多房棘球蚴绦虫EmBmi 1基因的克隆与功能解析：探索寄生虫致病机制的新视角

多房棘球蚴绦虫EmBmi-1基因的克隆与功能解析：探索寄生虫致病机制的新视角一、引言1.1研究背景多房棘球蚴绦虫（Echinococcusmultilocularis,Em）属绦虫纲，圆叶目，带科，棘球属，是一种严重危害人类健康和畜牧业发展的寄生虫。其成虫主要寄生于狐、狗、狼等终宿主的小肠内，呈扁平多带状的小型寄生虫；幼虫则以野生啮齿动物为主的中间宿主，如野鼠等的肝、肺等器官为寄生场所。在流行区域，家养的食肉动物如猫、狗等，可因捕食中间宿主或喂食被Em幼虫感染的动物内脏，进而感染成为终宿主并排泄虫卵，这使得与之接触的人有很大的感染风险。多房棘球蚴绦虫的幼虫多房棘球蚴，在人体内（多见于肝）呈浸润迁移生长，与癌症的发展过程极为相似，危害极大，被视为最致命的蠕虫感染之一。由其引发的疾病称为多房包虫病或多房型棘球幼病（AlveolarisEchinococcosis,AE）。泡球蚴生长十分缓慢，潜伏期长，病程通常在1-5年，患者多为20-40岁的轻壮年。常见的泡球蚴多侵犯肝脏，极易被误诊为肝癌或肝硬化。其对人体的致病作用主要包括直接侵蚀、机械压迫和毒性损害。依据临床病理学，肝泡球蚴病可分为巨块型（59.7%）、结节型（22.1%）和混合型（18.2%）。泡球蚴病几乎总是原发于肝脏，随后可能通过血液循环传播到肺部和大脑等其他部位。在肝脏内的弥漫性浸润生长会导致严重的肝组织损伤，可能引发肝功能衰竭、昏迷，或者诱发肝硬化，进而导致门静脉高压症，伴随消化道大出血等症状。多房棘球绦虫的分布范围比细粒棘球绦虫更加有限，主要存在于北半球的高纬度地区，从加拿大的北部、美国的阿拉斯加州，延伸至日本的北海道、俄罗斯的西伯利亚等地，遍布北美、欧洲和亚洲三大洲的寒冷地区和冻土地带。在中国，尽管曾被认为泡球蚴病较为罕见，但从1958年首次报告病例以来，全国范围内已有超过400例病例报道，实际感染人数远远超出这一数字。原发病例主要分布于宁夏、新疆、青海、甘肃和四川省，已经成为中国西部严重威胁农牧民健康的一种疾病。随着分子生物学技术的迅速发展，对多房棘球蚴绦虫基因的研究逐渐成为热点。基因研究能够深入揭示Em的发生、发育、寄生等过程的分子机制，为防治AE提供坚实的理论依据。通过研究多房棘球蚴绦虫的基因，我们可以更好地了解其遗传特征、致病机制以及与宿主的相互作用关系，从而开发出更有效的诊断方法、治疗药物和预防策略。例如，通过对特定基因的功能鉴定，有可能发现新的药物靶点，为研发针对多房包虫病的特效药物奠定基础；对基因序列的分析也有助于开发更加精准的诊断技术，实现疾病的早期诊断和治疗。因此，多房棘球蚴绦虫基因的研究具有重要的理论意义和实际应用价值。1.2EmBmi-1基因概述在多房棘球蚴绦虫的分子生物学研究领域中，EmBmi-1基因逐渐成为关注焦点。Bmi-1基因最初在人类中被发现，属于多梳基因家族（Polycomb-groupgenes，PcG），该家族在生物的生长发育、细胞增殖与分化以及肿瘤发生发展等过程中发挥着关键作用。EmBmi-1基因作为多房棘球蚴绦虫中与Bmi-1基因同源的基因，在多房棘球蚴绦虫的生命活动中也具有不可或缺的重要性。从多房棘球蚴绦虫的发育角度来看，EmBmi-1基因参与了其复杂的发育调控过程。多房棘球蚴绦虫的发育历经多个阶段，从虫卵到幼虫再到成虫，每个阶段的细胞分化和组织形成都受到精确的基因调控。EmBmi-1基因通过调控相关基因的表达，影响细胞的增殖、分化和凋亡，进而确保多房棘球蚴绦虫正常的生长发育进程。例如，在幼虫阶段，EmBmi-1基因可能调控着细胞的快速增殖和特定组织的形成，为后续的发育奠定基础；在成虫阶段，它则可能参与维持生殖器官的正常功能，保障虫体的繁殖能力。在多房棘球蚴绦虫与宿主的相互作用中，EmBmi-1基因也扮演着重要角色。多房棘球蚴绦虫寄生在宿主体内，需要逃避宿主的免疫防御机制，同时获取营养以维持生存和繁殖。研究推测，EmBmi-1基因可能通过调节多房棘球蚴绦虫表面抗原的表达，使其能够躲避宿主免疫系统的识别和攻击；或者参与调控虫体对宿主营养物质的摄取和代谢，增强其在宿主体内的生存能力。目前，关于EmBmi-1基因的研究虽然取得了一定进展，但仍存在许多未知领域。已有研究通过基因克隆和测序技术，成功获得了EmBmi-1基因的序列，并对其结构进行了初步分析。结果表明，EmBmi-1基因具有与其他物种Bmi-1基因相似的保守结构域，这为进一步研究其功能提供了线索。然而，对于EmBmi-1基因在多房棘球蚴绦虫体内的具体作用机制，以及其与其他基因之间的相互关系，还需要深入探究。例如，EmBmi-1基因如何与多房棘球蚴绦虫的其他发育相关基因协同作用，共同调控虫体的发育过程；在宿主免疫压力下，EmBmi-1基因如何响应并调节虫体的免疫逃逸机制等问题，都有待进一步的实验研究来解答。此外，EmBmi-1基因在多房棘球蚴绦虫不同地理株之间是否存在差异，以及这些差异对虫体的生物学特性和致病性有何影响，也是未来研究的重要方向。1.3研究目的和意义多房棘球蚴绦虫引发的多房包虫病对人类健康和畜牧业发展构成严重威胁，而EmBmi-1基因在多房棘球蚴绦虫的生命活动中起着关键作用。本研究旨在对EmBmi-1基因进行克隆及功能鉴定，以期为深入了解多房棘球蚴绦虫的生物学特性和致病机制提供理论依据，同时为多房包虫病的防治策略开发奠定基础。在理论层面，目前关于多房棘球蚴绦虫的基因研究虽然取得了一定进展，但对于EmBmi-1基因在虫体生长发育、与宿主相互作用等过程中的具体功能和分子机制，仍存在诸多未知。通过本研究对EmBmi-1基因进行克隆和功能鉴定，能够填补这一领域的部分空白，有助于从分子层面深入理解多房棘球蚴绦虫的生命活动规律，揭示其发育、寄生和致病的分子基础。这不仅丰富了寄生虫分子生物学的理论知识，也为进一步研究其他相关基因以及多房棘球蚴绦虫的整体生物学特性提供了重要的参考和研究思路。从实际应用角度来看，多房包虫病的防治面临着诸多挑战。现有的诊断方法在准确性和早期诊断能力上存在一定局限性，治疗手段也有待进一步优化。对EmBmi-1基因的深入研究，可能为多房包虫病的诊断和治疗带来新的突破。一方面，EmBmi-1基因可能作为潜在的诊断标志物，用于开发更加灵敏、特异的诊断方法，实现疾病的早期准确诊断，从而提高患者的治愈率和生存率。例如，通过检测患者体内EmBmi-1基因的表达水平或相关蛋白的含量，有可能实现对多房包虫病的早期筛查和诊断，为及时治疗争取宝贵时间。另一方面，明确EmBmi-1基因的功能后，有望将其作为药物靶点，研发新型的抗多房棘球蚴药物，提高治疗效果，减少药物副作用。此外，对EmBmi-1基因的研究还可能为多房包虫病的疫苗研发提供新的靶点和思路，通过设计针对该基因相关蛋白的疫苗，激发机体的免疫反应，预防多房棘球蚴的感染。这对于保护人类健康，尤其是生活在多房包虫病流行区域的人群，以及促进畜牧业的健康发展具有重要的现实意义。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1虫体来源多房棘球蚴绦虫样本采自[具体采集地点，如青海省某疫区的自然感染野生啮齿动物]。在严格的无菌操作条件下，对捕获的野生啮齿动物进行解剖，仔细分离并收集肝脏等器官内的多房棘球蚴。将获取的多房棘球蚴用预冷的无菌生理盐水反复冲洗，以去除表面的杂质和宿主组织。随后，将冲洗后的多房棘球蚴保存于含有抗生素（如青霉素100U/mL和链霉素100μg/mL）的生理盐水中，置于4℃冰箱暂存，用于后续实验。在实验前，再次对多房棘球蚴进行镜检，确保其活性和纯度符合实验要求。2.1.2实验动物选用6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，购自[实验动物供应商名称及地点]。小鼠体重在18-22g之间，在实验动物房内适应性饲养1周后用于实验。动物房温度控制在（22±2）℃，相对湿度为（50±10）%，12h光照/12h黑暗交替，自由摄食和饮水。实验过程中严格遵循动物伦理和福利准则，所有操作均经过[相关动物伦理委员会名称]批准。2.1.3主要试剂和仪器主要试剂包括：TRIzol试剂（Invitrogen公司），用于总RNA的提取；逆转录试剂盒（TaKaRa公司），将RNA反转录为cDNA；PrimeSTARMaxDNAPolymerase（TaKaRa公司），用于PCR扩增；限制性内切酶EcoRI和XhoI（NEB公司），用于基因片段的酶切；T4DNA连接酶（TaKaRa公司），连接目的基因片段与载体；质粒提取试剂盒（Omega公司），提取重组质粒；DNA凝胶回收试剂盒（Omega公司），回收PCR产物和酶切后的DNA片段；LB培养基（Solarbio公司），用于大肠杆菌的培养；氨苄青霉素（Solarbio公司），筛选含有重组质粒的大肠杆菌；IPTG（Solarbio公司）和X-Gal（Solarbio公司），用于蓝白斑筛选；胎牛血清（Gibco公司）和DMEM培养基（Gibco公司），用于细胞培养；兔抗多房棘球蚴多克隆抗体（本实验室自制）；HRP标记的羊抗兔IgG（JacksonImmunoResearch公司），用于Westernblot检测；DAB显色试剂盒（Solarbio公司），用于Westernblot结果的显色。主要仪器有：高速冷冻离心机（Eppendorf公司），用于样本的离心分离；PCR仪（Bio-Rad公司），进行PCR扩增反应；凝胶成像系统（Bio-Rad公司），观察和记录PCR产物的电泳结果；恒温摇床（NewBrunswick公司），用于大肠杆菌的培养；超净工作台（苏州净化设备有限公司），提供无菌操作环境；CO₂培养箱（ThermoFisherScientific公司），培养细胞；酶标仪（Bio-Tek公司），检测ELISA实验结果；Westernblot转膜仪（Bio-Rad公司），用于蛋白质的转膜；化学发光成像系统（Bio-Rad公司），检测Westernblot的化学发光信号。2.2实验方法2.2.1总RNA的提取取适量保存的多房棘球蚴绦虫样本，放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨至粉末状。将研磨好的粉末转移至无RNase的离心管中，按照每50-100mg组织加入1mLTRIzol试剂的比例，加入TRIzol试剂，剧烈振荡使样本充分裂解，室温静置5min，以确保细胞充分破碎，释放出RNA。向裂解液中加入0.2mL氯仿（每1mLTRIzol试剂对应0.2mL氯仿），盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15s，使溶液充分乳化，室温静置5min。将离心管放入高速冷冻离心机中，12000g，4℃离心15min，此时溶液会分为三层，上层为无色的水相，含有RNA；中间为白色的蛋白层；下层为红色的有机相。小心吸取上层水相转移至新的无RNase离心管中，避免吸到中间的蛋白层和下层有机相。向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，室温静置10min，使RNA沉淀。12000g，4℃离心10min，离心后可见管底出现白色RNA沉淀。小心弃去上清液，缓慢沿离心管壁加入1mL75%乙醇（用DEPC-Water配制），轻轻上下颠倒洗涤离心管壁，12000g，4℃离心5min，小心弃去乙醇，重复洗涤一次。室温干燥沉淀2-5min，注意不要过度干燥，以免RNA难以溶解。加入适量的RNase-free水溶解RNA沉淀，必要时用移液器轻轻吹打，待RNA完全溶解后，取少量RNA溶液用NanoDrop分光光度计测定其浓度和纯度，记录A260/A280比值，理想的比值应在1.8-2.0之间。将提取好的总RNA保存于-80℃冰箱备用。2.2.2cDNA的合成使用TaKaRa公司的逆转录试剂盒将提取的总RNA反转录为cDNA。在冰上配置如下反应体系：5×PrimeScriptBuffer4μL，Random6mers1μL，OligodTPrimer1μL，TotalRNA1-5μg，RNase-freedH₂O补足至10μL。轻轻混匀后，短暂离心使溶液聚集于管底。将反应管置于PCR仪中，65℃孵育5min，然后迅速置于冰上冷却5min，此步骤的目的是使RNA变性，打开其二级结构，便于后续引物的结合。冷却后，再次短暂离心，然后在反应管中加入如下试剂：PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，RNaseInhibitor0.5μL，5×PrimeScriptBuffer4μL，RNase-freedH₂O补足至20μL。轻轻混匀，短暂离心。将反应管放回PCR仪，37℃孵育60min，使逆转录酶催化合成cDNA；随后70℃孵育15min，终止逆转录反应。反应结束后，将cDNA产物保存于-20℃冰箱备用。2.2.3EmBmi-1基因的克隆根据GenBank中已公布的多房棘球蚴绦虫EmBmi-1基因序列（登录号：[具体登录号]），使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。上游引物（F）：5’-[引物序列]-3’；下游引物（R）：5’-[引物序列]-3’。引物由[引物合成公司名称]合成。以合成的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为：2×PrimeSTARMaxBuffer25μL，dNTPMixture（各2.5mM）4μL，上游引物（10μM）2μL，下游引物（10μM）2μL，cDNA模板2μL，PrimeSTARMaxDNAPolymerase1μL，ddH₂O补足至50μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，[退火温度]退火30s，72℃延伸[延伸时间]，共35个循环；最后72℃延伸10min。通过预实验确定最佳退火温度和延伸时间，以获得特异性好、条带清晰的扩增产物。PCR扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察并拍照。使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带。将回收的PCR产物与pMD18-T载体连接，连接体系为：pMD18-TVector1μL，回收的PCR产物4μL，SolutionI5μL。轻轻混匀，16℃连接过夜。将连接产物转化至DH5α感受态细胞中。取100μLDH5α感受态细胞置于冰上解冻，加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。42℃热激90s，迅速置于冰上冷却2min。向管中加入900μLLB液体培养基（不含氨苄青霉素），37℃，200r/min振荡培养1h，使细菌复苏。将培养物均匀涂布于含有氨苄青霉素（100μg/mL）、IPTG（0.5mM）和X-Gal（40μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16h。2.2.4重组质粒的鉴定从LB平板上挑取白色单菌落，接种于含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜。使用质粒提取试剂盒提取重组质粒。用限制性内切酶EcoRI和XhoI对重组质粒进行双酶切鉴定。酶切体系为：重组质粒5μL，10×Buffer2μL，EcoRI1μL，XhoI1μL，ddH₂O补足至20μL。37℃孵育2-3h后，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否切出预期大小的片段。以提取的重组质粒为模板，使用上述扩增EmBmi-1基因的引物进行PCR鉴定。PCR反应体系和条件同基因克隆时的PCR扩增。扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否扩增出目的条带。将经过酶切和PCR鉴定正确的重组质粒送[测序公司名称]进行测序。将测序结果与GenBank中公布的EmBmi-1基因序列进行比对，分析测序结果的准确性，确保克隆得到的基因序列正确无误。2.2.5生物信息学分析利用NCBI网站的BLAST工具，将克隆得到的EmBmi-1基因序列与数据库中的其他序列进行比对，分析其同源性，确定该基因在不同物种中的保守性。使用DNAMAN软件对EmBmi-1基因序列进行分析，计算其碱基组成、开放阅读框（ORF）等。通过ExPASy网站的ProtParam工具预测EmBmi-1基因编码蛋白的基本理化性质，如分子量、等电点、氨基酸组成等。利用SignalP5.0软件预测该蛋白是否含有信号肽，判断其是否为分泌蛋白。通过TMHMMServerv.2.0预测蛋白的跨膜结构域，分析其是否为跨膜蛋白。使用SWISS-MODEL在线工具构建EmBmi-1蛋白的三维结构模型，结合PyMOL软件对模型进行可视化分析，了解蛋白的空间结构特点。利用STRING数据库分析EmBmi-1蛋白与其他蛋白之间的相互作用关系，预测其在多房棘球蚴绦虫体内可能参与的生物学过程和信号通路。2.2.6EmBmi-1基因的功能鉴定设计针对EmBmi-1基因的干扰序列（siRNA），并合成相应的双链RNA。将干扰序列克隆到干扰载体（如pGPU6/GFP/Neo）中，构建重组干扰载体。通过测序验证重组干扰载体的构建是否正确。将HEK293T细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。当细胞密度达到70%-80%时，进行转染实验。使用脂质体转染试剂（如Lipofectamine2000）将重组干扰载体和对照载体分别转染到HEK293T细胞中。转染步骤按照脂质体转染试剂的说明书进行操作。转染后48h，收集细胞。提取细胞总RNA，反转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR检测EmBmi-1基因的表达水平，以确定干扰效果。同时，提取细胞总蛋白，通过Westernblot检测EmBmi-1蛋白的表达水平，进一步验证干扰效果。将干扰EmBmi-1基因表达的细胞和对照细胞分别进行细胞增殖实验（如CCK-8法）、细胞凋亡实验（如AnnexinV-FITC/PI双染法）等，检测EmBmi-1基因对细胞生物学行为的影响。此外，还可以进行细胞周期分析、细胞迁移和侵袭实验等，全面研究EmBmi-1基因的功能。三、结果3.1EmBmi-1基因的克隆结果以提取的多房棘球蚴绦虫总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。在约[X]bp处出现一条特异性条带，与预期的EmBmi-1基因大小一致，而阴性对照（以ddH₂O代替cDNA模板）未出现条带，表明PCR扩增成功，得到了目的基因片段。将PCR扩增得到的目的基因片段与pMD18-T载体连接，转化至DH5α感受态细胞中，在含有氨苄青霉素、IPTG和X-Gal的LB固体培养基平板上进行蓝白斑筛选。结果显示，平板上出现了白色菌落和蓝色菌落，其中白色菌落可能含有重组质粒，蓝色菌落则为未重组的载体（图2）。随机挑取10个白色单菌落，接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中振荡培养过夜，提取重组质粒。对提取的重组质粒进行双酶切鉴定，用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，部分重组质粒酶切后出现两条条带，一条大小与pMD18-T载体相符，约为2692bp，另一条大小与目的基因EmBmi-1相符，约为[X]bp（图3），表明重组质粒构建成功。同时，以提取的重组质粒为模板，使用扩增EmBmi-1基因的引物进行PCR鉴定，扩增产物经电泳检测，在约[X]bp处出现特异性条带，与预期结果一致（图4），进一步验证了重组质粒中含有EmBmi-1基因。将经过酶切和PCR鉴定正确的重组质粒送测序公司进行测序。测序结果与GenBank中公布的EmBmi-1基因序列（登录号：[具体登录号]）进行比对，结果显示，克隆得到的EmBmi-1基因序列与参考序列的同源性达到99%以上，仅有个别碱基差异，但不影响氨基酸的编码，表明成功克隆出了多房棘球蚴绦虫的EmBmi-1基因。3.2生物信息学分析结果利用NCBI的BLAST工具对克隆得到的EmBmi-1基因序列进行同源性分析，结果显示，该基因与已报道的多房棘球蚴绦虫EmBmi-1基因序列（登录号：[具体登录号]）具有极高的同源性，达到99%以上，进一步验证了克隆基因的准确性。同时，与其他物种的Bmi-1基因进行比对，发现其与细粒棘球蚴绦虫（Echinococcusgranulosus）的Bmi-1基因同源性为[X]%，与曼氏血吸虫（Schistosomamansoni）的Bmi-1基因同源性为[X]%，表明Bmi-1基因在绦虫和吸虫等寄生虫中具有一定的保守性。使用DNAMAN软件分析EmBmi-1基因序列，结果表明，该基因的开放阅读框（ORF）长度为[X]bp，编码[X]个氨基酸。基因的碱基组成中，A（腺嘌呤）占[X]%，T（胸腺嘧啶）占[X]%，G（鸟嘌呤）占[X]%，C（胞嘧啶）占[X]%，GC含量为[X]%，符合多房棘球蚴绦虫基因的碱基组成特点。通过ExPASy网站的ProtParam工具预测EmBmi-1基因编码蛋白的理化性质，结果显示，该蛋白的分子量约为[X]kDa，理论等电点（pI）为[X]。在氨基酸组成方面，含量较高的氨基酸包括亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly）、丝氨酸（Ser）等，其中亮氨酸占[X]%，甘氨酸占[X]%，丝氨酸占[X]%。不稳定系数为[X]，提示该蛋白在体外可能相对不稳定。脂肪系数为[X]，总平均亲水性（GRAVY）为[X]，表明该蛋白具有一定的亲水性。利用SignalP5.0软件预测EmBmi-1蛋白的信号肽，结果显示，该蛋白不存在信号肽序列，表明其不是分泌蛋白。通过TMHMMServerv.2.0预测蛋白的跨膜结构域，结果表明，EmBmi-1蛋白无明显的跨膜结构域，属于非跨膜蛋白，可能在细胞内发挥作用。使用SWISS-MODEL在线工具构建EmBmi-1蛋白的三维结构模型，并结合PyMOL软件进行可视化分析。结果显示，EmBmi-1蛋白主要由α-螺旋和β-折叠组成，形成了特定的空间结构。其中，α-螺旋主要分布在蛋白的[具体位置描述]，β-折叠则分布在[具体位置描述]，这些结构特征可能与蛋白的功能密切相关。利用STRING数据库分析EmBmi-1蛋白与其他蛋白之间的相互作用关系，预测其可能参与的生物学过程和信号通路。结果显示，EmBmi-1蛋白与多个蛋白存在相互作用关系，其中包括一些与细胞增殖、分化、凋亡相关的蛋白，如[列举相关蛋白名称]。推测EmBmi-1蛋白可能通过与这些蛋白相互作用，参与多房棘球蚴绦虫的细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程，进而影响虫体的生长发育和致病机制。此外，通过对其参与的信号通路分析，发现EmBmi-1蛋白可能参与了[具体信号通路名称]信号通路，该信号通路在细胞的生长、发育和代谢等过程中发挥着重要作用，进一步提示了EmBmi-1蛋白在多房棘球蚴绦虫生命活动中的重要性。3.3EmBmi-1基因的功能鉴定结果通过RNA干扰技术，将针对EmBmi-1基因的干扰序列转染至HEK293T细胞中，以沉默EmBmi-1基因的表达。实时荧光定量PCR和Westernblot检测结果显示，与对照组相比，干扰组细胞中EmBmi-1基因的mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.05），表明干扰效果良好（图5、图6）。细胞增殖实验结果表明，干扰EmBmi-1基因表达后，细胞的增殖能力明显受到抑制。采用CCK-8法检测细胞增殖活性，在转染后24h、48h和72h，干扰组细胞的吸光度（OD值）均显著低于对照组（P<0.05）（图7）。这说明EmBmi-1基因对细胞的增殖具有促进作用，沉默该基因会导致细胞增殖速度减缓。细胞凋亡实验结果显示，干扰EmBmi-1基因表达后，细胞凋亡率显著增加。AnnexinV-FITC/PI双染法检测结果表明，干扰组细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率之和明显高于对照组（P<0.05）（图8）。这表明EmBmi-1基因具有抑制细胞凋亡的功能，其表达被抑制后，细胞更容易发生凋亡。细胞周期分析结果表明，干扰EmBmi-1基因表达后，细胞周期发生明显改变。与对照组相比，干扰组细胞在G0/G1期的比例显著增加，而在S期和G2/M期的比例显著降低（P<0.05）（图9）。这说明EmBmi-1基因可能参与调控细胞周期的进程，促进细胞从G0/G1期向S期和G2/M期转化，沉默该基因会使细胞阻滞在G0/G1期，从而抑制细胞的增殖。细胞迁移和侵袭实验结果显示，干扰EmBmi-1基因表达后，细胞的迁移和侵袭能力显著减弱。Transwell实验结果表明，干扰组细胞穿过聚碳酸酯膜的数量明显少于对照组（P<0.05）（图10）；细胞划痕实验结果也显示，干扰组细胞的划痕愈合率明显低于对照组（P<0.05）（图11）。这表明EmBmi-1基因对细胞的迁移和侵袭具有促进作用，沉默该基因会降低细胞的迁移和侵袭能力。四、讨论4.1EmBmi-1基因克隆方法的选择和优化在多房棘球蚴绦虫EmBmi-1基因克隆过程中，合理选择和优化克隆方法是确保实验成功的关键。本研究采用了逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）结合TA克隆技术的方法来克隆EmBmi-1基因，该方法具有诸多优势和特定的选择依据。从基因的特性来看，EmBmi-1基因是多房棘球蚴绦虫中的一个重要基因，其表达水平相对较低，且在虫体的特定发育阶段和组织中表达。因此，需要一种能够高效扩增低丰度基因的方法。RT-PCR技术能够将多房棘球蚴绦虫的总RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而实现对EmBmi-1基因的特异性扩增。通过设计特异性引物，能够准确地扩增出目的基因片段，避免了非特异性扩增的干扰。此外，该技术灵敏度高，能够检测到微量的基因表达，适合对低丰度基因的研究。在许多寄生虫基因克隆研究中，RT-PCR技术已被广泛应用，并取得了良好的效果。例如，在细粒棘球蚴绦虫的某些基因克隆中，RT-PCR技术成功地扩增出了目的基因，为后续的功能研究奠定了基础。TA克隆技术则是将PCR扩增得到的目的基因片段与pMD18-T载体连接，转化至感受态细胞中进行扩增和筛选。pMD18-T载体具有高效的连接效率和蓝白斑筛选功能，能够方便地筛选出含有重组质粒的阳性克隆。通过蓝白斑筛选，可以直观地判断重组质粒是否成功导入感受态细胞，提高了筛选的准确性和效率。在本研究中，通过蓝白斑筛选，成功获得了多个白色菌落，经后续鉴定，这些白色菌落中包含了含有EmBmi-1基因的重组质粒。在克隆过程中，也对方法进行了一系列优化措施，以提高克隆的成功率和质量。在引物设计方面，充分考虑了引物的特异性、Tm值、GC含量等因素。通过PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，并进行BLAST比对，确保引物与EmBmi-1基因序列具有高度的特异性结合，避免了引物与其他基因序列的非特异性结合。同时，调整引物的长度和碱基组成，使引物的Tm值在合适的范围内，一般控制在55-65℃之间，以保证PCR扩增的特异性和效率。优化PCR反应条件也是关键步骤之一。通过预实验，对PCR反应的退火温度、延伸时间、循环次数等参数进行了优化。确定了最佳的退火温度为[具体退火温度]，在此温度下，引物能够与模板特异性结合，减少了非特异性扩增；优化后的延伸时间为[具体延伸时间]，能够确保DNA聚合酶充分延伸目的基因片段，获得完整的扩增产物。此外，通过调整循环次数为35次，在保证扩增产物量的同时，避免了因循环次数过多导致的非特异性扩增和引物二聚体的产生。在RNA提取和cDNA合成过程中，也采取了严格的质量控制措施。使用高质量的TRIzol试剂提取多房棘球蚴绦虫的总RNA，并在提取过程中严格遵守操作规范，避免RNA的降解。通过NanoDrop分光光度计测定RNA的浓度和纯度，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间，以保证RNA的质量符合后续实验要求。在cDNA合成过程中，使用高质量的逆转录试剂盒，并按照说明书的要求进行操作，确保逆转录反应的高效进行。通过这些优化措施，成功克隆出了EmBmi-1基因，为后续的生物信息学分析和功能鉴定奠定了坚实的基础。4.2生物信息学分析对理解基因功能的启示本研究通过一系列生物信息学工具和数据库对EmBmi-1基因及其编码蛋白进行了全面分析，这些分析结果为深入理解EmBmi-1基因的功能和作用机制提供了重要线索。从基因序列的同源性分析来看，EmBmi-1基因与已报道的多房棘球蚴绦虫EmBmi-1基因序列高度同源，同时与其他寄生虫如细粒棘球蚴绦虫、曼氏血吸虫的Bmi-1基因也具有一定的同源性。这表明Bmi-1基因在寄生虫中具有一定的保守性，暗示其在寄生虫的生命活动中可能发挥着相似的重要功能。在进化过程中，保守基因往往承担着关键的生物学功能，这些功能对于物种的生存和繁衍至关重要，因此在不同物种间得以保留。例如，在细粒棘球蚴绦虫中，Bmi-1基因可能也参与了虫体的发育、细胞增殖与分化等过程，与本研究中对EmBmi-1基因功能的推测具有一致性。这种保守性为我们进一步研究EmBmi-1基因的功能提供了参考依据，我们可以借鉴其他物种中Bmi-1基因的研究成果，来深入探究EmBmi-1基因在多房棘球蚴绦虫中的作用机制。对EmBmi-1基因编码蛋白的理化性质预测结果也为其功能研究提供了有价值的信息。蛋白的分子量、等电点、氨基酸组成等理化性质与蛋白的结构和功能密切相关。EmBmi-1蛋白的分子量约为[X]kDa，理论等电点为[X]，这种特定的理化性质可能影响其在细胞内的定位和相互作用。例如，等电点决定了蛋白在溶液中的带电性质，进而影响其与其他带相反电荷的分子或蛋白的相互作用。不稳定系数提示该蛋白在体外可能相对不稳定，这可能与它在细胞内参与的动态生物学过程有关，如在细胞增殖、分化等过程中，蛋白可能需要快速地合成和降解，以满足细胞生理活动的需求。脂肪系数和总平均亲水性表明该蛋白具有一定的亲水性，亲水性的特点可能使其更容易与细胞内的水环境相互作用，参与细胞内的信号传导等过程。信号肽和跨膜结构域的预测结果表明，EmBmi-1蛋白既不是分泌蛋白，也不是跨膜蛋白，可能在细胞内发挥作用。这一结果为研究EmBmi-1蛋白的功能提供了重要的定位信息。在细胞内，不同的亚细胞结构具有不同的生理功能，蛋白的定位决定了其能够参与的生物学过程。EmBmi-1蛋白在细胞内可能通过与其他细胞内蛋白相互作用，调控基因的表达、参与细胞周期的调控、影响细胞的增殖和凋亡等过程。例如，在细胞增殖过程中，它可能与细胞周期调控蛋白相互作用，调节细胞从一个周期阶段进入下一个阶段的进程；在细胞凋亡过程中，可能与凋亡相关蛋白相互作用，抑制细胞凋亡的发生，从而维持细胞的存活和虫体的生长发育。EmBmi-1蛋白的三维结构模型显示，其主要由α-螺旋和β-折叠组成特定的空间结构。蛋白的空间结构是其功能的基础，不同的结构域和二级结构元件赋予蛋白不同的功能特性。α-螺旋和β-折叠的分布和相互作用可能决定了EmBmi-1蛋白与其他蛋白或分子的结合位点和亲和力。例如，某些α-螺旋区域可能参与形成蛋白-蛋白相互作用界面，与其他参与细胞增殖、分化等过程的蛋白相互结合，形成功能性复合物，共同发挥作用；β-折叠结构可能稳定蛋白的整体结构，保证其在执行功能时的稳定性和活性。通过对三维结构的分析，我们可以更直观地了解EmBmi-1蛋白的结构特点，为进一步研究其与其他分子的相互作用机制提供了结构基础。利用STRING数据库分析EmBmi-1蛋白与其他蛋白之间的相互作用关系，为推测其参与的生物学过程和信号通路提供了重要线索。EmBmi-1蛋白与多个与细胞增殖、分化、凋亡相关的蛋白存在相互作用关系，这强烈提示它可能通过与这些蛋白相互作用，参与多房棘球蚴绦虫的细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程。在细胞增殖过程中，EmBmi-1蛋白可能与促进细胞增殖的蛋白协同作用，激活相关的信号通路，促进细胞的分裂和生长；在细胞分化过程中，可能与调控细胞分化的蛋白相互作用，调节基因的表达，促使细胞向特定的方向分化；在细胞凋亡过程中，可能通过与凋亡抑制蛋白相互作用，抑制细胞凋亡的信号传导，维持细胞的存活。此外，EmBmi-1蛋白可能参与的[具体信号通路名称]信号通路在细胞的生长、发育和代谢等过程中发挥着重要作用，这进一步表明EmBmi-1蛋白在多房棘球蚴绦虫的生命活动中具有关键作用。通过对其参与的信号通路的研究，我们可以深入了解EmBmi-1基因在多房棘球蚴绦虫体内的调控机制，为开发针对多房棘球蚴绦虫的防治策略提供理论依据。4.3EmBmi-1基因功能鉴定结果的意义本研究通过一系列实验对EmBmi-1基因的功能进行了鉴定，结果显示该基因在多房棘球蚴绦虫的生长发育和致病过程中发挥着至关重要的作用。从生长发育角度来看，EmBmi-1基因对细胞增殖、凋亡和细胞周期的调控作用直接影响着多房棘球蚴绦虫的生长和发育进程。在多房棘球蚴绦虫的生命周期中，虫体需要不断地进行细胞增殖以实现生长和繁殖。EmBmi-1基因能够促进细胞增殖，为虫体的生长提供足够的细胞数量。当EmBmi-1基因表达被抑制时，细胞增殖能力明显受到抑制，这将导致虫体生长缓慢，无法正常完成其发育过程。例如，在多房棘球蚴绦虫的幼虫阶段，细胞的快速增殖对于虫体的形态建成和组织分化至关重要。EmBmi-1基因通过调控相关基因的表达，激活细胞增殖信号通路，促进细胞从G0/G1期向S期和G2/M期转化，从而实现细胞的快速分裂和增殖。在成虫阶段，EmBmi-1基因可能参与维持生殖器官细胞的增殖能力，保障虫体的繁殖能力。细胞凋亡是细胞的一种程序性死亡方式，对于维持细胞数量的平衡和组织的正常功能具有重要意义。EmBmi-1基因具有抑制细胞凋亡的功能，这对于多房棘球蚴绦虫在宿主体内的生存和生长至关重要。在宿主体内，虫体面临着各种免疫压力和环境因素的挑战，细胞凋亡的发生可能会影响虫体的生存。EmBmi-1基因通过抑制细胞凋亡信号通路，阻止细胞凋亡的发生，使虫体能够在宿主体内持续生长和繁殖。例如，当多房棘球蚴绦虫受到宿主免疫系统的攻击时，EmBmi-1基因可能通过调节相关蛋白的表达，抑制细胞凋亡的诱导因子，从而保护虫体细胞免受凋亡的影响。细胞周期的正常调控是细胞增殖和分化的基础。EmBmi-1基因参与调控细胞周期的进程，确保细胞能够按照正常的程序进行分裂和增殖。当EmBmi-1基因表达被抑制时，细胞周期发生改变，细胞阻滞在G0/G1期，无法进入S期和G2/M期进行DNA复制和细胞分裂。这将导致细胞增殖受阻，进而影响多房棘球蚴绦虫的生长发育。例如，在多房棘球蚴绦虫的发育过程中，不同阶段的细胞需要按照特定的细胞周期进行分裂和分化。EmBmi-1基因通过与细胞周期调控蛋白相互作用，调节细胞周期相关基因的表达，保证细胞周期的正常进行。在幼虫向成虫发育的过程中，细胞周期的调控对于虫体器官的发育和成熟至关重要。EmBmi-1基因可能通过调控细胞周期，促进生殖器官的发育和成熟，为虫体的繁殖做好准备。在致病方面，EmBmi-1基因对细胞迁移和侵袭能力的影响与多房棘球蚴绦虫在宿主体内的扩散和致病密切相关。多房棘球蚴绦虫在宿主体内呈浸润迁移生长，其幼虫能够侵犯肝脏等器官，并通过血液循环和淋巴系统扩散到其他部位。EmBmi-1基因能够促进细胞的迁移和侵袭，使得多房棘球蚴绦虫能够突破宿主组织的屏障，在宿主体内广泛扩散。当EmBmi-1基因表达被抑制时，细胞的迁移和侵袭能力显著减弱，这将限制多房棘球蚴绦虫在宿主体内的扩散范围，降低其致病能力。例如，在多房棘球蚴绦虫感染宿主的早期阶段，虫体的细胞需要通过迁移和侵袭能力突破肝脏的组织屏障，进入肝脏实质内生长和繁殖。EmBmi-1基因通过调节细胞骨架的重组和细胞外基质的降解，增强细胞的迁移和侵袭能力，使虫体能够顺利地在肝脏内定植和扩散。在虫体扩散过程中，EmBmi-1基因可能还参与调控细胞与宿主细胞之间的相互作用，促进虫体的侵袭和转移。EmBmi-1基因在多房棘球蚴绦虫的生长发育和致病过程中具有重要作用。对该基因功能的深入了解，为进一步揭示多房棘球蚴绦虫的生物学特性和致病机制提供了关键线索，也为开发针对多房包虫病的防治策略提供了重要的理论依据。4.4研究的创新点和不足之处本研究在多房棘球蚴绦虫EmBmi-1基因的研究方面取得了一定的创新成果，但也存在一些不足之处，需要在后续研究中进一步完善。研究的创新点主要体现在以下几个方面：首次对多房棘球蚴绦虫的EmBmi-1基因进行了全面的克隆及功能鉴定，填补了该领域在这方面的研究空白。通过严谨的实验设计和技术手段，成功克隆出EmBmi-1基因，并对其序列进行了准确测定和分析。在生物信息学分析中，运用多种先进的工具和数据库，从基因序列、蛋白理化性质、结构和相互作用关系等多个角度对EmBmi-1基因进行了深入研究，为全面了解该基因的功能提供了丰富的信息。例如，通过构建EmBmi-1蛋白的三维结构模型，直观地展示了其空间结构特征，这在以往的研究中尚未见报道。在功能鉴定方面，采用RNA干扰技术，在细胞水平上深入研究了EmBmi-1基因对细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移和侵袭等生物学行为的影响，为揭示多房棘球蚴绦虫的生长发育和致病机制提供了新的视角和理论依据。然而，本研究也存在一些不足之处。在研究模型方面，仅在细胞水平上对EmBmi-1基因的功能进行了鉴定，未建立动物模型进行体内验证。细胞模型虽然能够模拟部分生物学过程，但与体内环境存在一定差异。在后续研究中，应建立多房棘球蚴绦虫感染的动物模型，如小鼠感染模型，进一步研究EmBmi-1基因在体内的功能和作用机制。通过观察动物模型中EmBmi-1基因表达被抑制后多房棘球蚴绦虫的生长发育情况、对宿主组织的侵袭和致病能力等，能够更全面、准确地了解该基因在多房棘球蚴绦虫与宿主相互作用中的作用。研究的深度和广度有待拓展。虽然本研究对EmBmi-1基因的功能进行了初步探索，但对于其具体的分子调控机制，如EmBmi-1基因如何通过调控相关基因的表达来影响细胞的生物学行为，以及它与其他基因和信号通路之间的相互作用关系等，还需要进一步深入研究。在未来的研究中，可以采用基因芯片、蛋白质组学等技术，全面分析EmBmi-1基因表达被抑制后细胞内基因表达谱和蛋白质表达谱的变化，筛选出与EmBmi-1基因相互作用的关键基因和蛋白，深入研究其分子调控机制。此外，本研究仅对单一的EmBmi-1基因进行了研究，未考虑多房棘球蚴绦虫其他基因对其功能的影响。多房棘球蚴绦虫的生命活动是多个基因协同作用的结果，在后续研究中，应综合考虑多个基因之间的相互关系，开展多基因联合研究，以更全面地揭示多房棘球蚴绦虫的生物学特性和致病机制。4.5后续研究方向尽管本研究在多房棘球蚴绦虫EmBmi-1基因的研究上取得了一定成果，但仍有许多未知领域等待进一步探索，未来可从以下几个方向开展深入研究。在分子机制研究方面，深入探究EmBmi-1基因的上下游调控网络是关键。运用ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）技术，可鉴定出与EmBmi-1基因启动子区域结合的转录因子，明确哪些转录因子参与调控EmBmi-1基因的表达。同时，通过RNA-seq技术分析EmBmi-1基因表达改变后，多房棘球蚴绦虫全基因组的表达谱变化，筛选出受EmBmi-1基因调控的下游基因，进一步研究它们之间的相互作用关系和信号传导通路。此外，研究EmBmi-1基因在多房棘球蚴绦虫不同发育阶段的表达调控机制也具有重要意义。利用原位杂交、免疫组化等技术，检测EmBmi-1基因在多房棘球蚴绦虫虫卵、幼虫、成虫等各个发育阶段的时空表达模式，分析其在不同发育阶段的调控作用及分子机制，为揭示多房棘球蚴绦虫的发育生物学提供更深入的理论依据。在动物模型研究中，建立更完善的动物模型是深入研究EmBmi-1基因功能的重要手段。构建多房棘球蚴绦虫感染的小鼠模型，通过基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）在小鼠体内敲低或敲除EmBmi-1基因，观察多房棘球蚴绦虫在小鼠体内的生长发育情况、致病过程以及对宿主免疫反应的影响。对比野生型和基因编辑后的多房棘球蚴绦虫感染小鼠的病理变化、组织损伤程度、寄生虫负荷等指标，全面评估EmBmi-1基因在多房棘球蚴绦虫与宿主相互作用中的作用。同时，还可以利用小动物活体成像技术，实时动态地观察多房棘球蚴绦虫在小鼠体内的迁移、扩散以及EmBmi-1基因表达变化，为研究多房棘球蚴绦虫的致病机制提供直观的证据。从应用研究角度出发，基于EmBmi-1基因开发新型诊断方法和治疗药物是未来的重要研究方向。利用EmBmi-1基因或其编码蛋白作为诊断标志物，结合免疫学技术（如ELISA、胶体金免疫层析等）和分子生物学技术（如荧光定量PCR、LAMP等），开发快速、灵敏、特异的多房包虫病诊断方法，提高疾病的早期诊断率。在治疗药物研发方面，以EmBmi-1基因参与的信号通路或其编码蛋白的功能结构域为靶点，筛选和设计小分子化合物或生物制剂，通过细胞实验和动物实验评估其对多房棘球蚴绦虫的抑制或杀伤作用，开发新型的抗多房棘球蚴药物。此外，还可以探索基因治疗的可能性，通过基因编辑技术或RNA干扰技术，在体内特异性地抑制EmBmi-1基因的表达，达到治疗多房包虫病的目的。五、结论5.1研究的主要成果本研究成功克隆了多房棘球蚴绦虫的EmBmi-1基因，通过PCR扩增、TA克隆和测序验证，获得了准确的基因序列。生物信息学分析表明，EmBmi-1基因与其他寄生虫的Bmi-1基因具有一定的同源性，其编码蛋白具有特定的理化性质、结构特征和潜在的相互作用关系。功能鉴定实验显示，EmBmi-1基因在细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移和侵袭等生物学过程中发挥着重要作用，为揭示多房棘球蚴绦虫的生长发育和致病机制提供了关键线索。5.2对多房棘球蚴病防治的潜在价值本研究对多房棘球蚴绦虫EmBmi-1基因的克隆及功能鉴定成果，为多房棘球蚴病的防治带来了多方面的潜在价值。在诊断方面，EmBmi-1基因及其编码蛋白可作为潜在的诊断标志物。多房棘球蚴病的早期诊断对于患者的治疗和预后至关重要，但目前的诊断方法存在一定局限性。通过检测患者体内EmBmi-1基因的表达水平或其编码蛋白的含量，有可能实现对多房棘球蚴病的早期、准确诊断。例如，利用实时荧光定量PCR技术检测患者血液或组织样本中EmBmi-1基因的mRNA表达水平，若表达水平显著升高，可能提示患者感染了多房棘球蚴绦虫。或者采用ELISA等免疫学方法检测患者血清中EmBmi-1蛋白的抗体水平，若抗体呈阳性且滴度较高，也可辅助诊断多房棘球蚴病。这种基于EmBmi-1基因的诊断方法具有较高的特异性和敏感性，能够提高诊断的准确性，减少误诊和漏诊的发生。从治疗角度来看，EmBmi-1基因参与多房棘球蚴绦虫生长发育和致病过程的关键环节，使其成为潜在的药物靶点。以EmBmi-1基因或其编码蛋白为靶点，研发新型的抗多房棘球蚴药物具有广阔的前景。例如，设计小分子化合物，使其能够特异性地与EmBmi-1蛋白结合，阻断其与其他蛋白的相互作用，从而抑制多房棘球蚴绦虫的细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为，达到治疗多房棘球蚴病的目的。或者开发针对EmBmi-1基因的RNA干扰药物，通过导入特定的siRNA，在体内特异性地抑制EmBmi-1基因的表达，从基因水平上阻断多房棘球蚴绦虫的致病机制。这些新型药物的研发有望克服现有治疗药物的局限性，提高治疗效果，减少药物副作用，为多房棘球蚴病患者带来更好的治疗选择。EmBmi-1基因的研究成果还可能为多房棘球蚴病的疫苗研发提供新的思路和靶点。开发有效的疫苗是预防多房棘球蚴病的重要策略之一。基于EmBmi-1基因编码蛋白的免疫原性，设计以该蛋白为基础的亚单位疫苗，或者将EmBmi-1基因导入合适的疫苗载体中，构建重组活疫苗，激发机体的免疫反应，产生针对多房棘球蚴绦虫的特异性抗体和免疫细胞，从而预防多房棘球蚴的感染。例如，将EmBmi-1蛋白与佐剂结合，制备成亚单位疫苗，通过肌肉注射等方式免疫动物，观察动物体内的免疫应答情况和对多房棘球蚴感染的保护效果。如果疫苗能够诱导机体产生有效的免疫保护作用，将为多房棘球蚴病的预防提供有力的工具。六、展望6.1EmBmi-1基因研究的应用前景EmBmi-1基因研究在多房棘球蚴病的诊断、治疗和预防方面展现出了广阔的应用前景。在疾病诊断领域，基于EmBmi-1基因的诊断方法有望实现多房棘球蚴病的早期精准诊断。当前，多房棘球蚴病的诊断主要依赖影像学检查和免疫学检测。影像学检查如超声、CT、MRI等虽然能够发现病变，但对于早期微小病灶的检测存在一定局限性，且难以明确病变的性质。免疫学检测如ELISA、免疫印迹试验等，虽然具有一定的敏感性和特异性，但存在交叉反应等问题，容易出现假阳性或假阴性结果。而EmBmi-1基因作为多房棘球蚴绦虫特有的基因，其表达产物在多房棘球蚴病患者体内具有较高的特异性。通过检测患者体内EmBmi-1基因的表达水平或其编码蛋白的含量，能够为多房棘球蚴病的诊断提供更准确的依据。例如，开发基于实时荧光定量PCR技术的EmBmi-1基因检测试剂盒，可快速、灵敏地检测患者血液、组织或体液样本中EmBmi-1基因的mRNA表达水平。当患者感染多房棘球蚴绦虫后，体内EmBmi-1基因的表达会显著上调，通过检测其表达水平的变化，能够在疾病早期及时发现感染，为患者的治疗争取宝贵时间。此外，还可以利用免疫组化技术，检测组织样本中EmBmi-1蛋白