实验动物组织切片技术流程

实验动物组织切片技术流程###一、实验动物组织切片技术概述

组织切片技术是实验动物研究中不可或缺的技术手段，广泛应用于病理学诊断、生理学研究、药物开发等领域。该技术通过将实验动物的组织样本制成微薄的切片，并在显微镜下观察其细胞结构和组织形态，从而为研究人员提供直观的生物学信息。本流程旨在规范实验动物组织切片的操作步骤，确保切片质量，提高实验结果的可靠性。

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###二、实验动物组织切片技术流程

####（一）组织样本制备

1.**样本采集**

-选择合适的实验动物，根据研究目的确定采样部位。

-使用无菌器械进行组织采集，确保样本无污染。

-样本大小一般为1cm×1cm×4mm，过小或过大均会影响切片效果。

2.**样本固定**

-将采集的组织样本立即置于4%多聚甲醛溶液中固定。

-固定时间根据组织类型而定，一般为24小时～48小时。

-固定过程中避免样本变形，可使用组织镊子轻柔固定。

####（二）组织处理

1.**脱水**

-将固定后的样本依次置于不同浓度乙醇溶液中脱水：70%乙醇（12小时）、80%乙醇（12小时）、90%乙醇（12小时）、95%乙醇（12小时）、无水乙醇（2次，每次12小时）。

-脱水过程中需更换乙醇溶液，确保脱水充分。

2.**透明**

-将脱水后的样本置于二甲苯中透明，每次12小时，共2次。

-透明后的样本无色透明，便于后续包埋。

3.**包埋**

-将透明后的样本置于石蜡中包埋，使用包埋模具固定样本位置。

-包埋过程中避免气泡进入，影响切片效果。

####（三）切片制作

1.**切片**

-使用切片机将包埋后的样本切成4μm～5μm厚的切片。

-切片时需调整切片厚度，确保切片均匀。

-切片过程中使用冷却液（如乙醇）防止切片粘连。

2.**贴片**

-将切好的切片置于载玻片上，使用贴片剂（如多聚赖氨酸）固定切片。

-贴片后需水平晾干，避免切片移位。

####（四）染色与观察

1.**染色**

-常用染色方法包括HE染色（苏木精-伊红染色）、特殊染色（如免疫组化染色）。

-HE染色步骤：脱蜡水化（二甲苯→无水乙醇→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇→蒸馏水）、染色（苏木精染色）、分化（1%盐酸酒精分化）、复染（伊红染色）、脱水透明（95%乙醇→无水乙醇→二甲苯）、封片（中性树胶封片）。

2.**观察**

-使用显微镜观察染色后的切片，调整显微镜参数（如聚光器、光圈）以获得清晰图像。

-记录观察结果，拍照存档。

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###三、质量控制与注意事项

1.**样本固定**

-固定时间不足或固定过度均会影响切片质量，需严格控制固定时间。

-固定过程中避免样本挤压变形。

2.**脱水与透明**

-脱水不充分会导致切片脆化，透明不充分则影响染色效果。

-更换乙醇溶液时需缓慢进行，避免产生气泡。

3.**切片**

-切片厚度需均匀，过厚或过薄均影响观察效果。

-切片机需定期维护，确保切割锋利。

4.**染色**

-染色时间需精确控制，过长或过短均影响染色效果。

-染色过程中避免样本干燥，可使用保湿装置。

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###三、质量控制与注意事项

组织切片技术的每个环节都可能影响最终结果的准确性和可靠性。因此，在操作过程中必须严格把控质量，并注意以下事项：

**(一)样本采集阶段的质量控制与注意事项**

1.**选择合适的实验动物与组织部位：**

***动物选择：**根据研究目的选择健康、生长状况一致的实验动物。记录动物的品种、性别、年龄、体重等基本信息，以减少个体差异带来的误差。

***部位选择：**确定采样部位时，应尽量选择能代表研究目的且损伤较小的区域。例如，进行器官病理学检查时，应避开明显损伤或手术疤痕区域。若需多点取材，应记录各点在器官内的具体位置关系。

***样本大小：**样本体积需足够大，以便在垂直于主要结构方向上切取多个连续切片，满足后续观察和分析的需求。一般建议样本厚度不低于4mm，面积不小于10mm²。

2.**无菌操作与组织完整性保护：**

***无菌环境：**采样应在无菌条件下进行，如使用超净工作台或生物安全柜，以防止微生物污染影响组织固定和后续处理。

***器械消毒：**所有采样器械（如手术刀、组织镊、解剖剪等）必须彻底清洁并灭菌（如高压蒸汽灭菌或使用一次性无菌器械）。

***减少损伤：**操作过程中动作需轻柔，避免对组织造成机械性损伤、挤压或出血，这些都会干扰组织形态和染色效果。使用合适的组织镊夹持组织边缘，避免夹伤组织内部。

3.**及时固定的重要性：**

***立即固定：**组织采集后应立即放入固定液中，最大程度地减少组织自溶和结构变化。延迟固定会导致细胞成分分解，酶活性改变，最终影响病理诊断的准确性。

***固定液选择：**常用的固定液是多聚甲醛（Formalin），其能较好地固定蛋白质和细胞结构。固定液的浓度（通常为4%）和pH值需准确配制并使用去离子水或蒸馏水稀释。

***固定容器：**使用足够大的固定容器，确保组织在固定液中没有褶皱或压迫，保证固定均匀。对于大块组织，可能需要适当支撑，防止其沉底或漂浮变形。

**(二)组织处理阶段的质量控制与注意事项**

1.**脱水过程控制：**

***梯度脱水：**严格遵循由低浓度到高浓度的梯度脱水顺序。每次更换乙醇浓度前，需确保组织充分浸泡，通常以组织完全透明无色为准，可通过观察组织块边缘或切片时的感受来判断。

***更换频率：**建议每隔4-6小时更换一次乙醇溶液，尤其是在较高浓度乙醇（如95%及以上）阶段，以充分去除组织中的水分。

***避免干燥：**脱水过程中严禁组织样本干燥，干燥会导致组织变脆、收缩变形，甚至裂解，严重影响切片和染色。若短暂离开，需将样本保持在低浓度乙醇或纯水中。

2.**透明过程控制：**

***二甲苯作用：**透明是为了使组织完全浸透，并使其能被石蜡浸润。二甲苯是常用的透明剂，需确保组织在二甲苯中充分透明，通常观察组织变得无色透明即可。

***操作环境：**透明过程应在通风良好的环境下进行，避免吸入二甲苯蒸气。

***重复透明：**通常需要两次二甲苯透明，每次12-24小时，以确保组织内部也完全透明。

3.**包埋过程控制：**

***石蜡选择：**使用熔点适宜的石蜡（如中性石蜡，熔点约52-54°C）进行包埋。石蜡需纯净无杂质，使用前需充分脱气（如真空脱气）以去除气泡。

***包埋模具：**使用合适的包埋模具固定组织，确保组织位置准确、平整。模具材质需不与石蜡粘连。

***冷却速度：**将含有组织的石蜡模具缓慢冷却至室温或略高于石蜡熔点以下，使石蜡缓慢结晶，避免组织因快速冷却而产生裂纹或变形。冷却后置于4°C冰箱过夜，使石蜡完全硬化。

**(三)切片制作阶段的质量控制与注意事项**

1.**切片机准备与校准：**

***切片机清洁：**使用前必须彻底清洁切片机，特别是刀片轨道和推进器，避免污染切片。

***刀片质量与锋利度：**刀片是影响切片质量的关键因素。必须使用质量合格、锋利的切片刀。定期检查刀片锋利度，使用钝刀片会导致切片破碎、毛糙。可使用标准组织片测试刀片锋利度。

***温度控制：**确保切片机冷却系统工作正常，低温有助于提高石蜡的硬度，使切片更易切割且减少碎裂。

2.**切片操作技巧：**

***组织定位：**将包埋好的组织块平稳放置在切片机的载物台上，使用定位器准确固定组织位置，确保切片方向（如垂直于组织主要结构）正确。

***切片厚度：**根据观察目的调整切片厚度。病理诊断常用4-5μm切片，而超微结构观察则需要更薄的切片（1-2μm）。使用切片机厚度调节器精确设定。

***推进速度与压力：**缓慢、匀速地推进组织，避免过快或过慢，同时使用适宜的压力。压力过大易损坏切片，压力过小则切片不易分离。

***切片收集：**使用切片刀前端的切片收集器（如毛笔、专用接收平台）轻轻承接下落的切片，避免切片破碎或粘连。收集器需预先用生理盐水或乙醇湿润（如毛笔蘸取）。

***冷却与展片：**切下的切片在刀片上冷却后，需迅速将其转移到预热（约37°C）并湿润（滴加蒸馏水或生理盐水）的载玻片上，使用展片镊轻轻展开，确保切片平整、无气泡。

3.**贴片过程控制：**

***载玻片处理：**使用洁净、无划痕的载玻片。可预先处理载玻片以提高附着力，常用方法包括：清洁→干燥→浸入95%乙醇30秒→浸入0.1M多聚赖氨酸溶液5-10分钟→空气干燥或温箱（37°C）干燥15-30分钟。

***滴加贴片剂：**在干燥的载玻片上滴加适量的贴片剂溶液（如多聚赖氨酸溶液、蛋白浸渍液等）。

***放置切片：**将展平的切片迅速、轻柔地放置在滴有贴片剂的载玻片上，调整切片方向。

***固定：**将载玻片水平放置于台面上，静置片刻让贴片剂挥发或干燥，然后用吸水纸吸去多余水分，最后放入温箱（如60°C）干燥30分钟～1小时，或过夜，使贴片剂固定。

**(四)染色与观察阶段的质量控制与注意事项**

1.**染色质量控制：**

***试剂配制与保存：**染料（如苏木精、伊红）、分化液（如盐酸酒精）、显色剂等均需按标准方法精确配制，并妥善保存，避免变质。使用前检查试剂质量。

***染色时间控制：**严格按照标准流程控制各步染色时间。染色时间过短可能导致着色不足，过长则可能过度着色甚至破坏结构。可根据组织类型和切片厚度微调，但需记录。

***温度控制：**染色过程中，某些步骤（如苏木精染色、分化）需要特定的温度（如60°C水浴），需使用恒温水浴锅确保温度稳定。

***染色缸管理：**每个染色缸应专用于某一种染色液，避免交叉污染。染色液使用后需妥善处理或按规范废弃。

***HE染色具体步骤细节：**

***脱蜡水化：**依次将切片放入二甲苯Ⅰ（10-15分钟）、二甲苯Ⅱ（10-15分钟）、100%乙醇（3次，每次5分钟）、95%乙醇（5分钟）、85%乙醇（5分钟）、70%乙醇（5分钟）、蒸馏水（3次，每次5分钟）。每次更换溶液时需充分漂洗，倒掉旧液，防止乙醇浓度梯度变化影响染色。

***苏木精染色：**将切片浸入新配或使用中的苏木精染液中，根据需要可在37°C温箱中染色30分钟～2小时，或室温染色过夜。期间观察染色情况，达到理想着色后取出。

***分化：**小心取出切片，放入1%盐酸酒精（或乙醇+浓盐酸混合液）中，在酒精灯火焰上微温（切忌煮沸）分化，直至蓝色组织轮廓清晰显现。分化时间需根据组织类型和染色深浅调整，通常数分钟至十几分钟。分化过度会使细胞核过浅，分化不足则背景着色深。

***冲洗：**分化后立即用蒸馏水快速、充分冲洗（多次短时冲洗或一次长时间冲洗，如15-20分钟），去除盐酸，停止分化。

***伊红复染：**将切片浸入伊红染液中（如50%乙醇配制的伊红染液）染色1-5分钟，使细胞质着色。

***脱水透明：**依次放入70%乙醇（1分钟）、85%乙醇（1分钟）、95%乙醇（2次，每次1分钟）、100%乙醇（2次，每次1分钟）、无水乙醇（2次，每次1分钟）、二甲苯Ⅰ（5分钟）、二甲苯Ⅱ（5分钟）。

***封片：**在盖玻片边缘滴加适量中性树胶（如中性树胶、DAB封片剂），用镊子轻轻盖上盖玻片，避免产生气泡。可用吸水纸吸去载玻片下多余树胶。必要时可用透明封片剂（如中性树胶加指甲油）封片，提高防潮性和长期保存性。

2.**显微镜观察与photography：**

***显微镜检查：**使用显微镜观察切片时，先低倍镜整体观察，找到目标区域，再转高倍镜详细观察。调整聚光器、光圈、对比度调节等，获得清晰、对比度适宜的图像。

***图像摄影：**使用显微镜摄影系统拍摄图像时，需选择合适的物镜和目镜组合，调整曝光时间、光圈等参数。拍摄前校准焦点，确保图像质量。记录拍摄参数。

***结果记录：**对观察到的现象进行详细、客观的记录，可绘制简图辅助说明。将图像和文字记录整理归档。

**(五)整体流程的注意事项**

1.**实验室环境：**整个流程应在清洁、相对恒温、湿