补血益母丸治疗痛经活性成分及分子机理研究

补血益母丸治疗痛经活性成分及分子机理研究中文摘要研究背景：随着计算机科学技术的飞速发展，网络药理学在中药复方药效物质基础及作用机制探索研究中成为越来越有效的简便工具。研究目的：本文采用网络药理学方法对补血益母丸治疗痛经的作用机理进行了研究，并对其有效成分和治疗痛经的关键靶点、通路进行预测。方法：首先运用公共数据库资源以及挖掘相关文献搜寻补血益母丸化学成分，再通过实验GC-MS、LC-MS分析鉴定出62个主要化合物，利用Pharmmapper数据库预测化学成分对应的作用靶点，再以口服利用度(OB)和类药性(DL)为指标筛选出其主要活性成分；在GeneCards数据库中统计与痛经相关痛经的靶点，与补血益母丸成分靶点对照筛选出共同靶点作为研究靶点，再将共同靶点导入DAVID数据库中，获得GO富集和KEGG富集结果，利用Cytoscape3.7.2软件构建“活性成分-靶点-通路”网络图。最后通过文献挖掘验证网络图的分析结果。结果：从补血益母丸中筛选得到欧当归内酯A、黄芪皂苷I、异鼠李素、豆甾醇、羽扇豆醇、新当归内酯等30个活性成分，共涉及AKT2、MMP9、HRAS、ESR1等在内的30个痛经靶点。KEGG结果显示补血益母丸可能是通过作用于与痛经相关的中枢镇痛、激素调节、炎症等靶点蛋白或信号通路发挥药理作用。结论：该研究基于网络药理学方法初步揭示了补血益母丸治疗痛经通过多成分、多靶点、多通路发挥药效。还对关于补血益母丸治疗痛经活性成分及分子机理进行了归纳整理和综述，为进一步阐释补血益母丸治疗痛经作用机制提供一定的参考。关键词：网络药理学；补血益母丸；活性成分；治疗痛经；机制；

StudyonActiveComponentsandMolecularMechanismofBuxueYimuPillinTreatingDysmenorrheaAbstractResearchbackground:Withtherapiddevelopmentofcomputerscienceandtechnology,networkpharmacologyhasbecomeanincreasinglyeffectiveandsimpletooltostudythematerialbasisandmechanismoftraditionalChinesemedicine.ResearchObjective：Inthispaper,themechanismofBuxueYimuPillsinthetreatmentofdysmenorrheaisstudiedbynetworkpharmacologymethod,anditsactivecomponentsandkeytargetsinthetreatmentofdysmenorrheaarepredicted.Method：Firstly,thechemicalcomponentsofBuxueYimupillweresearchedbyusingpublicdatabaseresourcesandminingrelatedliterature.Then62maincompoundswereidentifiedbyGC-MSandLC-MSanalysis.Thecorrespondingtargetofchemicalcomponentswaspredictedbyusingpharmapperdatabase,andthentheoralutilizationwasusedThemainactivecomponentswerescreenedoutwithOBandDLasindicators;thetargetpointsofdysmenorrhearelatedtodysmenorrheawerecountedinthegenecardsdatabase,andthecommontargetpointswerescreenedoutastheresearchtargetpointsbycomparingwiththetargetpointsofBuxueYimupill,thenthecommontargetpointswereimportedintotheDaviddatabasetoobtaintheresultsofgoenrichmentandKEGGenrichment,andcycloscapewasused3.7.2thenetworkdiagramof"activeingredienttargetpathway"isconstructedbysoftware.Finally,theanalysisresultsofnetworkgraphareverifiedbyliteraturemining.Result：30activecomponents,suchasAngelicalactonea,astragalosideI,isorhamnetin,stigmasterol,lupanolandAngelicalactone,werescreenedfromBuxueYimupill,involving30dysmenorrheatargetsincludingAKT2,MMP9,HRASandESR1.KEGGresultsshowedthatbuxueyimupillmayplayapharmacologicalrolebyactingonthecentralpainrelief,hormoneregulation,inflammationandothertargetproteinsorsignalpathwaysrelatedtodysmenorrhea.Conclusion：Basedonthemethodofnetworkpharmacology,thisstudypreliminarilyrevealedthatbuxueyimupillcanexertitsefficacyinthetreatmentofdysmenorrheathroughmulti-component,multi-targetandmulti-channel.Inaddition,theactivecomponentsandmolecularmechanismofbuxueyimupillinthetreatmentofdysmenorrheaweresummarized,whichprovidedsomereferenceforfurtherexplainingthemechanismofbuxueyimupillinthetreatmentofdysmenorrhea.Keywords:networkpharmacology;BuxueYimupill;activeingredients;treatmentofdysmenorrhea;mechanism;

第一章文献综述1.1痛经简介妇科疾病有许多种，而在其中比较常见的疾病，痛经可以算是其中之一，它通常是指女性月经期间或前后下腹部产生痉挛性疼痛，而部分患者除了会感到痉挛性疼痛之外，可能还会伴随着头晕、恶心、腹泻、嗜睡甚至是昏厥等症状[1]。其中，生殖器官无器质性病变所引起的痛经称为原发性痛经；盆腔内器质性病变导致的痛经为继发性痛经。目前，临床对于痛经发病机制的研究尚未取得突破性进展，但通常认为神经-内分泌-免疫网络与痛经有着紧密联系。引起原发性痛经的因素有很多，前列腺素、雌激素、一氧化氮、子宫平滑肌收缩等因素都与原发性痛经症状有关；子宫腺肌病、多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症等会引起继发性痛经。1.2中医药治疗痛经的相关研究中医辨证理论提出“不通则痛、不荣则痛”。传统中医学认为痛经的发病机制不通则痛是指患者受到寒、湿等引起气血瘀阻、经血流通不畅；气血不足、肾气亏损为不荣则痛[2]。在目前中医药治疗体系的范围内，有很多治疗方法、药物可以治疗痛经，对于原发性痛经，西药主要采用非甾体类抗炎药，前列腺素合成酶抑制剂、避孕药等来治疗缓解痛经症状，但其不良反应较多。中医治疗原发性痛经的方法很多，疗效确切且副作用少。其中最常见的中药复方治疗原发性痛经主要以通调气血的药物为主，比如乌药汤、四物汤等中药。临床上还有脊椎按摩和推拿术也可有效减轻原发性痛经；还有针灸治疗等等。齐峰[3]等人对痛经大鼠进行了实验研究，给予痛经大鼠当归四逆汤，连续服用2个月经周期，发现大鼠子宫内膜前列腺素PGF2α的含量降低了，而前列腺素PGE2的含量升高了。说明当归四逆汤能降低PGF2α含量，升高PGE2含量是治疗原发性痛经的机制。陈冬梅等[4]对60例痛经(寒凝血瘀型)患者进行分组治疗，30人服用姜黄温经颗粒作为中药治疗组，30例给予布洛芬缓释胶囊为西药治疗组，结果中药组的总有效率高达90%明显优于西药治疗组。颜艳芳[5]自制了以紫石英、牡丹皮、肉桂、艾叶等药材组成的温经止痛汤，对80位痛经患者进行了分组治疗，一组40人，给予进行口服治疗，另外40人给予温经止痛汤进行治疗，温经止痛汤组患者月经前3天开始用药，服用1周；而消炎药组患者在月经第一天开始服用，两组都连续服用3个月经周。最后根据两组结果对比得知温经止痛汤治疗组疗效明显高于消炎药治疗组。且两组差异具有显著性意义(P<0.05)。以上充分说明中药治疗痛经具有临床疗效好、复发率低的优点。补血益母丸属于中药复方药，其成分复杂，涉及到的靶点蛋白众多，因此需要进一步对补血益母丸的活性成分及分子机理研究。1.3网络药理学在中医药研究中的发展及现状近年来，随着经济与计算机科学技术的发展，Hopkins在2007年初次提出网络药理学(Networkpharmacology)理论[6]。网络药理学由单基因、单靶点的传统思路发展到了多成分、多靶点以及多通路的研究，是探索研究中药复方药效物质基础和作用机制的有效工具。网络药理学是以系统生物学以及药理学范畴为基础，再把药物与靶点、疾病之间的相互作用关系运用软件进行可视化，再对构建所得到的网络图分析探讨药物的药效物质基础及作用机制[7-8]。在阐明中医药繁杂体系的过程中，网络药理学为医疗者们提供了许多新型的手段和方法，并且在找寻中医药的药效物质基础以及分子机制的实践中，该方法得到了广泛的应用，这是计算机技术以及各种数据库的联合发展应用所带动的结果。随着信息技术和临床医学的需要，网络药理学不仅在中药单味药的效物质的筛选中得以实现，而且在中药复方药的有效物质筛选中也得到了应用。Zeng等[9]人以网络药理学方法为基础，揭示了黄芪丹参复方治疗妊娠高血压综合征的药理作用机制,首先通过数据库获得化合物和疾病各自的相关靶点,然后构建化合物-疾病-靶点网络关系图,再根据富集分析结果，得知该复方药是通过多成分、多靶点、多通路治疗妊娠高血压综合征的特点,从而更深入地阐述黄芪丹参活性。韩彦琪[10]等人利用网络药理学方法，选取了元胡止痛滴丸的28个成分作为研究对象，探究出其可能通过作用于激素调节、解痉、炎症等相关的蛋白靶点和途径，从而在治疗原发性痛经中发挥作用。揭示了元胡止痛滴丸是以多种成分作用多个靶点多维调控进行治疗痛经。网络药理学是基于“药物-靶点-疾病”相互作用网络，从整体上系统、全面地观察药物对疾病网络的作用和影响，揭示药物分子协同作用于疾病的机制。本研究拟基于网络药理学筛选出补血益母丸成分作用的靶点进行分析，得出补血益母丸的活性化合物、靶点，进而构建化合物-靶点网络以及通路注释，预测补血益母丸治疗痛经的作用机制，为后期的深入研究提供参考。1.4补血益母丸治疗痛经的意义补血益母丸由黄芪、当归、益母草、阿胶、陈皮5味药材组成。临床用于补益气血，祛瘀生新，气血两虚兼血瘀证产后腹痛[11]。其中，朱敏[12]着重对补血益母丸中的主要成分益母草展开了活性成分测试，发现益母草所包含的生物碱、苯丙醇等活性成分，在活血化瘀、调经利水方面有突出作用；同时，其内包含的益母草碱对于子宫平滑肌还能够起到双向调节的作用，这对于子宫痉挛的缓解、子宫收缩的促进有积极效果。在随后的研究中，赵茄静[13]等人发现补血益母丸中阿胶的主要活性成分为粗蛋白和胶原蛋白，其中粗蛋白含量达到75.1%、胶原蛋白含量达到48.21%。阿胶主要由驴皮熬制而成，而且阿胶的应用已有几千年的历史，阿胶具有益气补血、治疗血虚的功效[14]，是调经补血的常用药材。补血益母丸中的当归是一种伞形科植物，常用于中医药，且含有多种化学成分，当归的补血活血功效都被人们熟知，药性甘、辛、温，在调经止痛、补血活血方面有较好的效果[15]。现代药理学证实了，当归还具有抑制血小板凝集、增强心血管、镇痛等多种药理作用，都对缓解痛经症状有很大的作用。补血益母丸包含的陈皮属于芸香科植物橘的干燥成熟果皮，陈皮味辛、苦、性温，能化痰止咳、健脾、利水通便。陈皮中含有着丰富的天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化等作用[16]。补血益母丸中的黄芪属于豆科植物蒙古黄芪的干燥根部分，在治疗中发挥补气升阳、益气固表的作用，《本草求真》书中对其如此形容道：“黄芪为补气诸药之最”[17]。综上所述，补血益母丸内含当归、黄芪、阿胶、益母草、陈皮5味中药材，而五味中药材都是临床用于治疗气血两虚、活血化瘀、活血调经的药材,为妇科调经之要药，补益气血、祛瘀生新、滋阴补血效果显著，对于痛经有良好的的缓解和治疗作用。因此更深层次地补血益母丸的药效物质基础及其作用机制是很有必要的,同时也对于补血益母丸的临床用药与制剂开发具有积极的意义。1.5研究目的与方法网络药理学在中药及新药研究开发中的应用越来越多，也非常便捷，网络药理学是通过在现有的中药数据库中，利用计算机虚拟筛选所有具有一定疗效的药物，在已知疗效的中药和疾病之间构建一个“药物-靶点-疾病”相互作用网络，从整体出发，系统综合地观察药物对疾病网络的作用与影响，揭示药物分子如何与疾病作用。补血益母丸是千金药业股份有限公司开发的中成药，其处方为著名药方。具有活血化瘀、益气活血的双重功效。主要用于气虚腹痛患者（产后腹痛，伴月经不停，贫血气虚，身体恢复缓慢）和妇科手术后气虚、血虚。虽然本方已开发成中成药，且补血益母丸胶囊且疗效已明确，但其化学物质基础以及作用机制却尚未有报道研究。由于补血益母丸中的各味中药具有多分子、多靶点的特点，因此采用网络药理学手段进行研究该复方药治疗痛经的活性成分及分子作用机理。为后续的药物基础研究、质量控制的改进及机理的探索提供了理论依据。1.首先运用公共数据库资源以及挖掘相关文献搜寻补血益母丸化学成分，再通过实验GC-MS、LC-MS分析鉴定出其主要化合物；2.在PubChem数据库下载化合物结构，上传至Pharmmapper数据库进行反向分子对接预测补血益母丸化学成分对应的作用靶点，在GeneCards数据库中以“dysmenorrhea”为关键词搜索统计痛经的疾病靶点，然后与补血益母丸成分靶点映射筛选出共同靶点作为研究靶点；3.把选取的活性成分、预测的作用靶点以及信号通路作为节点，在Excel中进行整合对应，导入Cytoscape3.7.2软件中构建“活性成分-靶点-通路”网络图。再将共同靶点导入DAVID数据库中，获得GO富集和KEGG富集结果，再利用clusterProfiler这个R程序包中barplot函数绘制条形图，将其结果可视化。最后，通过文献挖掘对网络药理学的分析结果进行总结验证，探究补血益母丸治疗痛经的活性成分及其作用机制。

第二章补血益母丸治疗痛经网络药理学研究2.1工作流程本研究以网络药理学方法为基础，借鉴该学科的研究思路，建立复方补血益母丸活性分子数据库，筛选出其关键的靶点蛋白，基于网络药理学以及生物信息学方法，进行网络和通路分析，预测补血益母丸发挥治疗痛经作用的分子机制，为深入开展补血益母丸机制研究提供参考，以及对痛经的治疗与相关药物的使用奠定理论基础，为补血益母丸的研究提供新的方法和思路。图1为研究分析讨论工作流程图：图1.工作流程简介2.2补血益母丸化学成分数据库的构建2.2.1补血益母丸化学成分的收集本次研究以补血益母丸为研究对象，由于提取分离得到的补血益母丸化合物数量有限，为了得到较为完整的补血益母丸物质基础。通过查阅大量文献以及借助各种数据库，收集补血益母丸中5种药材的主要化学成分建立相关化合物数据库。将检索得到的化合物称为候选化合物。益母草（Leonuri

Herba）、当归（Angelicae

Sinensis

Radix）、黄芪(Astragali

Radix)

、陈皮(Citri

Reticulatae

Pericarpium)化学成分均收集自PubChem、TCMSP和Drug公共数据库，阿胶(Asini

Corii

Colla)成分来自文献。2.2.2化学成分的收集再以补血益母丸作为实验材料，采用水蒸气提取法提取药材中的挥发性成分，再用气相色谱-质谱联用仪定性分析，得到16种化学成分；同时采用醇提法提取药材的化学成分，通过高效液相色谱串联用质谱及高分辨质谱分析技术进行定性分析，推测出了主要由益母草中的黄酮类化合物与当归、黄芪中的藁本内酯类化合物组成的50个小分子化合物。结合相关成分数据库信息，对补血益母丸的化学物质基础进行了实验分析，鉴定了其中的62个成分，为的补血益母丸药效物质发现研究奠定了基础。2.2靶点数据库的构建2.2.1化学成分小分子的准备Pubchem是一个可以进行化学结构搜索的数据库，通过运用网站进行搜索，找到与化合物相对应的2D结构，并下载它的sdf格式，得到62个小分子配体，对其进行收集整理。2.2.2反向分子对接Pharmapper数据库是一个WEB服务器，它是使用药效映射来识别药物的潜在靶点[18]。运用PharmMapper药物靶点数据库，将收集到的化学成分的sdf格式小分子配体文件导入PharmMapper，导入时将蛋白质名称与物种都限制为“人类”，同时将靶点数目限制为300，提交后记录对应小分子化合物的JOBID，等待检测结果邮件，以进行化合物靶点的收集。2.2.3靶点的收集根据检测结果得到化学成分结构对应的靶点蛋白，然后进行筛选（fitscore≥3）统计相关蛋白质和基因信息，并使用官方标志如P03372、Q06520等命名收集的蛋白质，，其中基因作为化学成分的潜在靶点。在GeneCards数据库中以“dysmenorrhea”为关键词搜索痛经的疾病靶点基因，得到与痛经相关的基因，然后与补血益母丸活性成分的潜在靶点基因映射筛选出共同靶点作为主要研究靶点。经过这一系列操作,最终得到补血益母丸活性成分治疗痛经的潜在靶点基因，进而构建靶点信息数据库。2.3靶点通路的构建DAVID数据库(/tools.jsp）是一个比较全面的生物功能、富集通路注释信息平台[20]。为了更进一步了解筛选出补血益母丸治疗痛经靶点的功能以及在信号通路中的作用，将筛选的靶点基因导入DAVID数据库，输入靶标基因名称列表选择“Homosapiens”作为物种类型，并将目标基因名称修正为（OFFICIALGENESYMBOL），选择“genelist”作为表格类型，选择背景为“Homosapiens”，最后点击“FunctionalAnnotationTool”，根据上述转化操作得到得到AnnotationSummaryResults，根据得到的结果并设定（P＜0.01）来筛选CC、BP、MF及KEGG数据，再利用clusterProfiler中R程序包barplot函数绘制GO和KEGG条形图，即可进行GO生物功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。通路分析可以揭示蛋白质相互作用网络中不同信号通路的重要性，在网络药理学中常用于分析药物作用机制。2.4网络图的构建Cytoscape3.7.2是一个可以对相关联的数据进行分析和编辑形成可视化网络的有效工具[19]，。用该软件构建“活性成分-靶点”网络图和“活性成分-靶点-通路”网络。在Excel表格中建立补血益母丸的化学成分和靶点蛋白，导入Cytoscape3.7.2软件，完成以“节点”为活性成分和靶蛋白的相关网络构建，活性成分与靶点蛋白之间的关系用“边”表示。在网络图中，节点的度值表示连接到网络中节点的路线条数，度的值越大，说明该节点在网络中的地位越重要。根据网络的拓扑性质，分析度值较大的节点，因为这些节点具有更多的连接化合物或靶点，可能在整个网络中起着关键的作用，它们很可能是治疗痛经的关键成分或靶点。

第三章实验结果与讨论3.1活性化学成分筛选通过各种数据库和文献检索共计收集到补血益母丸448个化学成分，益母草中有64个化合物，当归中有122个，黄芪中109个，陈皮中62个，阿胶中91个。采用LC-MS（高效液相色谱串联质谱及高分辨质谱分析技术）和GC-MS（气相色谱-质谱联用仪），结合相关成分数据库信息，鉴定了其中的62个化学成分。进一步对补血益母丸62个化学成分进行分析，再以口服利用度(OB)和类药性(DL)为指标筛选出其主要活性成分。取类药性（DL≥0.18）的化合物作为进一步的活性成分，再对其进行分析；由于黄芪皂苷I、阿魏酸、藳本内酯、洋川穹内脂四个属于黄芪、当归药材的主要成分，且它们的口服利用度（OB）也很高，因此也选入其中进行进一步分析。其基本信息见下表1：表1.补血益母30个主要活性成分信息表化学名分子式中文名OB%DL来源astragalosideIC17H16O5黄芪皂苷I46.790.11黄芪(+)-SyringaresinolC22H26O8丁香树脂酚3.290.72黄芪LevistolideA\o"FindallcompoundswithformulaC24H28O4"C24H28O4欧当归内酯A9.960.82当归DocosanoateC22H44O2二十二烷酸酯15.960.26黄芪lupeol\o"FindallcompoundswithformulaC30H50O"C30H50O羽扇豆醇12.120.78黄芪Riligustilide\o"FindallcompoundswithformulaC24H28O4"C24H28O4新当归内酯9.830.7当归StigmasterolC29H48O豆甾醇43.830.76当归Leonuriside

BC25H38O16益母草碱B13.370.75益母草RutinC27H30O16芦丁3.20.68黄芪LeojaponinC20H26O3益母草宁素28.050.27益母草Galeopsin\o"FindallcompoundswithformulaC22H32O5"C22H32O5半乳糖苷61.020.38益母草Leonurine\o"FindallcompoundswithformulaC14H21N3O5"C14H21N3O5益母草碱19.120.33益母草Astraisoflavan

Glucoside\o"FindallcompoundswithformulaC23H24O11"C23H24O11黄芪紫檀烷苷18.370.86黄芪LeosibiricinC22H28O7益母草琴素25.260.22益母草IsorhamnetinC16H12O7异鼠李素49.60.31益母草Ononin\o"FindallcompoundswithformulaC22H22O9"C22H22O9刺芒柄花苷11.520.78黄芪preleoheterinC20H30O4前益母草灵素85.970.33益母草7-O-methylisomucronulatolC18H20O57-O甲基异丁香酚74.690.3黄芪化学名分子式中文名OB%DL来源FormononetinC16H12O4芒柄花黄素69.670.21黄芪NobiletinC21H22O8川陈皮素61.670.52陈皮CalycosinC16H12O5毛蕊异黄酮47.750.24黄芪TangeretinC20H20O7桔红素21.380.43陈皮DaidzeinC15H10O4大豆黄铜19.440.19益母草LeonurideC15H24O9益母草苷2.60.33益母草rhamnetinC16H12O7鼠李素2.40.3益母草Astraisoflavan

GlucosideC23H24O11黄芪紫檀烷苷18.370.86黄芪NaringeninC15H12O5柚皮素59.290.21陈皮AstrapterocarpanC17H16O5黄芪紫檀烷64.260.42黄芪ferulicAcidC10H10O4阿魏酸39.560.06当归(Z)-ligustilideC12H14O2藳本内酯53.720.07当归senkyunolideC12H16O2洋川芎内酯68.20.07当归3.2潜在活性靶点的预测用韦恩图将30个活性成分的330个潜在靶点与痛经的288个靶点进行对照映射，综合后得到30个交集靶点，如图2所示。由此预测其作为治疗痛经的活性成分。根据得到的30个靶标蛋白进行分析预测得知:1.与激素调节相关的靶蛋白包括雌激素受体(ESR2)、孕激素受体（PGR），表皮生长因子受体(EGFR)；2.EGFR靶蛋白与平滑肌痉挛相关；另外发现EGFR靶蛋白还与中枢镇痛和炎症相关；表明EGFR靶蛋白作用广泛。据此推测，补血益母丸可能通过与平滑肌痉挛、激素调节、抗炎和中枢镇痛等相关靶蛋白结合起到治疗或缓解痛经的作用。下表2为30个补血益母丸潜在治疗痛经的靶点基因信息。图2.韦恩图Compound表示补血益母丸化学成分靶点；dysmenorrhea表示痛经靶点表2.补血益母丸治疗痛经的30个靶点基因信息UniProtIDProteinname靶点蛋白中文名GeneIDP37231PeroxisomeProliferatorActivatedReceptorGamma过氧化物酶体增殖激活受体PPARGP06401ProgesteroneReceptor孕激素受体PGRP09488GlutathioneS-TransferaseMu1谷胱甘肽s-转移酶Mu1GSTM1Q92731Estrogenreceptorbeta雌激素受体ESR2P0825372kDatypeIVcollagenase72kDa型胶原酶，MMP2P13501C-CMotifChemokine5C-C基序趋化因子5CCL5P14174MacrophageMigrationInhibitoryFactor巨噬细胞迁移抑制因子MIFP08473Neprilysin脑啡肽酶MMEP31751RAC-betaserinethreonine-proteinkinaseRAC-β丝氨酸苏氨酸激酶AKT2P14780Matrixmetalloproteinase-9基质金属蛋白酶-9MMP9P31749Threonine-proteinkinase苏氨酸蛋白激酶AKT1P42574Caspase3半胱天冬酶3CASP3P00533EpidermalGrowthFactorReceptor表皮生长因子受体EGFRP35968Vascularendothelialgrowthfactorreceptor2血管内皮生长因子受体2KDRQ00987E3ubiquitin-proteinligaseMdm2E3泛素蛋白连接酶Mdm2MDM2P01112GTPaseHRas酶促肾上腺皮质激素HRASP03956Interstitialcollagenase间质胶原酶MMP1P08254Stromelysin-1奥美利辛-1MMP3P28845Corticosteroid11-beta-dehydrogenaseisozyme1皮质类固醇11-β-脱氢酶同工酶1HSD11B1P05019InsulinLikeGrowthFactor1类胰岛素生长因子IGF1P09237MatrixMetallopeptidase7基质金属肽酶7MMP7Q92731Peroxisomeproliferator-activatedreceptoralpha过氧化物酶体增殖激活受体PPARAP08842Steryl-sulfatase类固醇硫酸酯酶STSP04278SexHormoneBindingGlobulin性激素结合球蛋白SHBGUniProtIDProteinname靶点蛋白中文名GenenameP15090Fattyacid-bindingproteinadipocyte脂肪酸结合蛋白脂肪细胞FABP4P14061Estradiol17-beta-dehydrogenase1雌二醇17-β-脱氢酶1HSD17B1P09211GlutathioneS-transferaseP谷胱甘肽s-转移酶PGSTP1P11362FibroblastGrowthFactorReceptor1成纤维细胞生长因子受体1FGFR1P52333Tyrosine-proteinkinaseJAK3酪氨酸受体激酶JAK3P15121Aldo-KetoReductaseFamily1MemberB醛酮还原酶家族1成员B1AKR1B13.3关键靶点功能和通路富集由GO功能富集结果得知其中分子功能（MolecularFunction）条目43条，细胞组成（CellComponent）11条，生物过程（BiologicalProcess）534条，分别有：steroidhormonereceptoractivity（类固醇激素受体），vascularsmoothmusclecellproliferation（血管平滑肌细胞增殖），negativeregulationofapoptoticprocess（细胞凋亡的负调控）等生物功能，GO富集的基因功能各自显著性较强的前十项（P＜0.01）显示见图4、5、6。图3.基因功能（GO）分析：细胞组成CC图4.基因功能（GO）分析：生物过程BP图5.基因功能（GO）分析：分子功能MF将预测出的30个作用靶点再进行KEGG通路注释,得到74条信号通路，据条件（P＜0.01）筛选与痛经相关的主要通路13条。详细信息见表3。分别有：Endocrineresistance（内分泌抗性）、Estrogensignalingpathway（激素受体信号通路）、PI3K-Aktsignalingpathway（PI3K-Akt信号通路）、VEGFsignalingpathway（VEGF信号通路）、HIF-1signalingpathway（HIF-1信号通路）等。再图4为KEGG通路富集结果。图6.KEGG通路富集分析条形图表3.补血益母丸治疗痛经的13条通路信息表ID英文名中文名Degreehsa01522Endocrineresistance内分泌抗性9hsa04915Estrogensignalingpathway雌激素信号通路8hsa04926Relaxinsignalingpathway松弛素信号通路7hsa01521EGFRtyrosinekinaseinhibitorresistanceEGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性6hsa04668TNFsignalingpathwayTNF信号通路6hsa04151PI3K-AktsignalingpathwayPI3K-Akt信号通路9Hsa04010MAPKsignalingpathwayMAPK信号通路8Hsa04015Rap1signalingpathwayRap1信号通路7Hsa04370VEGFsignalingpathwayVEGF信号通路4Hsa04012ErbBsignalingpathwayErbB信号通路4Hsa04066HIF-1signalingpathwayHIF-1信号通路4Hsa00140Steroidhormonebiosynthesis类固醇激素生物合成3Hsa04664FcepsilonRIsignalingpathwayFc信号通路33.4网络的构建与分析3.4.1“活性成分-靶点”网络图将30个补血益母丸活性成分及30个靶点，建立一个成分与靶点相互对应的Excel表，导入Cytoscape3.7.2软件中构建活性成分-靶点网络图。如图1所示，该网络图由60个节点和187条边组成，30个活性分子和30个潜在靶点作为节点，两节点之间的边代表活性化合物与靶点间的相互作用关系。其中绿色三角形节点代表靶点，红色八边形节点代表活性成分，用Cytoscape3.7.2软件的NetworkAnalysis插件分析得知：每种化合物平均与5.63个靶点相互作用，每种靶点平均与9.57个化合物相互用。这体现了补血益母丸可能是通过多成分和多靶点相互作用发挥药理作用。该网络图是按照其度（degree）大小，顺时针方向排列的，可以直观地看出排列靠前的成分分别是astragalosideI(黄芪皂苷I)、LevistolideA（欧当归内脂A）、Riligustilide（新当归内脂）。图7.补血益母丸活性成分-靶点网络图3.4.2“活性成分-靶点-通路”网络图将利用Cytoscape软件构建补血益母丸的“活性成分-靶标-通路”网络图，如图8所示。其中红色椭圆节点代表30个主要活性成分；绿色三角形节点代表靶点；青色菱形节点代表通路。该网络图是按照其度（degree）大小，顺时针方向排列的，直观地呈现了30个活性成分、30个靶标、13条作用通路之间的关联。从网络图中可以看出补血益母丸是多成分、多靶点、多通路协同调控发挥治疗痛经的特点。图8.补血益母丸活性成分-靶点-通路网络图

3.5讨论本研究首次构建补血益母丸“活性成分-痛经靶点-通路”网络图，并从多个角度探索补血益母丸治疗痛经的潜在分子机制。研究结果表明，补血益母丸可通过多成分、多靶点、多通路发挥治疗痛经的作用，为其进一步分析补血益母丸的药效物质基础及作用机制研究提供依据。研究结果显示，益母草苷、豆甾醇、异鼠李素、丁香树脂醇、黄芪皂苷I、阿魏酸、新当归内脂等30个成分为治疗痛经潜在的主要活性成分。有相关文献表明，异鼠李素属于黄酮类物质[21]。有关报道指出异鼠李素具有调节免疫反应，抗氧化等多种治疗作用，异鼠李素通过下调NF-KB通路缓解炎症反应[22]。有研究表明，astragalosideI（黄芪皂苷I）能抑制血小板聚集，降低血液粘稠度及凝固性，松弛平滑肌，起到缓解痛经的作用；还能降低血管阻力，改善血循环，可以抑制动脉血栓的形成。根据KEGG富集分析结果通路图可以发现补血益母丸作用多靶点且映射于不同通路。补血益母丸主要介导与痛经相关的通路有内分泌抗、性雌激素受体信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等通路具有显著性差异；而其中雌激素、HIF-1信号通路发挥补气养血的作用[23]。但PI3K-Akt信号通路和内分泌抗性显著性最大，表明两条通路与补血益母丸治疗痛经相关性最大，为潜在的主要活性通路。两条通路同时调节的靶点蛋白AKT2、AKT1、EGFR、HRAS、IGF1的信号传导,其中靶点蛋白AKT1、AKT2和HRAS在KEGG13条通路分析结果中排名靠前，且与化学成分也密切相关，说明在治疗痛经中起着关键作用。其中靶点蛋白HRAS属于ras家族，而其在卵巢浆液性囊肿腺癌中高表达并极少发生突变。而王萍玲[24]发现在人子宫内膜癌和卵巢癌组织中，原癌基因可直接被类固醇激素活化，且相关实验证实了抑制HRAS基因的表达，卵巢癌细胞生长会明显受到限制，由此可说明HRAS基因在卵巢肿瘤的异常增生中起着关键作用。另有报道[25]称卵巢浆液性癌可能引起痛经，两者之间存在一定联系，故推测原发性痛经的发生与靶点蛋白HRAS有关且作用机制相似。丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（AKT2）可通过磷酸化其下游分子，介导或参与细胞周期的调节、细胞生长、增殖、凋亡等多种生物学活性，从而参与肿瘤的发生、发展[26]。而补血益母丸中LevistolideA、(+)-Syringaresinol等化合物同时调节RAC-β丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（AKT2），而且这些化合物都是补血益母丸中的主要活性成分，因此推测该蛋白群可能与补血益母丸的补血活血功效相关联，进而起到治疗痛经的作用。有相关研究报道子宫收缩、供血不足导致的痛经是因为雌激素的含量增加间接促进了PGF2α的合成和释放，而PGF2α释放会引起痛经[27]。靶点蛋白ESR2编码一种雌激素受体，该雌激素受体与雌激素结合，激活血清肥大细胞，释放致痛物质[28]，而黄芪皂苷I(astragalosideI)、新当归内脂（Riligustilide）、黄芪紫檀烷（Astrapterocarpan）、益母草琴素（leosibiricin）4个化合物都同时调节雌激素受体ESR2。由此可推测,补血益母丸中活性分子可能与体内的雌激素竞争相应受体,产生类雌激素作用,但是不会增加PGF2α的合成，从而减少子宫的异常收