植物组织培养 （第四版）课件 项目1、2 植物组织培养及其原理、植物组织培养的实验条件

植物组织培养

(第四版）

PlantTissueCulture课程目录项目一植物组织培养及其原理2学时项目二

植物组织培养的实验条件4学时项目三植物组织培养的基本技术4学时项目四植物器官培养技术2学时项目五植物组织培养快繁技术4学时项目六植物脱毒技术4学时项目七综合技能训练8学时项目八植物组培苗工厂化生产与经营2学时项目九植物组织培养与植物育种4学时项目十植物细胞培养与次生代谢产物生产4学时项目十一植物种质资源离体保存与人工种子2学时共计40学时项目一植物组织培养及其原理教学目标知识目标掌握植物组织培养的概念、类型及应用理解植物组织培养的基本原理和特点了解植物组织培养的发展教学内容任务一植物组织培养的概念、类型及特点任务二植物组织培养的基本原理任务三植物组织培养的发展任务四植物组织培养的应用任务一植物组织培养的概念、类型及特点一、植物组织培养的概念二、植物组织培养的类型三、植物组织培养的特点一、植物组织培养的概念（一）什么是植物组织培养1.含义植物组织培养（PlantTissueCulture），是指在无菌和人工控制的环境条件下，将植物的胚胎、器官、组织、细胞或原生质体培养在人工培养基上，使其再生发育成完整植株的技术。又称植物无菌培养、离体培养、试管培养或植物克隆技术。无菌一、植物组织培养的概念2.主要特征（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。（4）打破了正常的植物发育过程和格局(非正常过程）；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。污染一、植物组织培养的概念（二）什么是外植体1.含义外植体（Explant）指在组织培养中，从活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官等。2.主要包括胚胎：幼胚、成熟胚等器官：根、茎、叶、花、果实、种子等组织：分生组织、形成层、薄壁组织等细胞：体细胞（叶肉细胞、根尖细胞等）、性细胞原生质体：除去细胞壁二、植物组织培养的类型（一）按培养材料分类（二）按培养方式分类（三）按培养过程分类（一）按培养材料分类培养材料植株培养培养胚胎培养器官培养组织培养细胞培养原生质体培养（一）按培养材料分类（二）按培养方式分类1.固体培养2.液体培养（三）按培养过程分类1.初代培养（Primaryculture）对外植体进行的第一次培养，称为初代培养。2.继代培养（Subculture）将培养一段时间后的外植体或产生的培养物转移到新鲜培养基中继续培养的过程，称为继代培养。三、植物组织培养的特点特点培养材料来源广，遗传性状一致条件人工控制，材料周年生长生长快，繁殖率高管理方便，利于自动化控制任务二植物组织培养的基本原理一、什么是植物细胞全能性二、植物的生活史三、植物细胞全能性的实现细胞全能性的实现与利用1958年，美国植物学家斯图尔德等人，用胡萝卜韧皮部的组织块进行离体培养，得到了完整的植株，并且能够开花结果。胡萝卜肉质根的组织培养示意图成熟的胡萝卜植株胡萝卜肉质根薄片胡萝卜试管苗胚状体发育离体培养这个实验能证实植物细胞具有生长发育的全能性吗？一、什么是植物细胞全能性（一）植物细胞的全能性的含义任何生活的植物细胞，只要有完整的膜系统与细胞核，就拥有一整套发育成一个完整植株的遗传基础，并具备发育成完整植物体的（潜在）能力，即细胞全能性（totipotent)。潜在全能性的原因：在于基因表达的选择性。1958年以来实验已反复证实，无论是体细胞，还是性细胞，离体之后在一定的培养条件下都有可能像受精卵一样发育成一个完整的植株。一、什么是植物细胞全能性（二）细胞全能性的表达能力主要取决于细胞所处的发育状态和生理状态特化细胞（筛管、导管细胞）厚壁细胞（木质化细胞）薄壁细胞形成层细胞生长点细胞受精卵不同分化程度细胞其全能性表达能力强弱不同植物组织培养的主要任务人工条件下实现细胞全能性的这一过程，就是植物组织培养。植物组织培养的主要任务：用人为的方法创造出一个适宜于生长发育的理想条件，使细胞的全能性得到充分发挥。二、植物的生活史胚性细胞（EC）：保持着未分化状态和旺盛的分裂能力的一类细胞，这类细胞彼此相似、细胞核大、细胞质浓稠、细胞间无间隙，主要分布于胚及各种顶端分生组织中。分化：细胞在形态、结构和功能上发生永久性的适度变化的过程。早期胚胎发育受精卵合子胚分化组织植物体形成构成器官三、植物细胞全能性的实现要把植物细胞的全能性变为现实，必须要满足两个条件：一是细胞要与完整植株分离二是给予适宜的培养条件营养激素外界条件细胞全能性的实现与利用组织分裂分化细胞分裂已分化组织细胞脱分化分裂再分化器官植株三、植物细胞全能性的实现（一）脱分化已失去分裂能力的成熟细胞回复到分生状态，并进行分裂形成未分化的细胞团的过程。又称去分化。通常，会产生愈伤组织。（二）再分化由已脱分化的细胞再次分化产生各种不同类型的分化细胞的过程。再分化过程有两种方式，即器官发生方式与胚状体发生方式。器官脱分化愈伤组织再分化组织植物体外植体形成构成植物体分离（一）脱分化1.愈伤组织（callus）原指植物受伤后于伤口表面形成的一团薄壁细胞。在组培中，指植物细胞经过脱分化不断增殖，形成的一团不规则、具有分生能力而无特定功能的薄壁组织。愈伤组织培养的应用：长期保存，悬浮培养，大规模生产有用化合物，细胞培养筛选无性系，原生质体培养等。胚形成愈伤组织根部出现愈伤组织2.愈伤组织的形成（1）诱导期特征：细胞内的合成代谢迅速进行，但是细胞的大小仍然和外植体时一样，没有多大改变。（2）分裂期特征：生理生化上分裂期的一个明显特征是外层细胞进行分裂，而中间的细胞不分裂。另外还有细胞数目增加，体积变小；细胞核和核仁增到最大等。（3）分化期特征：细胞的伸展和分裂处于平衡，故细胞的平均大小往往没有变化。（二）再分化1.器官发生方式不定根脱分化愈伤组织再分化不定芽外植体转管再生植株（二）再分化1.器官发生方式小麦愈伤组织诱导与器官发生途径愈伤组织芽分化再生苗（二）再分化1.器官发生方式细胞愈伤组织芽根再生植株脱分化再分化高生长素(2,4-D)高(生长素/细胞分裂素)低(生长素/细胞分裂素)（二）再分化2.体细胞胚胎发生方式有的不需要经过愈伤组织，而是直接产生胚状体。胚状体（体细胞胚）：在植物组织培养中，由非合子细胞（如体细胞或性细胞，区别于合子胚），经胚胎发生和胚胎发育过程（区别于无融合生殖胚）而形成的类胚结构。在该途径中，细胞增殖发育极类似于受精卵：受精卵→合子→原胚→球形胚→心形胚→鱼雷形胚→子叶期胚→再生植株脱分化愈伤组织再分化胚状体外植体再生植株魔芋胚状体（二）再分化2.体细胞胚胎发生方式植物细胞全能性的实现有些植物可以通过两条途径获得再生植株，有些植物只能通过一条途径获得再生植株。成熟细胞形成体细胞胚胎分生细胞多细胞团完整植株形成芽和根等器官脱分化再分化分裂器官发生再生植株与胚状体再生植株的区别器官发生再生植株胚状体再生植株分化初期只有单极性，芽分化或根分化分化初期具有两极性，有胚根和胚芽两极不定芽和不定根与愈伤组织的维管组织相连胚状体维管组织与外植体维管组织不相连无胚胎形态，分生中心直接分化出器官具有典型的胚胎形态发生过程不定芽的苗无子叶形成的幼苗具有子叶先长芽后生根、先长根后形成芽或不同部位分化形成芽和根根芽齐全，不经历诱导生根阶段任务三植物组织培养的发展一、探索阶段二、奠基阶段三、迅速发展阶段一、探索阶段20世纪初～30年代中期1838-1839年，德国科学家M.J.Schleiden和T.Schwann等发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。1902年，德国植物学家G.Haberlandt（哈布兰特）根据细胞学说，提出单个细胞的植物细胞全能性理论。并进行了细胞培养试验，提出了激素作用理论和看护培养设想。故后人称之为“植物组培之父”。一、探索阶段20世纪初～30年代中期1904年，Hanning最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。1922年，Knudson采用胚培养法获得大量兰花幼苗。克服其种子发芽困难的问题。1925年，Laibach亚麻种间杂交幼胚培养得到杂种。1933年，李继侗和沈同用加有银杏胚乳提取液的培养基成功培养银杏胚。玉米成熟胚的培养二、奠基阶段20世纪30年代中到50年代中1934年，White用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。1939年，White、Gautheret、Nobecourt培育出连续生长的培养物（分裂、生长、但不分化），并通过实验确定了B族维生素、生长素的重要作用，建立起了一套比较经典的培养方法与培养基。被后人誉为“植物组织培养的奠基人”。1943年，White出版了《植物组织培养手册》专著。二、奠基阶段20世纪30年代中到50年代中1951年，Skoog、崔瀓通过实验发现腺嘌呤可以促进愈伤组织生长，并诱导芽的形成。→直接导致了对激动素（kinetin）的发现。1957年，Skoog、Miller提出了激素调控理论，认为根与茎的分化与Cyt/IAA的比例关系有关。使得人为控制培养物分化方向成为可能。1958年，英国科学家Steward等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，不但首次使细胞全能性理论得到证实，而且为组织培养的技术程序奠定了基础。二、奠基阶段50年代比较重要的成果还有：1952Morel染毒大丽花→脱毒植株，建立起了茎尖分生组织培养脱毒技术。1954Muir首次成功培养了单细胞，并首次尝试了“看护培养”。1958Wickson提出了快繁的初步设想，后来被发展成一系列技术广泛用于生产。1959Reinert、Steward发现了胚状体，找到了再分化的另一途径。三、迅速发展阶段20世纪60年代以来年份事件内容1960年Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功1960年Kanta在植物试管受精研究中获得成功1960年Morel利用茎尖培养获得脱毒兰花，形成了“兰花产业”1962年Murashige和Skoog发表了MS培养基的成分1964年Guha等在毛叶曼陀罗花药培养中由花粉诱导得到单倍体植株1967年Bourgin等通过花药培养获得了烟草的单倍体植物1970年Power等首次成功实现原生质体融合1970年Carlson通过离体培养筛选得到了烟草生化突变体1971年Takebe等首次由烟草原生质体获得了再生植株三、迅速发展阶段年份事件内容1972年Carlson等通过原生质体融合首次获得了烟草种间体细胞杂种1974年Kao等建立原生质体的高Ca2+、高pH的PEG融合法1978年Melchers等将番茄与马铃薯进行体细胞交杂获得了第一个属间杂种1978年Murashige提出“人工种子”的概念1982年Zimmermann开发了原生质体的电融合法1983年Zambryski等采用农杆菌介导法转化烟草，首次获得转基因植物1984年Paskowski等利用质粒转化烟草原生质体获得成功1985年Horsch等建立了农杆菌介导的叶盘法1987年Sanford发明了基因枪法用于单子叶植物的遗传转化1983至今相继获得水稻、棉花、玉米、小麦、大麦、番茄等转基因植株三、迅速发展阶段在组培发展史上，我国科学家作出了多方面的贡献。早期的李继侗、罗宗洛、罗士伟、崔瀓等人都作了很多有价值的工作。进入70年代以后，我国科学家在原生质体培养以及花药培养做出了举世公认的重要成绩，得到了世界同行的普遍重视和赞赏。任务四植物组织培养的应用一、快速繁殖植物种苗二、培养植物脱毒苗木三、培育植物新品种四、生产次生代谢产物五、保存和交换植物种质资源六、促进生物科学植物遗传、生理、生化和植物病理的研究一、快速繁殖植物种苗快繁技术商业性应用始于20世纪70年代。离体快繁可在较短时期内迅速扩大植株的数量，在合适的条件下每年可繁殖出几万倍，乃至百万倍的幼苗。植物组培快繁技术在我国应用广泛，到目前为止已报道有上千种植物的快速繁殖获得成功，包括观赏植物、蔬菜、果树、大田作物及其他经济作物。蝴蝶兰组培快繁二、培养植物脱毒苗木自20世纪50年代发现采用茎尖培养方法可除去植物体内的病毒以来，脱毒培养就成为解决病毒危害的主要方法之一。脱毒苗恢复了原有优良种性，生长势明显增强，整齐一致。马铃薯组培脱毒快繁三、培育植物新品种单倍体育种花药、花粉培养等缩短育种周期胚胎培养体细胞杂交筛选细胞突变体植物遗传转化甘蓝型油菜游离小孢子培养四、生产次生代谢产物利用发酵技术大规模培养植物组织或细胞，可以高效地生产出蛋白质、糖类、药物、香料、生物碱、色素等天然化合物。细胞培养生产次生代谢产物五、保存和交换植物种质资源通过抑制生长或超低温贮存的方法离体保存植物种质，可节约大量的人力、物力和土地，还可挽救那些濒危物种。人工种子在自然条件下能够像天然种子—样正常萌发、生长，它可为某些稀有和珍贵物种的繁殖和保存提供新的手段。人工种子六、促进生物科学植物遗传、生理、生化和植物病理的研究植物组织培养推动了植物遗传、生理、生化和病理学的研究，已成为这些领域中的常规方法之一。如利用花药和花粉培养获得的单倍体和纯合二倍体植株是研究细胞遗传的理想材料；用单细胞培养研究植物的光合代谢；用单细胞或原生质体培养快速鉴定植物的抗病性、抗逆性等。中国组培现状组培快繁：蝴蝶兰、大花惠兰等花卉+林木及绿化树木+中药材等组培脱毒快繁：甘蔗、草莓、香蕉、柑橘、苹果、梨、葡萄、马铃薯、甘薯等单倍体育种：小麦花培品种、水稻花培品种等生产次生代谢产物：红豆杉细胞培养生产紫杉醇等试验研究：花药培养、原生质体融合等方面居世界先进水平小结植物组织培养、外植体等含义植物组织培养技术特点材料广、人为控制、周期短、工厂化生产植物组织培养常见分类按材料、方式、过程分类植物组织培养发展简史萌芽阶段、奠基阶段、快速发展阶段植物组织培养主要应用快繁、脱毒、新品种、代谢产物、保存种质、试验研究项目二植物组织培养的实验条件教学目标知识目标掌握植物组织培养实验室的组成及其功能和主要设备理解植物组织培养实验室设计基本要求了解植物组织培养实验室安全的内容与要求技能目标能设计植物组织培养实验室会正确使用常用的各种仪器素质目标尊重科学、遵守规程、注重实践、爱惜设备教学内容任务一植物组织培养实验室任务二植物组织培养的主要设备任务三植物组织培养实验室安全任务一植物组织培养实验室植物组织培养实验室，是进行植物组织培养实验操作或组培苗工厂化生产的场所一、植物组织培养实验室的设计二、植物组织培养实验室基本组成一、植物组织培养实验室的设计一个植物组织培养实验室必须满足3个基本的需要，即实验准备、无菌操作和控制培养为确保工作的顺利进行，在选址时，应选择相对清洁、安静、远离各种污染源和交通便利的地方，并按照工作的目的和规模决定实验室的设计一、植物组织培养实验室的设计（一）一般组培室的设计一般组培室，要根据科学、高效、经济和实用的设置原则，依据实验性质和实际需要科学规划相应的实验室面积和组成，按照组培的操作流程（母液配制→培养基制备→灭菌→无菌操作→材料培养→炼苗与移栽）来进行设计和布局一、植物组织培养实验室的设计（二）组培工厂的设计组培工厂即商业性植物组织培养实验室，是进行组培苗工厂化生产的场所。一、植物组织培养实验室的设计（三）家庭组培室的设计家庭组培室即家庭植物组织培养实验室:①合理利用空间，对现有房间进行利用或改建；②家庭组培室空间不用太大，但须保证接种和培养空间的环境清洁；③培养房间最好能充分利用自然光；④可以自制或选购物美价廉的设备和用具，以降低成本。二、植物组织培养实验室基本组成二、植物组织培养实验室基本组成（一）一般组培室的基本组成一般组培室的基本组成有准备室（或称综合实验室，也可分为：药品贮藏室、洗瓶室、培养基制备室）、无菌操作室、培养室、试管苗驯化移栽温室，是植物组织培养实验所必须具备的基本条件。（一）一般组培室的基本组成1.准备室准备室也称综合实验室或化学实验室，进行一切与实验有关的准备工作。一体式设计，试验操作的各个环节在同一个大的房间内按程序完成。实验室名称主要功能基本要求药品室存放实验中所需要的各种化学药品房间清洁、干燥、通风、避光。为保证不同药品的分类存放应设有药品柜和冰箱。注意有毒及腐蚀性的药品应按规定存放，严格管理称量室称量药品房间干燥、密闭、避光。至少配备精确度为0.1mg的电子分析天平和0.1g的普通天平。同时，还应配有与天平配套的电源插座及称量台配剂室各种溶液及培养基母液配制与贮存、培养基配制房间宽敞明亮，学校实验室应保证多人同时进行操作，科研实验室房间面积不需过大，10～20m2即可。房间内设有实验台，配有冰箱、电炉（或电磁炉）、酸度计、普通天平、分装器、过滤装置、水浴锅等设备，进行母液、培养基或其他溶液配制时需要的各种烧杯、量筒、容量瓶、刻度移液器、移液枪、培养瓶等器具及贮存柜灭菌室培养基、操作器械、培养器皿等的灭菌灭菌室面积不宜过大，一般10m2。房间配有动力电源插座，通气良好，墙壁耐湿。设有水源、水槽，高压蒸汽灭菌锅、烘箱等洗涤室器皿的洗涤、干燥与存放；实验材料的预处理与清洗房间宽敞，有水槽、排水良好，地面防滑。配有各种规格毛刷、废物桶、周转筐、晾瓶架等工具和设备1.准备室分体式设计，一般由药品室、称量室、配剂室、灭菌室和洗涤室等构成。（一）一般组培室的基本组成2.无菌操作室无菌操作室又称为接种室，是进行无菌操作的场所。为防止杂菌进入或降低进入接种室的杂菌量，一般在操作间外设置缓冲室。2.无菌操作室实验室名称主要功能基本要求缓冲室防止带菌空气直接进入接种室、出入接种室更换工作服墙壁光滑，设置平滑式推拉门，为便于观察和参观，最好用玻璃进行隔离。缓冲室门口装有风淋机，室内应安装紫外灯，放有消毒剂、工作服装、鞋、鞋架等接种室外植体的消毒、接种、培养材料的继代接种等房间密闭、洁净，墙壁光滑平整，地面平坦无缝，为避免工作人员进入时空气不产生剧烈流动，应设置平滑式推拉门。接种室的房间面积大小随生产规模大小而定，小型接种室4～5m2，大型接种室40～50m2。接种室内应安装空调器和紫外灯，放置超净工作台、臭氧发生机、电子灭菌器、接种工具、小推车或周转箱等仪器设备（一）一般组培室的基本组成3.培养室培养室是对接种后的材料进行培养的场所。如果有条件的建立和培养室相连的观察室。（一）一般组培室的基本组成3.培养室根据是否需要光照分为光照培养室和暗培养室。（一）一般组培室的基本组成3.培养室实验室名称主要功能基本要求培养室材料的培养房间要求干净，墙壁平整，地面平坦，能够通风。为达到对房间环境的温度、光照、湿度的调控和综合利用培养室空间，室内应安装空调器，配有多层培养架及日光灯、摇床、温度计、湿度计等观察室观察培养材料的生长发育与分化房间干燥，清洁，明亮。应配备显微镜、解剖镜、电子天平，还要有和仪器配套的试验台与电源（一）一般组培室的基本组成4.移栽驯化室移栽驯化室是试管苗从室内走向田间进行适应和栽培的场所，多由日光温室、智能温室、网室等组成。（一）一般组培室的基本组成4.移栽驯化室实验室名称主要功能基本要求移栽驯化室试管苗的炼苗、移栽、管理移栽驯化室的面积大小随生产规模而定，环境条件应可调控。配备有温湿度测定仪、喷雾装置、光照调节设备、各种移栽容器及基质等二、植物组织培养实验室基本组成（二）组培工厂的基本组成二、植物组织培养实验室基本组成（三）家庭组培室的基本组成家庭组培室一般面积不大，结构组成也比较简单，可以参考一般组培室的组成与功能设置，所用仪器设备可避繁就简，充分利用现有条件制作或购买一些简单的器具，甚至可以用接种箱代替接种室，培养箱代替培养室。接种箱培养箱与人工气候箱任务二植物组织培养的主要设备一、配制设备二、灭菌设备三、接种设备四、培养设备五、检测设备六、其他仪器设备一、配制设备培养基配制设备主要包括天平、量取器具、培养器皿、加热设备、分装设备和酸度计等。二、灭菌设备灭菌设备主要包括高压灭菌锅、过滤除菌装置、电热干燥箱、臭氧发生器与紫外线灯等。三、接种设备接种设备主要包括超净工作台、生物安全柜、接种器械灭菌器、接种器械和酒精灯等。三、接种设备接种接种器械和酒精灯接种工具打孔器酒精灯四、培养设备培养设备主要包括培养架、光照培养箱、人工气候箱、空气调节设备、温湿度测定仪器、照度计和恒温振荡器等。五、检测设备检测设备主要包括离心机、分光光度计、酶标仪、PCR仪、电泳仪与凝胶成像系统等。六、其他仪器设备植物组织培养实验室除上述几类设备外，还有一些仪器设备也经常使用，主要包括冰箱、水纯化装置、磁力搅拌器、显微镜和超声波清洗仪等。任务三植物组织培养实验室安全一、化学品安全二、仪器设备安全三、生物安全四、实验室废弃物处置植物组织培养实验室安全是正常开展实验和高效工厂化生产的保证，也是减少经济损失和维护财产安全的保证，更是保护操作人员生命健康和切身利益的保证。一、化学品安全（一）危险化学品的概念和分类1.危险化学品的概念（一）危险化学品的概念和分类2.危险化学品的分类一、化学品安全（二）组培实验室的危险化学品一、化学品安全（三）危险化学品的申购和使用危险化学品属于国家管制类药品，任何单位和个人都必须按照国家法定程序进行申购和使用。使用之前应认真阅读所用化学品的安全技术说明书（MSDS），了解化学品的性质，采取必要的防护措施。（三）危险化学品的申购和使用严格按照操作规程进行操作。在不影响实验结果的前提下，尽量用危险性低的物质替代危险性高的物质，减少危险化学品的用量。如，次氯酸钠代替升汞消毒，减少汞的危害。使用化学品时，不能直接接触药品、品尝药品味道、把鼻子凑到容器口嗅闻药品气味。（三）危险化学品的申购和使用一切有毒气体的操作必须在通风橱中进行，通风装置失效时禁止操作。身上沾有易燃物时，要立即处理，不得靠近明火。如，70%乙醇消毒后，要晾干双手，再点燃酒精灯进行无菌接种操作。严禁在开口容器或密闭体系中用明火加热有机溶剂，不得在烘箱内存放、烘烤易燃有机物。二、仪器设备安全（一）通风橱的安全使用通风橱是化学实验室中最常用的一种局部排风设备，主要用于排气、换气，及时排出实验操作时产生的各种有害气体以及易燃、易爆和腐蚀性物质，从而保护操作人员安全。二、仪器设备安全（二）组培实验室危险性仪器设备的使用安全1．玻璃仪器的安全使用植物组织培养实验中使用的玻璃仪器与器皿比较多，使用时要仔细检查，发现破损、破裂的要及时淘汰，统一收集处理，避免割伤。（二）组培实验室危险性仪器设备的使用安全2．高压灭菌锅的安全使用严格按照操作规程进行操作。工作前检查电源及性能是否良好，水位是否在正常范围。严禁超温、超压运行。使用时操作人员不得离开，如需离开要有专人代为看管。使用时发现有异常现象，应立即停止使用，并通知设备管理员。记录，定期校验，维修，确保设备处于完好安全工