安宫牛黄丸微生物限度检查法适用性试验

安宫牛黄丸微生物限度检查法适用性试验目录TOC\o"1-1"\h\u中文摘要 ②1ml/皿皿1皿2皿1皿2白色念珠菌-10044364237100-200黑曲霉-1005852556692-200由表6可知，黑曲霉、白色念珠菌的实验组菌回收率均在合理范围内，因此其总数测定可采用稀释剂稀释法。2.3控制菌检查验证方法及结果记录2.3.1大肠埃希菌的检查阳性试验组：取10ml的2.2.1项下的供试液，将其加进200ml的TBS（胰酪大豆胨液体培养基）中向其添加含≤100cfu的大肠埃希菌，在30℃~35℃温度下培养18~24h取1ml的上述培养物，将其接种至100ml麦康凯液体培养基，在42℃~44℃温度下进行24~48h的培养采用划线接种法，将上述麦康凯液体培养物在麦康凯琼脂培养基平板上进行接种，并在30℃~35℃温度下进行18~72h的培养，依照大肠埃希菌检查方法继续检查。供试品对照组:取10ml的2.2.1项下供试液，将其加进200ml的TSB（胰酪大豆胨液体培养基）中以稀释液代替菌液，同阳性试验组操作。阴性对照组：为了替代2.2.1项下的供试液，取10ml稀释液操作与阳性试验组的操作方法一致，作为阴性对照。表7大肠埃希菌检查验证方法及结果记录培养温度（℃）培养时间（h）阳性试验组供试品对照组阴性对照组麦康凯液体培养基42℃~44℃24h（+）（-）（-）麦康凯琼脂培养基30℃~35℃24h（+）（-）（-）其他试验（大肠杆菌IMVC生化鉴定盒）（+）结果已检出未检出未检出由表7可知，大肠埃希菌的供试品对照组与阴性对照组的结果一致，均为阴性，阳性试验组则为阳性，因此可以采用培养基稀释法来进行对大肠埃希菌的检验。2.3.2耐胆盐革兰阴性菌阳性试验组：将2.2.1项下供试品的1：10，1：100，1：1000三个稀释级各吸取1ml至六支分别装有10ml的肠道菌增菌液体培养基管中各自加入含≤100cfu的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌各三支，在30℃~35℃温度下培养24~48h分别将其划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，在30℃~35℃温度下培养18~24h，按照耐胆盐革兰阴性菌检查方法继续检查。供试品对照组：吸取2.2.1项下的供试液，以稀释液代替菌液，按照阳性试验组的操作，进行定性试验和定量试验。阴性对照组：用稀释液代替2.2.1项下供试液，同阳性试验组的操作，在30℃~35℃温度下进行培养，作为阴性对照。表8耐胆盐革兰阴性菌的检查验证方法以及结果记录培养时间阳性试验组供试品对照组阴性对照大肠埃希菌铜绿假单胞菌肠道菌增菌液体培养基24h10-110-210-310-110-210-310-110-210-3（-）（+）（+）（+）（+）（+）（+）（-）（-）（-）紫红胆盐葡萄糖琼脂平板24h10-110-210-310-110-210-310-110-210-3（-）（+）（+）（+）（+）（+）（+）（-）（-）（-）结果已检出已检出未检出未检出由表8可知，耐胆盐革兰阴性菌的供试品对照组与阴性对照组的结果一致，均为未检出，阳性试验组则为已检出。由此可知，耐胆盐革兰阴性菌的检验可以采用常规法。2.3.3沙门菌阳性试验组：将10g供试品加入300ml的TSB（胰酪大豆胨液体培养基）中加入含≤100cfu的沙门菌，在30℃~35℃下培养18~24h吸取0.1ml上述培养物接种至10mlRV沙门菌增菌液体培养基，在30℃~35℃下培养18~24h，吸取少量上述培养物于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，采用划线接种法，在30℃~35℃下培养18~24h，按照沙门菌的检查方法继续检查。供试品对照组：取10g供试品加入300ml的TSB（胰酪大豆胨液体培养基）中将菌液用稀释液代替，按照阳性试验组的同样操作，培养温度为30℃~35℃，作为供试品对照。阴性对照组：将菌液用稀释液代替同阳性试验组的方法操作，培养温度为30℃~35℃，作为阴性对照。表9沙门菌检查验证方法及结果记录阳性试验组供试品对照组阴性对照组胰酪大豆胨液体培养基（24h）（+）（-）（-）RV沙门菌增菌液体培养基（24h）（+）（-）（-）木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（24h）（+）（-）（-）三糖铁琼脂培养基（24h）（+）（-）（-）其他试验（沙门氏菌生化鉴定盒）（+）结果已检出未检出未检出由表9可知，沙门菌的供试品对照组与阴性对照组的结果相同，均为未检出，阳性试验组则为已检出。综上所述，沙门菌的检验可以采用培养基稀释法检验。3.讨论从中国药典2005年版[1]开始，药品微生物限度检查由微生物限度检查方法验证发展至微生物限度检查方法适用性试验，无论在称呼还是方法两方面都更适合于对品种方法的确认，从而建立符合要求的方法。此外，现用培养基与前两部药典相比，拥有更高的灵敏度[4]。2015年版的大肠埃希菌的检查方法为对耐胆盐格兰阴性菌检查，其包含的范围更大，而且培养基的选择以及产气导管的取消都更有利于观察结果。沙门菌检验也从以往的只需对含动物成分进行检验改为对所有含药材原粉制剂均实行控制，要求更严格了。本安宫牛黄丸的制作需要用到11味中药材，其中包括：水牛角浓缩粉、牛黄、人工麝香、黄芩、朱砂、雄黄、黄连、栀子、郁金、珍珠、冰片，为具有抑菌活性的药品。根据2015版《中国药典》，当药品中含有抑菌成分的时候，我们可以采取下列方法去除样品的抑菌活性[1]：一、加入中和剂或灭活剂，二、增大稀释液，三、采用薄膜过滤法，四、上述3种方法的联合使用等等。通过以上方法的应用，药品真实的微生物污染情况[2]才能更真实地反映出来，同时还能够检验药品的抑菌作用是否有效去除，以及所使用的去除的方法对污染菌生长检出的影响。本实验通过对安宫牛黄丸（大蜜丸）进行需氧菌、霉菌、酵母菌以及控制菌的微生物检查方法验证，用空白对照以及条件对照的方法得出结论。这两种方法的结合既可以排除因安宫牛黄丸中存在抑菌成分从而对检测结果造成的影响，又可以达到更准确地得到该检验方法是否恰当的结果。针对需氧菌总数测定，本实验运用了稀释剂稀释法。对于霉菌和酵母菌的总数测定，同样运用了稀释剂稀释法。此外，控制菌检查中的大肠埃希菌则应用了培养基稀释法检验；常规法检验则适用于耐胆盐革兰阴性菌；沙门菌采用培养基稀释法检验。由以上实验结果表明，针对安宫牛黄丸（大蜜丸）的微生物采取的检查方法都证实有效。除此之外，此种微生物限度检查方法还可以为其他含有抑菌成分的大蜜丸的微生物限度检查法适用性试验提供借鉴。不过，在日常的生产中，安宫牛黄丸（大蜜丸）在微生物限度检查中也常常出现假阳性的结果。原因为安宫牛黄丸（大蜜丸）属于非无菌口服固体制剂，可能发生由于非目的菌的生长而导致的霉菌和酵母菌总数不符合限度标准的情况。原因有三点：一、药材原粉存在于安宫牛黄丸（大蜜丸）中，二、其原辅料生产及炮制工艺、包装、储藏和给药途径等有高浓度的需氧菌（一般都在104cfu/g以上）存在[11]，其容易在普通SDA上生长，导致霉菌和酵母菌总数超出限度，三、2015年版《中国药典》微生物限度检查中计数法的适用范围发生了改变［1］，微生物的促生长能力在SDA和TSA的帮助下得以提高，同时也扩大了计数微生物的类型和范围［10，4］，供试品的霉菌和酵母菌总数为SDA上生长的总菌落。因此，在这种情况下就容易出现假阳性的结果。这时候我们就可以选择使用选择性培养基或者其他添加适量抗生素的SDA［9］来建立检查方法，从而避免假阳性结果的产生，能够反映产品真实的霉菌和酵母菌污染状况。4.结论一、需氧菌总数测定：稀释剂稀释法；二、霉菌和酵母菌总数测定：稀释剂稀释法；三、大肠埃希菌测定：培养基稀释法；四、耐胆盐革兰阴性菌测定：常规法；五、沙门菌测定：培养基稀释法检验。参考文献[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：140-151.人民卫生出版社.[2]莫小林，伍小燕，韦振源，等.10种中药制剂微生物限度检查法的建立与标准操作探讨[J].西北药学杂志，2008，23（6）：384-386.[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社,2005.[4]由亚宁，陈雪芹，周志云，等.2005年版中国药典和欧洲药典菌落计数培养基比较[J].中国药事，2010，24（6）：587-590[5]王永智,吴宏斌,邱文娜等.人工牛黄微生物限度检查方法适用性实验[J].医药导报,2019,38(3):380-383.[6]田青.略述安宫牛黄丸临床应用[J].中国中医药现代远程教育,2009,7(11):202-204.[7]谢锴标,陈震尧,邱新华,谢德秋,陈海阳.八种医院中药制剂微生物限度检查方法的研究[J].中国当代医药,2019,26(09):7-12.[8]刘静.安宫牛黄丸的临床应用进展[J].现代中医药,2019,39(04):142-146.[9]吴幼玲．几种沙氏培养基真菌生长情况比较［J］.海峡预防医学杂志，2014，20(4):46-47[10]徐伟东，许华玉，范一灵，等．胰酪胨大豆培养基和改良马丁培养基的微生物促生长能力考察［J］.中国药品标准，2013，14(4):271-275[11]杨晓东，刘兴文．中药丸剂的染菌途径与防控措施分析［J］．中国药业，2011，20(22):92-93致

谢

光阴似箭，大学即将划上一个句号，而于我的人生只是一个冒号，我将开启全新的篇章。四年的求学生涯在师长、亲友的大力支持下，收获颇丰，在论文即将付梓之际，思绪万千，心情久久不能平静。回想论文攥写期间，我的导师司徒颖治学严谨，学识渊博，思想深邃，视野雄阔，为我营造了一种良好的精神