DB1302∕T 523-2020 平菇原生质体再生复壮技术规程

ICS65.020.20

CCSB39

DB1302

唐山市地方标准

DB1302/T523-2020

平茹原生质体再生复壮技术规程

2020-12-28发布2021-01-10实施

唐山市市场监督管理局发布

DB1302/T523-2020

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由唐山市农业农村局提出并归口。

本文件起草单位：唐山师范学院。

本文件主要起草人：范永山、武秋颖、张运峰、张淑红、高凤菊、石洪凌、李艳梅、商艳朝、李蕊、

张春刚、倪玉杰、徐树杰、史晓贤、韩靖琳、刘海英。

I

DB1302/T523—2020

平茹原生质体再生复壮技术规程

1范围

本文件规定了平菇原生质体再生复壮的术语和定义、人员和设备、出发菌株制备、再生复壮、再生

菌株筛选和稳定性检测。

本文件适用于平菇（Pleurotusostreatus）原生质体再生复壮。白灵菇（Pleurotusferulae）和杏鲍菇

（Pleurotuseryngii）等其它食用菌的原生质体再生复壮可参照执行。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T23189平菇

NY/T528食用菌菌种生产技术规程

NY/T2375食用菌生产技术规范

LS/T6132粮油检验储粮真菌的检测孢子计数法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

出发菌株

种性退化或缺失需要复壮的原始菌株。

3.2

原生质体

脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞。

3.3

原生质体再生菌株

经过原生质体再生获得的遗传性状稳定的菌株。

3.4

原生质体再生复壮

从原生质体再生菌株群体中筛选出恢复或超过出发菌株原有优良性状的技术。

4人员和设备

4.1人员

熟悉基本微生物操作，充分掌握安全操作规范。

1

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4.2实验室

应符合BSL-1实验室的要求。GB19489-2008中6.1给出了建设BSL-1实验室的条件。

4.3设备

4.3.1超净工作台：无菌风的纯度≤0.5个/皿时(φ90mm培养平皿)，风速可调。

4.3.2高压蒸汽灭菌器：温度控制在121℃±0.5℃。

4.3.3恒温培养箱：温度控制在22℃~28℃。

4.3.4光学显微镜：放大倍数100~400倍。

4.3.5离心机：转速控制在2500r/min。

4.4试剂和培养基

4.4.1稳渗剂：0.6mol/L甘露醇，用无菌水配制；121℃±0.5℃高压蒸汽灭菌20min。

4.4.2细胞壁降解液：2.0%溶壁酶液，用稳渗剂配制，0.22μm微孔滤膜过滤。现配现用。

4.4.3PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL。

4.4.4原生质体固体再生培养基：蔗糖20g，蛋白胨5g，琼脂15g，稳渗剂1000mL；121℃±0.5℃高

压蒸汽灭菌20min。

5出发菌株制备

5.1来源

来自种性退化的人工栽培平菇子实体或菌种。人工栽培平菇应符合GB/T23189的规定，平菇菌种

应符合菌种质量要求。GB19172给出了菌种质量要求。

5.2制备过程

将子实体组织或菌种菌丝接种至PDA培养基中，恒温培养箱中培养7d，产生大量生长旺盛的菌丝

即获得出发菌株。接种过程在超净工作台中进行，所用试验材料和器具需提前进行消毒或灭菌。获得出

发菌株后立即开始原生质体制备。

6再生复壮

6.1原生质体制备

6.1.1制备过程

6.1.1.1挑取出发菌株幼嫩菌丝球至1.5mL离心管内，加入1.0mL稳渗剂，2500r/min离心10min，

弃上清液，重复洗涤3次，滤纸吸干菌丝球表面多余液体，用天平称取菌丝湿重。

6.1.1.2每0.1g菌丝加入1mL细胞壁降解液，混匀，在35℃下水浴加热酶解2.5h。

6.1.1.3用孔径48μm的细胞筛过滤酶液，除去残留菌丝。

6.1.1.42500r/min离心2min，弃上清液，沉淀加入适量稳渗剂，重复洗涤2次，获得原生质体悬液。

6.1.2观察和计数

利用光学显微镜观察原生质体悬液，按LS/T6132的规定进行原生质体计数，计算原生质体悬液

的浓度（个每毫升）。

2

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6.2原生质体再生

取0.5mL浓度为1.0×105~1.0×107个每毫升原生质体悬液均匀涂布在原生质体再生固体培养基

上，25℃恒温培养至长出单菌落。

6.3再生菌株培养

将再生过程中产生的单菌落分别在PDA培养基上单独培养2~3代，选择各代培养时菌丝和菌落形

态均一致的单菌落作为再生菌株。再生菌株应单独编号保存，不能与其它再生菌株混杂。

7再生菌株筛选

7.1按NY/T528制备菌种，考察再生菌株和出发菌株菌丝长势、长速、抗杂菌能力等。

7.2按NY/T2375制作出菇菌棒，考察再生菌株和出发菌株发菌时间、满袋天数、抗病性等。

7.3按NY/T2375进行出菇试验，考察再生菌株和出发菌株农艺性状、品质、产量等；综合菌丝和子

实体生长与产量结果，筛选出恢复或超过出发菌株原有优良性状的再生菌株。

8稳定性检测

8.1按NY/T2375进行生产栽培中试，进一步考察筛选的再生菌株优良性状稳定性。

8.2选择表现稳定且优于当前主栽品种的再生菌株，用于生产。