食品毒理学化学毒物的生殖毒性专家讲座

概述生殖毒性是指外源化学物对雄性和雌性生殖功效或能力以及对后代产生不良效应。生殖毒性既能够发生于生殖细胞、受精卵、胚胎形成期，也可发生于妊娠、分娩和哺乳期。表现为外源化学物对生殖过程影响。影响人类生殖功效环境原因还包含各种化学物、电离和非电离辐射、物理原因、感染原因、生活方式以及药品应用等。第七章化学毒物生殖毒性第1页一、雄性生殖细胞发生过程精子发生过程是指精原细胞发育成为成熟精子过程。精子发生过程始于胎儿期原始生殖细胞。出生后，原始生殖细胞分化成精原细胞，后者直至青春期以前再曲细精管中处于休止状态。在青春期，在脑垂体促性腺激素作用下，开始增殖，进行有丝分裂，形成两个单倍体次级精母细胞，再经第二次成熟分裂，形成四个单倍体精子细胞，精子细胞再经过一系列形态学改变成为含有特殊形态成熟精子。随即由间质细胞包裹释放入输精管内，移入附睾后深入成熟，成为含有受精能力和活动力精子，进入精囊并在此贮存。精子发生过程是在神经内分泌精密调控下进行。第一节雄性生殖毒性第2页一、雄性生殖细胞发生过程表7-1外源化学物作用时间与精子发育阶段受作用时精子发育阶段从给药到精子成熟经历时间/周小鼠大鼠输精管和附睾内精子11～2后期精细胞23次级精细胞34～5次级精母细胞46～8初级精母细胞56～8精原细胞69第3页（一）对睾丸生精细胞影响1.棉酚长久食用粗制棉子油－睾丸生精上皮丢失－睾丸内精子、精细胞和精母细胞受损－精子细胞顶体肿胀、分离与碎裂－精子中段线粒体螺旋鞘排列紊乱、嵴目降低－经过葡萄糖和果糖代谢障碍抑制精子活力－精子降低、不育2.工业污染物二硫化碳－睾丸损害、精子生产障碍3.铅、镉、汞、锰等重金属－精子降低4.各种农药－精子降低、畸形、性功效减退二、外源化学物雄性生殖毒性第4页（二）对内分泌功效影响睾丸功效受垂体前叶分泌促性腺激素调整，而垂体分泌促性腺激素又受下丘脑产生促性腺释放激素调整。精子生成是在神经分泌精密调整和控制下进行。重金属铅可干扰下丘脑－垂体－睾丸轴正常功能，主要是影响促性腺释放激素（GnRH）释放，表现为卵泡刺激素（FSH）、黄体生成激素（LH）、睾酮含量降低。最终造成精子降低，活力减弱，性欲减退等。二硫化碳亦可造成睾酮降低、精子生成障碍等。第5页（三）对性功效和生殖功效影响外源化学物（化学毒物）假如造成生殖系统任何一个步骤异常，则表现出雄性不育，即雄性性功效障碍。如铅、镉、汞、锰等重金属。第6页（一）精子生成份析（1）精子计数－数目降低许－确定有没有毒害作用发生（2）精子形态观察－头尾部形态改变（3）精子状态分析试验－静夜pH、液化时间，精子运动能力，蛋白质、脂质和微量元素含量等－是否与外源化学物相关三、雄性生殖毒性检测方法（二）精子穿透试验即精子体外受精试验，是检测精子在体外能否成功穿透去透明带金黄地鼠卵子而受精试验，为综合评价外源化学物对人类精子受精能力影响、探明雄性不育提供科学依据。第7页（三）睾丸中标志酶活性测定临床和动物试验中常检测乳酸脱氢酶同工酶x、山梨醇脱氢酶、6－磷酸葡萄糖脱氢酶改变，并结合精子生成过程中各阶段细胞功效和形态学改变，即可评价外源化学物生殖毒性，并有可能探明毒性作用部位和机理。（四）体外试验体外试验主要是将哺乳动物生殖细胞在体外条件下进行培养，并与受试外源化学物接触，观察生殖细胞改变。经过支持细胞和间质细胞等体外分离培养，测定支持细胞乳酸含量和乳酸脱氢酶活性改变以及测定间质细胞分泌雄激素含量来判断外源化学物是否对所培养细胞功效有影响。亦可分离上述细胞，经过细胞计数和形态学检验方法来判断。第8页（五）雄性激素检测雄性生殖系统不论生精过程、精子成熟过程，还是从属性腺分泌活动，都需要有足够睾酮，经过检测FSH、LH和睾酮含量改变来判断外源化学物是否对雄性生殖产生影响。检测上述三种性激素含量有利于生殖毒性评价以及生殖毒作用机制探讨。（六）显性致死试验显性致死试验是经过给予雄性动物受试化学物，将其与未经受试物处理雌性动物交配，观察雌性动物早期胚胎死亡情况，以评价受试物是否对雄性动物生殖有损害作用试验。本方法系采取哺乳动物进行试验，较靠近人体实际情况，主要观察指标为胚胎早期死亡，即观察子宫中活胎、死胎及吸收胎等书目，易于观察，试验技术轻易掌握，不需要复杂试验条件。缺点是不够灵敏。第9页（七）雄性生殖细胞遗传毒性检测传统检测方法：小鼠睾丸染色体畸变分析试验、小鼠精子畸变分析试验、黑腹果蝇染色体性阴性分析试验新方法：单细胞凝胶电泳试验（彗星试验）原理：细胞在体内和体外试验中受化学物作用后，DNA链发生断裂。将细胞制成单细胞混悬液，在载玻片上制备加有受检细胞混悬液凝胶，载碱性条件下使细胞裂解，解旋DNA后进行电泳。带负电荷DNA断裂端由阴极向阳极迁移。DNA经EB染色后在荧光显微镜下可观察到DNA受损细胞核拖一条尾巴，呈彗星状，如DNA无损伤则见圆形核。（八）雄性生殖毒性病理检验睾丸、附睾、前列腺已经精囊重量和大小改变常是接触有害化学物显著特征。睾丸组织易受外来化学毒物侵害，所以在亚慢性或慢性动物毒性试验中，睾丸组织形态检验是一项主要观察指标。解剖观察是生殖病理检验主要步骤，是雄性生殖毒理学研究中不可缺乏较为敏感指标和主要伎俩。第10页一、雌性生殖细胞发生过程雌性生殖系统由卵巢、输卵管、子宫和外生殖器等组成。卵泡（包含卵细胞、包裹颗粒细胞和膜细胞）发育是一个连续改变过程，普通可分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡四个阶段。卵巢周期性改变育动情周期亲密相关。初级卵母细胞深入成熟并发育至次级卵母细胞，需垂体下叶分泌FSH和LH作用。第二节雌性生殖毒性第11页（一）对卵细胞影响研究表明，卵细胞发育到排卵前阶段即第一次减数分裂终变期和中期对化学毒物最敏感。如镉，NIH雌性小鼠皮下一次注射氯化镉1、3、6mg/kg后，排卵能力显著受抑制，排卵数目随剂量增加而降低，呈显著剂量－反应关系。镉可能直接进入到卵细胞内并损伤其遗传物质。镉－－金属硫蛋白中Zn2+二硫化碳不但对各种动物睾丸有毒性作用，而且对雌性动物性腺、胚胎也有损害作用，可影响卵巢，使动物动情周期发生改变，受孕能力降低，影响受精卵和胚胎正常发育。……二、外源化学物雌性生殖毒性第12页（二）对内分泌功效影响卵巢功效和生殖周期受体内内分泌系统调整，即经过下丘脑－垂体－性腺轴。外源化学物可影响上述任何一个步骤而对雌性生殖产生损害作用。苯及其同系物在一定剂量下会造成雌性生殖功效损害，该类化学物直接干扰下丘脑，作用于垂体－卵巢系统，使内分泌调整系统异常，而造成月经异常，同时抑制卵巢功效使绝经期改变。林丹、开蓬等有机氯农药，可使雌性动物阴道开启和排卵周期延迟，甚至停顿排卵，以及死胎和自然流产等。（三）其它毒性作用亦可表现在子代，造成畸形、死胎、功效发育不全等。各种生殖功效毒性作用在整个生命过程不一样阶段都可出现，这充分说明雌性生殖毒性复杂性。第13页三、雌性生殖毒性检测方法（一）体外试验（书上表7-2）体外试验对于说明化学毒物毒性作用机理含有重要意义。但当前尚不能完全替换整体动物试验。（二）动物试验整体动物试验仍为主要评价方法，惯用方法有两类：一类为一代繁殖试验或多代繁殖试验和致畸试验；另一类为三阶段生殖试验。（三）其它辅助试验雌性动物动情周期观察、排卵观察、雌激素水平测定、病理组织学测定等。第14页第三节致畸试验能引发妊娠人或试验动物产生畸胎外源化学物称为致畸物。它经过胎盘直接作用于发育胚胎和胎儿而产生后果。经过动物试验和体外致畸试验方法，可检测外源化学物能否引发胚胎毒性或后代畸形。第15页一、动物致畸试验（1）（一）基本原理致畸试验是检验受试外源化学物能否经过妊娠母体引发毒性或后代畸形动物试验。经过致畸试验能够确定一个受试物是否含有致畸作用。胚胎在器官形成期，可因受到化学物或放射性物质作用，使细胞分化、器官形成和正常发育收到阻滞，以致出现胎仔器官器质性缺点而展现畸形。所以，能够经过观察妊娠母体在敏感期接触受试物后胚胎及胎仔发育情况来评价某种外源化学物有没有致畸作用。第16页一、动物致畸试验（2）（二）基本方法（1）动物选择－参考毒性试验中选择动物普通标准及妊娠期较短而一致、产仔数多、胎盘结构与人类靠近、自发畸形率较低－－大鼠＋小鼠/家兔（2）动物交配处理（3）剂量分组（关键）－要求出最大无作用剂量以及引发致畸阈剂量、且要保持母体生育能力（4）动物剖检－预期分娩前1～2d处死母体（防自食）（5）胎仔检验（三）结果判定方法在致畸试验结果评定时，主要计算畸胎总数和畸形总数。在计算畸胎总数时，每一活胎仔出现一个或一个以上畸形均作为一个畸胎。在计算畸形总数时，同一胎仔出现一个畸形作为一个畸形计算，出现两种或两个畸形，则作为两个畸形计算，依这类推。第17页二、体外致畸作用试验体外致畸试验方法很多，主要有体外全胚培养、器官培养和细胞培养三个层次试验。体外致畸试验优点是：1）能够节约大量人类和时间，方法快速；2）可利用人类血清、尿液进行试验，便于直接观察受试物对接触人群作用；3）可利用单加氧酶或线粒体等酶观察外源化学物在体内代谢转化过程对其致畸作用以及发育毒性影响；4）轻易严格控制试验条件，有可能排除母体中一些其它干扰因子和母体对致畸原影响，有利于致畸作用剂量探讨。第18页第四节繁殖试验繁殖试验目标在于了解外源化学物对机体整个生殖过程以及对子代是否产生毒性作用。经过繁殖试验即可了解外源化学物对动物性功效、交配行为、受精能力、分娩、授乳等过程影响。第19页一、试验方法（1）（一）试验动物多项选择取健康刚断乳大鼠。每组用20只雌鼠，10只雄鼠。（二）染毒剂量及分组设对照组、高剂量组（为90d或长久毒性试验最大无作用剂量）、低剂量组（能够采取最大无作用剂量1/30或人类可能摄入量100倍）。必要时增设中间剂量组。接触路径与人类实际接触路径相同。（三）试验步骤试验动物按设计剂量先给予受试物90d，性成熟后即可按常规方式交配，所生仔鼠为第一代（F1）。每代交配两次，第一次生仔（F1a）断乳后10d再使亲代进行第二次交配，生仔为（F1b）。即第一代为F1a和F1b。其余各代依这类推。第20页二、观察指标（1）交配指数（2）受精指数（3）受孕率（4）正常分娩率（5）活产率（6）妊娠率（7）出生存活率（8）哺乳存活率三、结果判定将试验组动物各项观察指标统计结果与对照组动物进行比较，乳试验动物在交配、妊娠、幼仔存活、幼仔发育（培育）等方面收到影响，则说明受试物对动物繁殖功效有损害作用。第21页第五节胚胎毒性－胎儿动脉管畸形研究方法（1）胚胎毒性作用指外源化学物对母体子宫内发育胚胎或胎儿产生毒性作用。由外源化学物引发胚胎毒性详细表现在以下几个方面：（1）胚胎死亡（危害最大）（2）生长发育迟缓（3）胎儿先天缺点和畸形（危害大，研究重点）（4）功效发育不全第22页第五节胚胎毒性－胎儿动脉管畸形研究方法（2）胎儿动脉管是直接把胎儿肺动脉连接到大动脉辅助通路。是在母体内见不到独特血管。在胎生期内动脉管负担着主要循环作用。动脉管伴随妊娠