植物组织培养 （第四版）课件 项目5 植物组织培养快繁技术

项目五植物组织培养快繁技术目录任务一植物组培快繁流程任务二植物组培快繁试验方案的设计与实施任务三植物组培快繁过程中的异常现象及解决措施任务四植物无糖组培技术任务五试管开花教学目标【知识目标】1.掌握植物组织培养快繁流程；2.理解植物组织培养快繁实验设计方案；3.掌握组培快繁中出现的异常问题及解决措施；4.了解植物无糖组培新技术；5.了解试管开花新技术。【知识目标】1.能设计筛选和优化组培快繁方案;2.会组培苗的继代增殖和炼苗移栽;3.会分析、解决组培过程中污染、褐变和玻璃化问题。教学目标任务一植物组培快繁流程初代培养继代培养生根培养炼苗移栽方案设计一、初代培养

初代培养是指接种后最初的几代培养。目的是获得无菌材料和无性繁殖系。

带芽茎段细胞分裂素直接成苗

形成愈伤组织直接产生不定芽易变异兰花及部分球根植物产生的胚外植体表面细胞形成的类似于合子胚外植体短枝型胚状体原球茎不定芽1．外植体发育途径顶芽和腋芽发育不定芽的发育原球茎的发育缩短的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官。兰科植物大蒜体细胞胚胎发生过程1.具有两极性；2.胚状体的维管组织与外植体的维管组植物解剖结构上的联系；3.胚状体的维管组织的分布是独立的“Y”形；4.数量多，速度快，结构完整，成苗率高。胚状体形成植株的特征培养基诱导或分化培养基。培养基中CTK多，生长素少。2．培养基选择二、继代培养概念：将初代培养产物重新分割，接种到新鲜培养基上进一步扩大培养的过程。影响继代增殖的因素植物材料培养基培养条件继代周期继代次数草本〉木本被子植物〉裸子植物幼材〉老材胚〉营养组织芽〉胚状体〉愈伤激素积累培养温度培养一代时间三、壮苗生根培养◆生根培养基：1/2或1/4MS基本培养基；不加或少加CTK，适量添加NAA；糖浓度1-1.5%。◆培养条件：增加光强，达3000-10000lx，自然光则有利于木质化。①在含IAA类培养基中直接培养。②移入含IAA类的生根培养基培养。③生根困难的则在培养基中搭滤纸桥④其它方法生根方法

延长增殖培养时间。降低增殖倍率，减少CTK用量。对易生根植物，切割粗壮嫩枝在营养钵中直接生根。胚状体发育成小苗不经生根阶段，但需壮苗生根。四、炼苗移栽高温且恒温

高湿

弱光

无菌1、试管苗生态环境与自然环境的差异试管苗的特点生长细弱，角质层不发达光合作用差叶片气孔数少，活性差根吸收功能弱2、炼苗目的：提高试管苗的适应性，促其健壮，最终提高移栽成活率。原则：

从温、光、湿度及有无杂菌等因素考虑。

驯化开始数天内，与培养环境条件相似；

后期与预计栽培条件相似，逐步适应。方法：不开口自然光下2-3天，然后开口1-2天。思考：还有没有其它炼苗方法？3、移栽草炭珍珠岩蛭石（1）基质准备（2）穴盘准备（3）基质上盘（4）组培苗洗涤培养基洗净、勿断根、勿断茎，多菌灵浸泡。（5）移栽（6）管理温：高恒→变温光：弱→强湿：高湿→低湿无菌：无→有营养：异养→自养任务二组培快繁实验方案的设计与实施文献检索预备试验参观咨询最佳组培

方案筛选

正交试验文献检索◆植物的学名、品种名、商品名◆此种植物组培的相关报道◆重点收集分析的技术信息◆外植体取样时间与外植体类型◆诱导、继代、生根培养基配方◆培养条件（温度、湿度、pH值等）◆移栽驯化条件及基质配比收集、分析的技术信息针对某些关键因素简单拟定试验方案，粗略判断某因素是否有影响及影响程度、剂量的大致范围。预备试验

L4(23)正交表

正交试验L8(27)正交表

正交试验L9(34)正交表

L16(45)正交表

L16

(45)正交表正交表的代号试验方案形成的处理数试验因子的作用剂量水平数（可容纳的水平数）试验因子数（列号数）L16(45)诱导苹果生根正交试验结果一、单因子试验二、多因子试验三、逐步增减法四、广谱试验法常用的实验方案基本培养基：1/2MS激素：IBA（0.1、0.3、0.5、1.0mg/L）处理1、1/2MS+IBA0.12、1/2MS+IBA0.33、1/2MS+IBA0.54、1/2MS+IBA1.0

2种激素5种浓度的试验组合6－BA（mg/L)A1A2A3A4A5

NAA（mg/L)B1B2B4B3B5B1A1B1A2B1A3B1A4B1A5B2A1B2A2B2A3B2A4B2A5B3A1B3A2B3A3B3A4B3A5B4A1B4A2B4A3B4A4B4A5B5A1B5A2B5A3B5A4B5A52种激素5种浓度的试验组合ⅡNAA（mg/L)6－BA（mg/L)低中高

低中高低低

低中

低高中低

中中

中高高低

高中

高高筛选最佳有机营养添加量和最佳激素配比时常用此法。增加增加减少减少逐步增减法无机盐有机物生长素细胞分裂素无机盐有机物生长素细胞分裂素

LMHLMHLMHLMH81个试验处理LMHLMHLMHLMH筛选出最好的试验处理试用不同类型的生长素和细胞分裂素筛选出最佳组培配方广谱试验法

筛选及使用最佳组培应注意的问题找准主导影响因子是关键。试验有重复，试材数量大于30，每处理10瓶，每瓶3块培养物。试材须在相同培养上继代培养3代以上，才能保证试验结果可靠。最佳培养基配方长期使用后，应视培养物的表现适当调整或校正。讨论组培最佳培养方案筛选方法各有何优缺点？实验的实施预备实验正式实验观察记录结果分析分析资料确定主因素选择合适的试验方法采集不同阶段的实验数据采用合理方法进行统计分析？思考在植物生长过程中会出现死苗、生病等现象。在组织培养过程中会遇到什么情况呢？产生原因是什么呢？他们会产生什么样的后果呢？怎么样解决呢？任务三组培过程中的异常现象及解决办法一、污染及其预防措施培养基表面有细菌生长，芽已经死亡。培养基表面长出绒毛状物质，干燥，各种颜色，这是霉菌。材料死亡。1.概念在培养过程中，培养基或培养材料上滋生真菌、细菌等微生物，使培养材料不能正常生长和发育的现象。2.污染原因从病原菌来说，有两种：（1）细菌表面湿润黏稠，1-2d表现。2.污染原因（2）真菌表面干燥、绒毛。3-5d表现。从病原菌来说，有两种：从传染途径来看：2.污染原因：（1）培养基、接种工具灭菌不彻底；（2）材料表面灭菌不彻底；（3）环境不洁净；（4）培养容器破损；（5）超净工作台过滤装置失效；（6）没有按照无菌操作规程进行3.污染的预防措施（1）灭菌要彻底；（2）选择适当的外植体；选择幼嫩材料尽量选择室内预培养套袋（3）外植体表面灭菌要彻底；可以采用多种药品交替灭菌：如：酒精升汞间歇灭菌：第一次灭菌到下一次灭菌时间间隔24h，连续灭菌三次以上。（4）环境要经常消毒；甲醛熏蒸、酒精（来苏尔）喷雾、紫外照射等。（5）超净工作台要定期检查；（6）要严格无菌操作；洗手换工作服、戴口罩酒精降尘手、桌面消毒外植体灭菌铁架子、剪刀、镊子灭菌取无菌纸接种二、褐变及其防治措施1.定义：指在组织培养过程中，培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也随之慢慢变褐而死亡的现象。2.褐变的作用机理

外植体切口处，一些酚类化合物裸露出来，被多酚氧化酶氧化形成褐色醌类化合物，醌类化合物又会在酪氨酸酶的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，引起其他酶系统失活，导致组织代谢紊乱，生长受阻。（1）基因型；（2）外植体的生理状态；（3）取材时间和部位；（4）培养基；（5）光照；（6）温度；（7）培养时间。3.影响褐变的因素4.褐变的防治措施（1）选择适当的外植体；（2）外植体预处理；（3）筛选合适的培养基和培养条件；（4）添加抗氧化剂和吸附剂；（5）连续转移。三、玻璃化现象及其预防措施在植物组织培养过程中，叶片和嫩稍呈透明或半透明水浸状的培养物。玻璃化苗的特点与发生原因：（1）玻璃化苗的特点：植株矮小肿胀、失绿，叶片皱缩易碎；叶表面少角质层，没有功能性气孔，有海绵组织无栅栏组织；含水量高；吸收营养与光和功能不全，分化力低，生长缓慢；生根难。（2）发生原因：碳、氮代谢和水分发生生理性异常引起。干物质积累少。影响玻璃化苗产生的因素（1）生长调节剂：细胞分裂素浓度偏高。（2）温度：高温；变温。（3）湿度：容器内透气性差，湿度大。（4）消毒方法：消毒时长时间的浸泡。（5）光照时间：光照不足和高温。（6）培养基：琼脂用量。（7）继代次数：继代次数越多，细胞分裂素在体内积累越多。控制和克服玻璃化苗的措施（1）降低培养基中细胞分裂素和赤霉素浓度，添加低浓度多效唑、矮壮素等；（2）控制好温度和湿度；（3）改善培养瓶的通气状况；（4）适当增加琼脂浓度；（5）减少氮化合物用量；（6）增加自然光照；（7）减少继代次数。任务四植物无糖组培技术植物无糖组织培养技术，又称为光自养微繁殖技术，是指在植物组织培养中以CO2代替糖作为植物体的碳源，通过控制影响组培苗生长发育的环境因子，促进植株光合作用，以更接近植物自然生长状态、成本相对较低的方式生产优质种苗的一种植物组织培养技术。任务四植物无糖组培技术这一技术概念是在1980年提出的，其技术发明人是日本千叶大学的古在丰树教授。20世纪90年代以后，这一技术成为植物微繁殖研究的新领域，受到广泛的关注，无糖组织培养技术也在各国开始得到推广应用。CO2代替了糖作为植物体的碳源

在有糖培养中，植物以糖作主要碳源进行异养或兼养生长。而无糖培养以CO2作为植株的唯一碳源。环境控制促进植株的光合速率

无糖培养技术是在对培养容器内环境控制的基础上，根据容器中植株生长所需的最佳环境条件（如光照强度、CO2浓度、环境湿度、温度、培养基质等）来对植株生长的微环境进行控制，最大限度地提高小植株的光合速率，促进植株的生长。

使用多功能大型培养容器

无糖培养在培养过程中不使用糖及各类有机物质，极大地避免了污染的发生，可以使用各种类型的培养容器，小至试管大至培养室。

多孔的无机材料作为培养基质

无糖培养采用多孔的无机物质，如蛭石、珍珠岩、纤维、Florialite作为培养基质，可以极大地提高小植株的生根率和生根质量

无糖培养采用的是闭锁型的培养室，通过人工或自动调控整个培养室环境，能周年进行稳定的生产。闭锁型培养室

一、无糖组培的特点任务四植物无糖组培技术二、植物无糖组培关键技术①无糖培养室的设计②无糖培养的容器序③无糖培养的基质④无糖培养室内的CO2供给系统⑤植物生长调节剂植物无糖组培关键技术三、具体实例三、具体实例三、具体实例四、有糖组培与无糖组培的区别上海离草科技有限公司名称型号单价(元)单位数量(套)备注无糖培养系统LC-PA1601680套1包含培养盒4个，供气系统、过滤系统等配件.CO2控制器LC-CO2023000套1含二氧化碳控制器、减压阀、电磁阀CO2供给系统LC-SHLC014500套1含双CO2钢瓶、供气管道、CO2报警器、双瓶气瓶柜。任务五试管开花