DB15∕T 2995-2023 牧草中抗坏血酸的测定 邻苯二胺荧光法

ICS65.020.01

CCSB04

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内蒙古自治区地方标准

DB15/T2995—2023

牧草中抗坏血酸的测定

邻苯二胺荧光法

Determinationofascorbicacidinforagegrass

o-phenylenediaminefluorometry

2023-05-11发布2023-06-11实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2995—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。

本文件起草单位：中国农业科学院草原研究所、内蒙古自治区农畜产品质量安全中心、乌海市农畜

产品质量安全中心、锡林郭勒盟农牧业科学研究所、阿拉善盟农畜产品质量安全中心。

本文件主要起草人：王文曦、吴洪新、云颖、康博洋、盈盈、刘宇宁、湖日尔、张燕东、赵丽君、

刘鹏斌、李润航、朝鲁孟、刘江英、刘洪林、卫媛、降晓伟、赵志惠、李坤娜、李薇、付慧。

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DB15/T2995—2023

牧草中抗坏血酸的测定测定

邻苯二胺荧光法

1范围

本文件规定了新鲜牧草中的抗坏血酸邻苯二胺荧光光度的测定方法。

本文件适用于新鲜牧草中抗坏血酸的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T14699.1饲料采样

GB/T20195动物饲料试样的制备

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

试样L(+)-抗坏血酸经活性炭氧化为L(+)-脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺反应生成有荧光的喹唔啉，

其荧光强度与L(+)-抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定试样中L(+)-抗坏血酸总量。

5试剂和材料

冰乙酸(CH3COOH)：浓度约为30%。

偏磷酸(HPO3)n：含量(以HPO3计)不小于38%。

乙酸钠(CH3COONa)。

硼酸(H3BO3)。

邻苯二胺(C6H8N2)。

酸性活性炭粉：称取约200g活性炭粉（75μm～177μm），加入1L盐酸（1+9），加热回流

1h～2h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110℃～120℃烘箱中干燥10h，备用。检验

铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将20g/L亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如

有铁离子则产生蓝色沉淀。

偏磷酸-乙酸溶液：称取15g偏磷酸,加入40mL冰乙酸及250mL水，加温，搅拌使之逐渐溶解，

冷却后加水至500mL于4℃冰箱可保存7d～10d。

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乙酸钠溶液(500g/L)：称取500g乙酸钠，加入水溶解至1000mL，冷却后，储存于聚乙烯瓶中。

硼酸-乙酸钠溶液：称取3g硼酸，用500g/L乙酸钠溶液溶解并稀释至100mL，临用时配制。

邻苯二胺溶液(200mg/L)：称取20mg邻苯二胺，用水溶解并稀释至100mL，临用时配制。

抗坏血酸标准品：抗坏血酸（C6H8O6）纯度不小于99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准

物质。

抗坏血酸标准储备液（1000μg/mL）：准确称取适量的抗坏血酸标准物质，用偏磷酸-乙酸溶液

（5.7）溶解并配制成（1000μg/mL）的标准储备液，该贮备液在2℃～8℃避光条件下可保存一周。

抗坏血酸标准工作液：抗坏血酸标准工作液(100.0μg/mL):准确吸取抗坏血酸标准液10.0mL，

用偏磷酸-乙酸溶液（5.7）稀释至100mL，临用时配制。

水为GB/T6682规定的二级水。

6仪器和设备

荧光分光光度计：具有激发波长338nm及发射波长420nm。配有1cm四通比色皿。

分析天平：感量0.01mg和0.01g。

组织匀浆机。

7试样制备

按照GB/T14699.1中有关规定采集样品，去杂质后充分混匀，按照GB/T20195制备试样，新鲜样品

利用四分法取样后，充分破碎作为分析样品。制备好的试样及时检测。

8测定步骤

提取

称取试样5g～10g（精确至0.01g，取样量视含量而定）于100mL的玻璃烧杯中，用偏磷酸-乙酸

溶液（5.7）将其转至100mL的容量瓶中，定容至刻度，摇匀，为样液，另吸取10.0mL抗坏血酸标准工

作液（5.13）于100mL的容量瓶中，定容至刻度，摇匀，为标准液，将样液和标准液分别全部转移至200

mL具塞锥形瓶中，加入2g活性炭（5.6），用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其

余全部滤液，即为试样氧化液和标准氧化液，待测定。

测定

8.2.1分别准确吸取5.00mL试样氧化液于两个50.0mL容量瓶中，作为“试样液”和“试样空白液”。

8.2.2分别准确吸取5.00mL标准氧化液于两个50.0mL容量瓶中，作为“标准液”和“标准空白液”。

8.2.3于“试样空白液”和“标准空白液”中各加2.5mL硼酸-乙酸钠溶液（5.9），混合摇动15min，

用水稀释至50.0mL，在4℃冰箱中放置2h～3h，取出待测。

8.2.4于“试样液”和“标准液”中各加2.5mL的500g/L乙酸钠溶液（5.8），用水稀释至50.0mL，

待测。

标准曲线的制定

准确吸取标准液氧化液[L(+)-抗坏血酸质量浓度10μg/mL]0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、

分别置于10mL具塞刻度试管中,用水补充至2.0mL。另准确吸取“标准空白液”2.0mL于10mL带盖刻

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DB15/T2995—2023

度试管中。在暗室迅速向各管中加入5.0mL邻苯二胺溶液（5.10），振摇混合，在室温下反应35min，

于激发波长338nm、发射波长420nm处测定荧光强度。以“标准液”系列荧光强度分别减去“标准空白

液”荧光强度的差值为纵坐标，对应的L(+)-抗坏血酸质量浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算直线回

归方程。

试样的测定

分别准确吸取2.0mL“试样液”和“试样空白液”于10mL具塞刻度试管中，在暗室迅速向各管中

加入5.0mL邻苯二胺溶液（5.10），振摇混合，在室温下反应35min，于激发波长338nm、发射波长420

nm处测定荧光强度。以“试样液”荧光强度减去“试样空白液”的荧光强度的差值于标准曲线上查得

或回归方程计算测定试样溶液中L(+)-抗坏血酸总量。

平行实验

按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。

注：整个测定过程应在避光条件下进行。

9结果计算和表示

试样中抗坏血酸含量X按式（1）计算：

C×V100

X=×퐹×………………(1)

m1000

式中：

X——试样中L(+)-抗坏血酸的总量，单位为毫克每百克（mg/100g）；

C——待测样液中L(+)-抗坏血酸的质量浓度，单位为微克（μg）；

V——荧光反应所用试样体积，单位为毫升(mL)；

F——试样溶液的稀释倍数；

100——换算系数；

M——实际检测试样质量，单位克(g)；

1000——换算系数。

结果用2次平行测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字