DB43∕T 1076-2015 犬猫血清中狂犬病抗体的测定酶联免疫吸附法

ICS11.220DB43DB43/T1076—2015犬猫血清中狂犬病抗体的测定酶联免疫吸附法ofDogsandCatsEnzyme-linkedImmunosorbentAssay2015-07-20发布2015-09-20实施湖南省质量技术监督局发布I前言 Ⅱ 2规范性引用文件 4仪器与设备 5试剂与材料 6操作程序 7检测有效性及结果判定 附录A（资料性附录）试剂盒的组成、说明及使用注意事项 本标准按GB／T1.1—2009的规则编制。本标准某些内容可能涉及专利，本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省畜牧水产局提出并归口。本标准起草单位：长沙市动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：刘增再、宁华杰、陈智、郑冠伟、丑亚琴、郑姣妹、唐爱明、黄琼、刘伟、欧建伟、薛爽、龙燕。犬猫血清中狂犬病抗体的测定酶联免疫吸附法本标准规定了犬猫血清中狂犬病免疫抗体的测定方法。本标准适用于接种狂犬病疫苗的犬猫血清中狂犬病免疫抗体的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法向包被有狂犬病病毒抗原的酶标板中加入犬猫血清，犬猫血清中的狂犬病抗体与酶标板中的抗原相结合，然后加入酶标记物，酶标记物与酶标板上的抗原抗体结合物形成复合物，最后加入底物，底物与酶标记物反应形成有颜色的化合物，终止反应后，用酶标仪测量其OD值，通过阳性质控的OD值确定犬猫血清中有无狂犬病免疫抗体。4仪器与设备4.1酶标仪：内置450nm和630nm滤光片。4.4恒温培养箱。4.5振荡混匀器。5试剂与材料犬猫狂犬病免疫抗体ELISA检测试剂盒：试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录A。实验用6操作程序6.1质控分布与稀释用单道移液器向A1，A2，B1，B2酶标板微孔里各加90μL样品稀释液，分别向A1，A2孔里加 DB43/T1076—20156.2样品的预稀释向每个血清稀释板微孔里各加入90μL样品稀释液，然后分别加入10μL待检血清，使样品预稀释液的稀释比例为1：10。6.3样品的分布与稀释向剩余每个酶标板微孔里加入90μL样品稀释液，然后分别加入10μL样品预稀释液，用振荡混匀器充分混匀后，用封口膜封好，使样品最终稀释比例为1：100。6.4孵育（37±1）℃孵育（60±5）min。6.5洗液的配制按1：10的比例，用实验用水稀释浓缩洗涤液。6.6洗板取掉封口膜，先甩去酶标板微孔里的液体，然后用多道移液器向每个酶标板微孔里加入300μL洗液，每次浸泡30s，再弃去洗液，先后洗涤5次，最后在吸水纸上拍干。6.7加酶标记物按1：10的比例，用酶标记物稀释液稀释酶标记物后，向每个酶标板微孔里加入100μL稀释好的酶标记物，用振荡混匀器充分混匀后，用封口膜封好。6.8孵育6.9洗板6.10底物反应向每个酶标板微孔里加入100μL过氧化物酶底物，室温（20～25）℃,避光孵育（30±5）min。6.11终止反应向每个酶标板微孔里加入50μL终止液，轻轻摇动酶标板使之混匀，使孔内无气泡。6.12测量OD值用酶标仪在双波长450nm和630nm，或者单波长450nm下测量OD值。7检测有效性及结果判定7.1当阳性质控OD值≥0.300，并且当阴性质控OD值<0.5×阳性质控OD值时，实验结果成立。7.2样品的OD值≥阳性OD值，则可判定为狂犬病免疫抗体阳性。（资料性附录）试剂盒的组成、说明及使用注意事项A.1试剂盒的组成A.2注意事项A.2.1使用前所有的试剂应在（18～25）℃回温2h。A.2.2将所有的试剂和样品作为危险生物品处理。A.2.3