Caco-2单层细胞模型在中药化学成分吸收转运研究中的应用浅析

Caco-2单层细胞模型在中药化学成分吸收转运研究中的应用浅析摘要：Caco-2细胞来源于人体结肠癌细胞,是一种经由人体克隆而来的结肠癌细胞，可以参与药物的吸收、代谢、转运等过程，被看作分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，并可分泌大量的小肠上皮细胞特有的蛋白、酶以及转运体。研究表明，Caco-2单层细胞模型可以用来探究不同条件因素对药物吸收转运的影响，对研究药物吸收机制有着莫大的应用价值。本文通过对Caco-2单层细胞模型在中药化学成分吸收转运研究中的应用进行综述，为Caco-2单层细胞模型的进一步研究与应用提供理论依据。关键词：Caco-2单层细胞模型中药化学成分吸收转运应用中图分类号：R284文献标识码：AApplicationofCaco-2MonolayerCellModelintheStudyofAbsorptionandTransportofChemicalConstituentsinTraditionalChineseMedicineAbstract:Caco-2cellsarederivedfromhumancoloncancercells.Theyarecoloncancercellsclonedfromhumanbody.Caco-2cellscanparticipateintheprocessofabsorption,metabolismandtransportofdrugs.Theyareregardedasdifferentiatedintestinalepithelialcellswithmicrovilli.Thestructureandsecretionofalargenumberofproteins,enzymesandtransportersuniquetointestinalepithelialcells.StudieshaveshownthattheCaco-2monolayercellmodelcanbeusedtoexploretheeffectsofdifferentfactorsondrugabsorptionandtransport,andithasgreatapplicationvalueforthestudyofdrugabsorptionmechanism.Inthispaper,theapplicationofCaco-2monolayercellmodelinthestudyoftheabsorptionandtransportofchemicalconstituentsoftraditionalChinesemedicinewasreviewed,whichprovidesatheoreticalbasisforthefurtherresearchandapplicationofCaco-2monolayercellmodel.Keywords:Caco-2monolayercellmodel;ChemicalconstituentsoftraditionalChinese;Transport;Application将来源于人体结肠癌细胞的Caco-2细胞培养于多孔可渗透聚碳酸酯膜上，在培养过程中经历分化过程，可形成连续紧密的单层，在形态和功能上都类似于人体小肠上皮细胞，表达成熟小肠上皮细胞的形态和功能特征，即为Caco-2单层细胞模型[1]。中药主要经口服给药的方式进入人体，通过小肠上皮细胞的吸收转运，被人体吸收从而发挥药效作用。因此，利用Caco-2单层细胞模型模拟人体小肠对中药化学成分吸收转运的过程，研究中药化学成分的转运机制、生物利用度以及更不同化学成分之间的相互影响，对研究中药能否发挥药效以及不同药物之间相互作用非常重要[2-3]。Caco-2单层细胞模型在对中药化学成分吸收转运的研究应用是多方面的，本文即对Caco-2单层细胞模型在中药化学成分吸收转运研究中的应用进行综述，为Caco-2单层细胞模型的进一步研究与应用提供理论依据。Caco-2单层细胞模型概述在培养Caco-2细胞时观察到Caco-2单个细胞呈扁平状、多角形，连成膜状贴壁生长。当将细胞接种一段时间的培养后，细胞会自发进行形态学上的分化，并在边缘侧呈刷状（刷状缘），细胞与细胞之间无缝连接形成单层。细胞单层膜结构呈“大理石花纹状”，细胞之间紧密连接胞融合后，数量达高峰，在生长后期有团块细胞死亡[4]。在接种细胞几天后，细胞开始进行分化。在肠腔侧分化出绒毛面AP侧(apical,肠腔侧,又称黏膜剂)和基底面BL侧(basolateral,肠内壁侧,又称浆膜剂)。AP面含有典型的小肠微绒毛水解酶和各种营养物质转运载体,可发挥主动转运物质的作用。当AP侧碱性磷酸酶活性高于BL侧,即产生了极化现象。碱性磷酸酶是小肠上皮刷状缘细胞的标志性酶,作为衡量单细胞层的极化程度的指标[5]。一般来说，Caco-2单层细胞模型的通透性、完整性、极化程度是判断其是否符合各项指标的主要条件[6]。研究表明具有氨肽酶、蔗糖酶和γ-谷氨酰转移酶、寡肽转运载体PepT-1,I相代谢酶CYP1A1和II相代谢酶硫磺基转移酶、葡萄苷酸酶和谷胱甘肽S-转移酶在Caco-2细胞中同时存在,并高度表达了糖蛋白的特征[7]。Caco-2细胞具有培养方法简单、成本低、快速、高效等优点，可以用来模仿人体小肠环境，研究药物的吸收转运，评价口服药物前体的安全性等，但同时也具有细胞培养时间过长，缺少细胞培养和试验操作标准，以及不能生成与小肠上皮相似粘液层等缺点[8-10]。2.Caco-2单层细胞模型在中药化学成分吸收转运研究中的应用人体的给药途径包括皮肤给药，舌下给药，直肠给药以及口服给药等途径，其中口服给药为最常用方便的给药方式。在口服给药过程中，肠道是药物的必经之路，药物跨过肠上皮的途径有四种，包括胞引，被动转运，胞旁转运以及载体介导转运。Caco-2细胞是一种来源于人类结肠癌系细胞株，在特定的条件下对其进行培养，可通过分化与极化形成功能，形态及渗透特征与小肠上皮细胞极为相似的细胞模型。其构建的体外吸收过程与药物在肠道的吸收过程具有良好的相关性。因此，Caco-2单层细胞模型常用于模拟药物在小肠上皮细胞吸收转运的过程，被用作预测药物在人体小肠吸收及转运机制研究的一种筛选工具[9-12]。在Caco-2单层细胞模型被建立后，对药物从AP侧转运到基底面BL侧，或从BL侧转运到AP侧进行研究，利用HPCL-MS法对样品进行定量分析，明确药物的吸收转运过程，继而研究其转运机制、影响因素、代谢情况以及药物之间相互作用，如图1所示。图1药物转运类型的确定过程2.1转运过程中影响因素的研究大量试验表明，可利用Caco-2单层细胞模型来研究PH、浓度等因素对药物吸收作用的影响[13]。李松林等为探究黄酮类化合物的吸收与结构的关系，建立Caco-2单层细胞模型，分别研究了多种不同种类黄铜化合物在Caco-2单层细胞模型中的吸收。选取了pH从5.0-8.0七个不同值来探究Caco-2细胞对不同黄酮类药物的吸收性，发现当pH从小增大时，黄酮类药物的吸收度越来越小，其中槲皮素的吸收度变化最大。接下来选取pH为7.4来考察不同药物浓度对吸收度的影响。结果表明，几种不同的黄酮类药物经Caco-2细胞的吸收量与药物浓度均呈线性关系[14]。2.2药物转运机制的研究药物在肠道中的转运机制可分为被动转运和主动转运以及膜动转运三种，发生被动转运时往往从高浓度一侧到低浓度一侧，并且不需要载体；而主动转运则相反，从低浓度一侧至高浓度一侧，并且需要能量与载体。在我们探究药物在人体肠道的转运机制时，Caco-2单层细胞模型成为我们主要的考察手段[15]。谭梅娥等探究了田蓟苷与田蓟苷固体脂质纳米粒在Caco-2细胞中的转运作用。分别在腔侧与基底侧加入田蓟苷溶液与田蓟苷固体脂质纳米粒溶液，并记录色谱吸收峰，计算出田蓟苷在15min时的表观渗透系数比值为1.07，在20min时为1.21；而田蓟苷固体脂质纳米粒在15min的表观渗透系数比值为1.31，在20min时为1.32。比值都介于1.0-1.5倍之间，说明可能有载体介导其转运。且药物浓度越大吸收越好，说明了田蓟苷在小肠吸收作用中有浓度依赖性，符合被动转运的条件，因此推测田蓟苷在人体小肠中的转运方式为被动转运[16]。龙潇鸿等利用Caco-2单层细胞模型来探究普萘洛尔异构体转运机制。采用20、40、80、160、240umol/l的溶液分别加入腔侧与基底侧，并在培养箱中培养来模拟人肠道环境。通过计算Caco-2单层细胞模型中的表观渗透系数，经过T检验的普萘洛尔的异构体在由A到B方向和由B到A方向上都不存在手性选择性,可以推断出普萘洛尔在人体肠道中可能为被动转运。无论是R-普萘洛尔还是S-普萘洛尔，从腔侧至基底侧与从基底侧至腔侧的两个方向的Paa值在浓度为20-240umol/l时基本没有变化，但是对于R-普萘洛尔来说，从B-A的Paa值为从A-B的1.1-2.6倍，可以猜测药物存在主动转运机制。这也说明了R-普萘洛尔的以被动转运为主，而B-A得Paa值大的原因可能因为一些酶的作用而导致的。对于S-普萘洛尔来说，两个方向的Paa值相差不大，说明药物在转运时不存在选择性，其转运机制绝大部分为被动吸收[17]。杨晓改等为比较两种不同具有胰岛素效应的氧矾配合物（双麦芽酚氧钒与双乙酞丙酮氧钒）在肠道的吸收能力，设计Caco-2单层细胞模型。从顶端至底端，底端到顶端绘制向钒化合物的跨Caco-2细胞转运的时间动力学曲线。结果表明，随着培养时间的增加，绘制出的两条曲线均呈线性，药物吸收作用随着浓度的增大而增大，具有浓度依赖性，符合被动转运中以浓度梯度驱使的条件，可以初步判断其转运机制为被动转运[18]。2.3药物代谢及吸收转运与构效关系的研究研究发现，人体小肠中存在丰富的代谢酶，其中P4503A4约占50％，部分口服药物在经过胃肠道上皮过程中可被代谢[8]。Caco-2单层细胞模型存在着与人体小肠中相同的细胞色素P450同工酶，因此被广泛应用于口服药物的代谢研究中。近年来，Caco-2细胞在药物代谢研究中取得了多项成就，刘东等对Caco-2单层细胞模CES的代谢特征进行研究，证明Caco-2细胞对表达hCE-1具有较高含量，表达hCE-2含量较少[19]。葛月宾等应用Caco-2单层细胞模型对大豆苷元溶液进行转运试验，在A，B侧和单分子细胞膜中检测到少量的代谢产物，证明大豆苷元药物在人体肠部具有良好的吸收性[20]。SteensmaA等发现染料木黄酮在Caco-2细胞中并没有产生代谢作用,其糖配体则主要代谢成相应的苷元，黄酮经由细胞单层的顶侧转运到底侧,相应的糖配体几乎不透过Caco-2细胞,也就说明了染料木黄酮生物利用度低的原因是因为小肠的代谢[21]。还可以通过Caco-2单层细胞模型确定药物化学结构与药物在体内吸收转运的关系，从而推断出药物代谢是否存在构效关系。ChenJ等认为异黄共轭物排泄率的极化高度依赖于异黄酮结构，除生物粗蛋白A葡萄糖醛酸外，所有异黄酮葡萄糖醛酸类化合物均主要排泄到基底外侧，而生物粗隆A葡萄糖醛酸酯则平均向两侧排泄。除此之外，生物粗蛋白A、Forononetin和prunetin的硫酸盐主要是通过顶端排泄的，而硫酸大豆素主要是向基底外侧排泄的[22]。2.4药物的毒性研究刘志伟等为探究铜对人体的毒性，建立了Caco-2单层细胞模型来模拟人体肠道上皮细胞。培养Caco-2细胞后加入不同浓度的铜离子并采用MTT法测定了细胞活力，发现铜暴露浓度在超过20umol/l时显著降低细胞活力；采用p-糖蛋白活性检测试验来判断Caco-2细胞的耐药性，发现铜暴露浓度越高，时间越长，糖蛋白活性越低；采用细菌入侵试验测定铜对细菌入侵Caco-2细胞及其在细胞内存活率的影响，发现铜会使细菌入侵Caco-2细胞数量显著增加，细胞经铜暴露30分钟后，存活细胞的CFU值由400左右降到300左右，与遭入侵细胞CFU值相当，而24小时后，细菌在细胞中的存活数量却变少起来[23]。2.5中药化学成分之间相互作用研究临床上，中药制剂通常为多种药物或有效成分的联合制剂，因此可能会存在药物竞争酶或载体等问题，进而导致多种药物或多种有效成分之间协同或拮抗等相互作用。应用Caco-2单层细胞模型在药物相互作用研究领域取得了一定的进展。例如廖正根等利用用大鼠体肠吸收法探究药物配伍原理,探究了桂枝茯苓胶囊中有效成分的在小肠上皮细胞中的吸收特点,结果显示桂枝桃仁提取物中的苦杏仁苷成分,白芍、牡丹皮提取物中的芍药苷成分的吸收参数明显低于桂枝茯苓中的吸收参数,表明中药配伍可能促进某些药用活性成分的吸收[24]。该研究提示我们可以用Caco-2单层细胞模型从吸收的角度研究中药配伍的原理,还可以为中药复方的优化与剂型设计方面做出贡献。另外有相关研究表明，小檗碱与黄连碱具有协同作用；CYP3和AP-gpoverin具有协同作用；白芷有效成分对阿魏酸的转运具有促进作用，胡皂苷ａ和ｄ对肠道吸收芍药苷具有促进作用[25-26]。3.讨论Caco-2单层细胞模型作为研究药物吸收转运过程的模型之一，在近年来得到了越来越多的人的认可。因其与人体小肠具有良好的相关性，被广泛应用于药物吸收，代谢，转运，相互作用等研究机制中[8]。可将Caco-2单层细胞模型用于药物的高通量筛选，预测药物在人体内的转运机制，评价药物的安全性，为药物的剂型设计提供实验依据等。随着对其不断的研究与发现，Caco-2单层细胞模型已经成为药物在人体小肠吸收转运机制研究的标准体外筛选工具[10]。Caco-2单层细胞模型在中药化学成分吸收转运研究领域，具有广泛的应用前景，在食品领域也被越来越多的应用[27]。但Caco-2单层细胞模型还存在不足之处，需对其进行更多的试验与研究，使其更好的应用于中药的研究中，从而促进中医药理论的不断发展。参考文献[1]Y.Sambuy,I.Angelis,G.Ranaldi,M.L.Scarino,A.Stammati,F.Zucco.TheCaco-2celllineasamodeloftheintestinalbarrier:influenceofcellandculture-relatedfactorsonCaco-2cellfunctionalcharacteristics[J].CellBiologyandToxicology,2005,21(1).[2]高坤,孙进,何仲贵.Caco-2细胞模型在口服药物吸收研究中的应用[J].沈阳药科大学学报,2005,22(6):469-474.[3]梁桂贤,刘谦民.药物肠吸收研究方法近况[J].国外医药—合成药生化药制剂分册,1998,19(4):251.[4].吕晓君,曹易丹,何开勇.Caco-2细胞体外吸收模型的建立及验证[J].医药导报,2018,37(11):1311-1315.[5].CHANTRETI,BARBATA,DUSSAULXE,etal.Epithelialpolarity,villinexpression,andenteroeyticdifferentiationofculturedhumancoloncarcinomacells:asurveyoftwentycellhnes[J].CancerRes,1988,48(4):1936-1942.[6].ALLENRH,ROBERTAC,PHILLIPSB.Caco-2cellmonolayersasamodelfordrugtransportacrosstheintestinalmucosa[J].PharmRes,1990,7(9):902-910.[7].GanLL,DhirenRT.ApplicationsoftheCaco-2modelinthede-signanddevelopmentoforallyactivedrugs:elucidationofbiochemicalandphysicalbarriersposedbytheintestinalepithelium[J].AdvDrugDelivRev,1997,23(1):77.[8].赵静,梁爱华.Caco-2细胞模型及其在中药吸收转运研究中的应用[J].中国实验方剂学杂志,2009,15(05):79-83.[9].刘忠英.中药化学成分在炮制、配伍和提取过程中的化学变化及其转运机制的研究[D].吉林大学,2005.[10].廖沙,谢剑炜.Caco-2细胞模型在药物体外研究中的应用[J].中国新药杂志,2005(04):416-419.[11].吕晓君,曹易丹,何开勇.Caco-2细胞体外吸收模型的建立及验证[J].医药导报,2018,37(11):1311-1315.[12].阚鸿.乌头类中药复方中化学成分吸收转运机制的体外研究[D].吉林大学,2015.[13].SenSun,HaiZhang,FengfengSun,etal.IntestinaltransportofsophocarpineacrosstheCaco-2cellmonolayermodelandquantificationbyLC/MS[J].BiomedicalChromatography,2014,28:885-890.[14].陈丙銮,李松林,李萍,张陆勇.黄酮类化合物在Caco-2细胞模型中的吸收规律[J].中国天然药物,2006(04):299-302.[15].ChenJ,LinH,HuM.AbsorptionandmetabolismofgensisteinanditsfiveisoflavoneanalogsinthehumanintestinalCaco-2model[J].CancerChemotherPharmacol,2005,55(2):159-169.[16].SchutteME,vandeSandtJJM,AlinkGM,etal.Myricetinstimulatestheabsorptionofthepro-carcinogenPhIP[J].CancerLett,2006,231(1):36-42.[17].刘志伟,陈佳琳,陈秉衡.铜对人类肠道上皮Caco-2细胞的毒性研究[J].卫生研究,2004,33(3):284-288.[18].廖正根,平其能,萧伟,等.桂枝茯苓胶囊中有效成分的大鼠在体肠吸收研究[J].中国天然药物,2005,3(5):33-37.[19].刘东,张程亮,杨燕,向道春,高静,王新桃.人结肠癌Caco-2细胞羧酸酯酶的表达及代谢活性[J].世界华人消化杂志,2010,18(03):294-297.[20].葛月宾,马燕,李卫中.大豆苷元在Caco-2细胞模型中的转运和代谢[J].中药材,2009,32(10):1563-1567.[21].谭梅娥,姜雯,曾诚,何承辉,邢建国.田蓟苷固体脂质纳米粒的优化及其在Caco-