃烘箱过夜，待石蜡完全凝固。

（二）样本保存与运输

1.低温保存：

-液体样本：血清、血浆、细胞培养上清等液体样本，若短期使用（1周内），可4℃保存；若长期保存（数月至数年），需-20℃或-80℃冻存。分装保存可减少反复冻融对样本造成的损伤。在冻存前应使用预冷管吸取样本，避免样本在取用过程中发生温度变化。

-细胞样本：PBMC等细胞样本应尽快处理，若需保存，建议使用细胞冻存液（含10%FBS和10%DMSO）重悬后，分装至冻存管，-80℃冻存。冻存时需缓慢降温，并可在-20℃过夜再转移至-80℃。

2.运输要求：

-样本标识：所有样本均需贴上清晰标签，包含样本编号、采集日期、样本类型、受试者信息（如适用）等。

-保温运输：对于需在4℃保存的样本，应使用带冰袋的保温箱运输，确保运输过程中温度稳定。运输时间尽量控制在4小时内，若距离较远，建议使用冷藏车或干冰（-80℃）进行运输。

-安全运输：对于生物样本，应遵守相关生物安全运输规定，使用符合标准的生物样本运输箱，避免样本泄漏造成环境污染。

三、试剂准备与校准

（一）试剂配制

1.抗体稀释：

-根据抗体说明书推荐的浓度范围，使用PBS或Tris-HCl缓冲液进行稀释。例如，ELISA检测抗体通常使用100-200ng/mL的浓度。稀释时需使用移液器精确量取抗体和缓冲液，并充分混匀。

-对于直接免疫荧光染色，抗体浓度通常为0.5-1μg/mL。稀释后需在4℃避光孵育30分钟，使抗体充分结合。

2.酶标二抗稀释：

-酶标二抗（如HRP或AP标记的二抗）的稀释浓度需根据说明书和实际实验需求确定，通常为1-5μg/mL。稀释后需在室温避光孵育30分钟。

3.底物配制：

-TMB显色液：使用无水乙醇或甲醇配制TMB底物，浓度通常为3-5mg/mL。配制后需避光保存，避免光降解。

-DAB显色液：使用去离子水配制DAB底物，浓度通常为0.1-0.3mg/mL。配制后需立即使用，避免久置后氧化失效。

（二）仪器校准

1.酶联免疫吸附仪（ELISAReader）：

-每日校准：使用空白对照（不含样本和标准品的孔）校准吸光度（A）值，确保读数在0-1.0范围内。若读数超出范围，需调整仪器增益或更换空白对照。

-波长校准：使用已知波长的标准品（如纯净水在260nm处的A值）校准仪器波长，确保读数准确。

2.移液器：

-定期校准：使用移液器校准仪对移液器进行校准，确保其量程误差在±2%以内。校准频率建议为每月一次，高精度操作时需增加校准次数。

-校准方法：使用已知密度的标准溶液（如去离子水）进行校准，记录每次校准的结果，并对超出误差范围的移液器进行维修或更换。

3.电子天平：

-定期校准：使用标准砝码对电子天平进行校准，确保其读数误差在±0.0001g以内。校准频率建议为每周一次，高精度称量时需增加校准次数。

-校准方法：将标准砝码依次放置于天平上，记录每次校准的结果，并对超出误差范围的天平进行维修或更换。

四、免疫学实验操作

（一）酶联免疫吸附实验（ELISA）

1.步骤：

(1)包被：

-将稀释好的抗体加入ELISA板中，每孔100-200μL，4℃过夜包被。包被前需用洗涤液（如TBST）洗涤ELISA板3次，每次3分钟，以去除未结合的抗体。

-包被后需用封闭液（如5%BSA或skimmilk）封闭非特异性结合位点，37℃孵育1小时。封闭前需用洗涤液洗涤ELISA板3次，每次3分钟。

(2)洗涤：每次加入洗涤液后，需使用ELISA板振荡器振荡混匀，然后以3000rpm离心5分钟，弃上清。重复洗涤3次，以去除未结合的封闭液。

(3)孵育样本：将稀释好的样本加入ELISA板中，每孔100-200μL，室温避光孵育30分钟。孵育前需用洗涤液洗涤ELISA板3次，每次3分钟。

(4)孵育二抗：将稀释好的酶标二抗加入ELISA板中，每孔100-200μL，室温避光孵育30分钟。孵育前需用洗涤液洗涤ELISA板3次，每次3分钟。

(5)显色：将TMB底物加入ELISA板中，每孔100-200μL，室温避光孵育10-20分钟。显色时间需根据样本浓度和酶活性调整。

(6)终止：将终止液（如2MH2SO4）加入ELISA板中，每孔100-200μL，立即读取吸光度值。终止液加入后需立即在酶联免疫吸附仪上读取A值，避免底物继续反应。

2.注意事项：

-洗涤一致性：每次洗涤需使用相同体积的洗涤液，并确保洗涤时间一致，以减少误差。

-孵育条件：孵育温度和时间需根据抗体说明书和实验需求确定，并保持一致性。孵育过程中需避光，以防止底物光降解。

-空白对照：每个实验均需设置空白对照（不含样本和二抗的孔），用于校正背景吸收。

（二）流式细胞术操作

1.步骤：

(1)细胞染色：

-将细胞重悬于预冷PBS缓冲液中，调整细胞浓度至1×10^6cells/mL。

-冰台避光条件下，加入适量荧光标记抗体（如CD3-PE，CD19-FITC），抗体浓度≤1μg/10^6细胞。混合均匀后，室温孵育15-30分钟。

-孵育后需用预冷PBS洗涤细胞2次，每次500μL，1000rpm离心5分钟，弃上清。

(2)上机：

-将洗涤后的细胞重悬于500-1000μL流式细胞术专用固定液（如paraformaldehyde）中，避光孵育4-8小时，以固定细胞。

-固定后需用流式细胞术专用透化液（如PBS/0.1%SDS）透化细胞膜，避光孵育15-30分钟。透化液的使用需根据细胞类型和实验需求调整。

-透化后需用流式细胞术专用封闭液（如PBS/1%BSA）封闭非特异性结合位点，避光孵育30分钟。

(3)孵育二抗（如适用）：若需检测细胞因子等可溶性蛋白，可在封闭后加入荧光标记的二抗，避光孵育30分钟。

(4)洗涤：用流式细胞术专用固定液或PBS洗涤细胞2次，每次500-1000μL，1000rpm离心5分钟，弃上清。

(5)上机采集：将细胞重悬于流式细胞术专用染料（如PI或DAPI）中，避光孵育10分钟，以对细胞进行核染色。上机前需使用流式细胞术专用上样液调整细胞浓度至1×10^6cells/mL。设置门控，采集10000个事件。

2.质控指标：

-活细胞比例：通过设置门控去除死细胞（如使用PI染色，PI阳性细胞为死细胞），活细胞比例应≥85%。

-荧光信号：检测荧光信号是否饱和，若信号饱和需降低抗体浓度或增加细胞浓度。

-细胞活力：通过台盼蓝染色或流式细胞术专用染料检测细胞活力，细胞活力应≥95%。

（三）免疫荧光（IF）操作

1.步骤：

(1)组织切片：将石蜡包埋的组织切片置于60℃烘箱过夜，待石蜡完全软化。使用切片机将组织切片成4μm厚度的切片，置于载玻片上，60℃烤片30分钟。

(2)脱蜡：依次使用梯度乙醇（100%,95%,90%,80%,70%）脱水，每次浸泡5分钟。最后用无水乙醇透明2次，每次5分钟。

(3)固定：将切片置于4%多聚甲醛溶液中固定10分钟，然后用PBS洗涤3次，每次5分钟。

(4)封闭：将切片置于含5%BSA的PBS缓冲液中封闭1小时，以封闭非特异性结合位点。

(5)孵育一抗：将稀释好的第一抗体加入切片中，4℃孵育过夜。孵育前需用PBS洗涤切片3次，每次5分钟。

(6)洗涤：用PBS洗涤切片3次，每次5分钟。

(7)孵育二抗：将稀释好的荧光标记第二抗体加入切片中，37℃孵育1小时。孵育前需用PBS洗涤切片3次，每次5分钟。

(8)洗涤：用PBS洗涤切片3次，每次5分钟。

(9)核染色：将切片置于DAPI溶液中，避光孵育5分钟，以对细胞核进行染色。

(10)洗涤：用PBS洗涤切片2次，每次5分钟。

(11)封片：将切片置于含有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，封片剂应能增强荧光信号并减少淬灭。

2.注意事项：

-脱蜡彻底：脱蜡不彻底会导致背景高，影响结果判读。可通过观察切片是否完全透明判断脱蜡是否彻底。

-抗体稀释：抗体稀释浓度需根据说明书和实验需求确定，过高或过低都会影响结果判读。

-荧光淬灭：封片剂的选择对荧光信号的稳定性至关重要，应选择高质量的抗荧光淬灭封片剂。

-透镜清洗：使用免疫荧光显微镜观察时，需使用专用镜头纸和清洁液清洗物镜和目镜，