T-SXSL 18-2025 反刍动物用饲料饲草中氯酸盐和高氯酸盐的测定 液相色谱-串联质谱法

CCSB46团体标准Determinationofchlorateandperchlorateinruminantfeedsandfo—Liquidchromatography-Tandemmassspectro陕西省饲料协会发布T/SXSL18-2025本文件按照GB/T1.1–2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由陕西省饲料协会提出并归口。本文件起草单位：陕西秦云农产品检验检测股份有限公司、中国农业科学院饲料研究所、内蒙古英驰科技服务有限公司、陕西省农业检验检测中心、黑龙江省水产技术推广总站、青岛金久生物技术有限公司、陕西鑫诚大唐生物制药有限公司、渭南市农产品质量安全检验检测中心、内蒙古牧泉元兴饲料有限责任公司。本文件主要起草人：贺习文、谷旭、顾洪涛、李慧、刘妩妍、李智文、孙晓智、于福利、高云峰、臧明磊、汪军明、赵彩会、洪伟、张颖、许军红、朱弘、孙凯佳、吴晓红、白青、白雪。本文件为首次发布。本文件由陕西秦云农产品检验检测股份有限公司负责解释。单位：陕西秦云农产品检验检测股份有限公司。单位地址：陕西省渭南市经济技术开发区，永兴大道与建业路丁字口西南角。电话编：714000T/SXSL18-2025反刍动物用饲料饲草中氯酸盐和高氯酸盐的测定液相色谱-串联质谱法本文件规定了反刍动物用饲料饲草中氯酸盐和高氯酸盐的液相色谱-串联质谱测定方法。本文件适用于反刍动物用饲料饲草（青贮饲料、青绿饲料、精料补充料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料）中氯酸盐和高氯酸盐含量的测定。本文件氯酸盐的检出限为2.0μg/kg，定量限为5.0μg/kg；高氯酸盐的检出限为1.0μg/kg，定量限为2.5μg/kg。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理试样中的氯酸盐和高氯酸盐用甲酸甲醇溶液提取，经固相萃取柱净化后，用液相色谱-串联质谱仪测定，标准工作曲线校准，内标法定量。5试剂或材料除非另有规定，本文件所有试剂均为色谱级。5.1水：GB/T6682，一级。5.5甲酸铵：≥99.9%。5.6微孔滤膜：0.22μm，有机系。5.7微孔滤膜：0.22μm，水系。5.80.1%甲酸甲醇溶液：移取1mL甲酸于1000mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，充分混匀。5.920mmol/L甲酸铵溶液：准确称取1.26g甲酸铵（5.5）于1000mL容量瓶中，加入适量水溶解2T/SXSL18-2025后定容至刻度，充分混匀，经0.22μm滤膜（5.7）过滤后备用。5.10氯酸盐标准贮备液（1mg/mL以氯酸根（ClO3-）计，CAS:7775-09-9，购买有证标准溶液。5.11高氯酸盐标准贮备液（1mg/mL以高氯酸根（ClO4-）计，CAS:7601-89-0，购买有证标准溶5.12氯酸盐同位素内标贮备液（1mg/mL以氯酸根-18O3（ClO3-18O3）计，CAS:14866-68-3，购买有证标准溶液。5.13高氯酸盐同位素内标贮备液（1mg/mL以高氯酸根-18O4（ClO4-18O4）计，CAS:871943-52-1，购买有证标准溶液。5.14混合标准中间溶液：分别准确移取氯酸盐标准贮备液（5.8）2mL、高氯酸盐标准贮备液（5.9）1mL于同一10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，制成氯酸盐、高氯酸盐浓度分别为200.0µg/mL、100.0µg/mL的混合标准中间溶液，2℃~8℃保存，有效期为3个月。5.15混合标准工作溶液：准确移取混合标准中间溶液（5.12）1.0mL于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，制成氯酸盐、高氯酸盐浓度分别为2.0µg/mL、1.0µg/mL的混合标准工作溶液，2℃~8℃保存，有效期为1个月。5.16混合同位素内标中间溶液：分别准确移取氯酸盐同位素内标贮备液（5.10）2mL、高氯酸盐同位素内标贮备液（5.11）1mL于同一10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，制成氯酸盐同位素内标、高氯酸盐同位素内标浓度分别为200.0µg/mL、100.0µg/mL的混合同位素内标中间溶液，2℃~8℃保存，有效期为3个月。5.17混合同位素内标工作溶液：准确移取混合同位素内标中间溶液（5.14）1.0mL于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，制成氯酸盐同位素内标、高氯酸盐同位素内标浓度分别为2.0µg/mL、1.0µg/mL的混合同位素内标工作溶液，2℃~8℃保存，有效期为1个月。5.18混合标准系列工作溶液：分别准确移取混合标准工作溶液（5.13）5µL、10µL、50µL、100µL、200µL及混合同位素内标工作溶液（5.15）50µL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，配制成氯酸盐浓度为1.0ng/mL、2.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、40.0ng/mL，高氯酸盐浓度为0.5ng/mL、1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，氯酸盐同位素内标浓度为10.0ng/mL，高氯酸盐同位素内标浓度为5.0ng/mL的混合标准系列工作液，临用现配。5.19HLB固相萃取小柱（填料为二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物规格为200mg/6mL，或性能相当者，临用前用5mL甲醇活化。5.20GCB固相萃取小柱（填料为石墨炭黑）：规格为200mg/6mL，或性能相当者，临用前用5mL甲醇活化。6仪器设备6.1液相色谱-串联质谱仪（配有电喷雾电离源）。6.2分析天平：感量0.0001g和0.00001g。6.3涡旋混合器。6.4振荡器。6.5离心机：转速≥6000r/min。6.6固相萃取装置。6.7容量瓶：容量为10mL、100mL和1000mL。7样品T/SXSL18-20253按照GB/T20195的规定制备试样。选取与待测样品类型相同，均匀一致，且在待测物保留时间处仪器响应面积小于方法定量限30%的饲料样品，作为空白样品。8试验步骤8.1提取取空白样品同步试验。称取试样2g（精确至0.0001g）于50mL离心管中，准确加入50µL混合同位素内标工作溶液（5.15混匀；再准确加入0.1%甲酸甲醇溶液10mL（5.6涡旋1min，振荡提取20min，于6000r/min离心3min，上清液转入另一支洁净的离心管中，为待净化液。8.2净化8.2.1青贮饲料将5mL待净化液注入GCB固相萃取小柱（5.20）中，使用注射器活塞加压，流速不超过1mL/min，弃去约1mL初滤液，续滤液流入HLB固相萃取小柱（5.19）中，使用注射器活塞加压，流速不超过1mL/min，弃去约1mL初滤液，收集续滤液，过膜（5.6）后待测。当试样浓度超出线性范围后需重新测定。8.2.2精料补充料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料将5mL待净化液注入HLB固相萃取小柱（5.19）中，使用注射器活塞加压，流速不超过1mL/min，弃去约1mL初滤液，收集续滤液，过膜（5.6）后待测。当试样浓度超出线性范围后需重新测定。8.3测定8.3.1液相色谱参考条件a）色谱柱：AcclaimTMTrinityTMP1复合离子交换柱（100×2.1mm，3µm或性能相当者。b）流动相：A相：20mmol/L甲酸铵溶液（5.9B相：乙腈，洗脱条件见表1。c）流速：0.5mL/min。d）柱温：35℃。e）进样量：10μL。表1梯度洗脱条件时间（min）0.03.0907.0907.1T/SXSL18-202548.3.2质谱参考条件a）电离方式：电喷雾离子源（ESI）；b）监测方式：多反应监测（MRMc）扫描方式：负离子扫描；d）毛细管电压：2.5kV；e）离子源温度：150℃;f）脱溶剂气温度：350℃;g）多反应监测（MRM）离子对、锥孔电压及碰撞能量见表2。表2氯酸盐、高氯酸盐及其内标物的定性离子对、定量离子对及质谱条件被测物名称定性离子对m/z定量离子对m/z锥孔电压V碰撞能量氯酸盐83.0＞67.083.0＞67.022.09485.0＞69.022.195高氯酸盐99.0＞83.099.0＞83.027.298101.0＞85.027.093氯酸盐-18O389.0＞71.0/23.491高氯酸盐-18O4107.0＞89.0/28.18.3.3混合标准系列工作溶液和试样溶液的测定在仪器最佳工作条件下，分别取混合标准系列工作溶液（5.18）和试样溶液（8.2）上机测定。混合标准系列工作溶液中各待测物的多反应监测离子色谱图见附录A。8.3.4定性通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。试样与标准品保留时间的相对偏差不大于2.5%；试样特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判定样品中存在对应的化合物。表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度>50>20～50（含）>10～20（含）允许的最大偏差8.3.5定量在仪器最佳工作条件下，取试样溶液和标准溶液分别进样，以标准溶液中待测组分峰面积与对应内标峰面积比值为纵坐标，待测组分浓度为横坐标，进行单点或多点校正，采用内标法定量。试样溶液中待测物的响应值与对应内标物响应值的比值均应在仪器测定的线性范围内。以氯酸盐同位素内标T/SXSL18-2025为内标物计算氯酸盐含量，以高氯酸盐同位素内标为内标物计算高氯酸盐含量，标准曲线的相关系数应不低于0.99。试样溶液与标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。当试样的上机浓度超过线性范围时，在样品提取（8.1）时内标物加入量应增加适当倍数（n），净化（8.2）后的试样溶液用甲醇稀释n倍后重新测定。单点校正定量时，试样溶液中待测物的浓度与标准溶液浓度相差不超过30%。9试验数据处理试样中氯酸盐（以氯酸根计）、高氯酸盐（以高氯酸根计）的含量w以质量分数计，单位为微克每千克(μg/kg），多点校准按式（1）计算，单点校准按式（2）计算。式中：C——从标准曲线查得的试样溶液待测物的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mLV——试样提取溶液的体积，单位为毫升（mLm——试样的质量，单位为克（gn——稀释倍数。式中：Cis——试样溶液中各内标物浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；Cs——标准溶液中各待测物浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；C’is——标准溶液中各内标物浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；Ai——试样溶液中各待测物峰面积；Ais——试样溶液中各内标物峰面积；As——标准溶液中各待测物峰面积；A’is——标准溶