基因治疗专题知识专家讲座

第九章基因治疗(genetherapy)基因治疗是经过一定方式，将野生型基因或有治疗作用DNA序列导入人体靶细胞来纠正或改善人类遗传缺点。早期基因治疗概念比较局限，仅指遗传缺点基因修复，主要用于单基因遗传病治疗。现在基因治疗概念：凡是采取分子生物学方法和原理，在核酸水平上开展疾病治疗方法都可称为基因治疗。如对癌症、多基因病、传染性疾病、心血管疾病等治疗。第1页1972年T.Friedmann和R.Roblin在Science上发表了题为“基因治疗人类遗传病（Genetherapyforhumangeneticdisease）”文章。但鉴于体外重组技术刚才问世，人们对“基因治疗”尚感到远不可及，因而未得到学术界认可。第2页

第3页直到1989年美国NIHR.M.Blase和W.F.Anderson提出“基因治疗重症联合免疫缺损（SCID）”临床方案得到同意，并于1990年，他们用腺苷酸脱氨酶(ADA)基因治疗了一例ADA基因缺点造成SCID4岁女孩Evans，这是世界上第一例基因治疗临床试验，2年后Evans血液内T细胞数量靠近正常水平，且ADA基因表示良好，随之世界各国都掀起了研究基因治疗热潮，很多遗传病患者都满怀信心地接收基因治疗。R.M.Blase和W.F.Anderson也被公认为是基因治疗先驱。第4页不幸是1999年美国发生了格尔辛基（J.Gelsinger）基因治疗副反应事件，美国当即下令暂停全部基因治疗临床试验。无独有偶，法国也发生了造成患者死亡“泡泡男孩（bubbleboy）”事件，法国政府也立即终止了该项试验。使基因治疗骤然陷入了困境。经过多年寂静后，伴随分子生物学飞速发展，细胞重编程等很多新技术建立，尤其是年日本山中伸弥等成功地将皮肤细胞诱导成多能干细胞后，又点燃了人们对基因治疗所寄予新期盼第5页第一节．基因治疗策略一．体细胞基因治疗策略基因治疗可分为两大类:生殖细胞基因治疗(germcellgenetherapy)体细胞基因治疗(somaticcellgenetherapy)生殖细胞基因治疗是将目标基因转入生殖细胞系中。不仅纠正患者遗传缺点，而且患者生殖细胞也带有被校正基因型。对于小鼠等动物，是能够经过转基因进行生殖细胞系治疗。第6页(a)受精卵注射(b)胚系基因治疗(c)体细胞基因治疗转基因转基因细胞转基因注入受精卵中转基因注入囊胚腔嵌合小鼠嵌合性腺转基因克隆第7页体细胞基因治疗这种方法试图经过载体，将目标基因转入一些患者体细胞中来纠正异常表型。当前，目标基因不可能转入身体全部体细胞内。

遗传病是因为致病基因在一些特定组织中表示结果。经过从有缺点基因型患者体中取出一些细胞，将克隆野生型基因导入到这些细胞中，再将转基因细胞转入患者体内，为患者提供正常基因功效。第8页体细胞基因治疗策略：（1）原位基因修复（insitugenecorrection）：将致病基因突变位点加以矫正，使致症状得到完全恢复。（2）基因置换(genereplacement)：用外源野生型基因原位替换病变细胞内致病基因，来纠正突变基因功效，使细胞内DNA完全恢复正常状态。（3）基因激活(geneactivation)

：有些正常基因不能表示并非发生了基因突变，而是因为被错误地甲基化或编码区组蛋白去乙酰化所致；也有是编码区正常，但调控区发生了突变，如开启子突变使基因也无法表示。前者能够经过去甲基化或乙酰化使基因恢复活性；后者能够加入正常开启子来激活基因。第9页(4)基因增效(geneaugmentation)：将目标基因导入病变细胞或其它细胞，目标基因表示产物能修饰缺点细胞功效或使原有一些功效得以加强。(5)基因干扰

：也称基因失活，有两种干扰方法：

①抑制有害基因：导入抑癌基因（TSG)来抑制癌基因异常表示，但不能恢复癌基因正常功效；②

封闭有害基因：用反义RNA或小分子抑制RNA(siRNA)来封闭癌基因基因，一样不能恢复癌基因正常功效，但可用来抑制病原体关键基因。(6)

免疫调整：将抗体、抗原或细胞因子基因导入患者体内，改变患者免疫状态，到达预防和治疗疾病目标。(7)

药品敏感疗法：应用药品敏感基因转染肿瘤细胞，以提升其对药品敏感性。第10页二、基因治疗关键步骤基因治疗关键包含以下三个方面：①目标基因选择；②靶细胞选择；③选择安全而高效方法和载体系统；用于基因治疗基因需满足以下几点;①在体内仅有少许表示就可显著改进症状；②该基因过分表示不会对机体造成危害；③外源野生型目标基因含有适宜受体细胞并能在体外有效表示；④含有安全有效转移载体和方法，以及可供利用动物模型。第11页第12页三、基因治疗靶细胞选择当前基因治疗中尚不能使用生殖细胞作为靶细胞，而只能使用体细胞。选择靶细胞须考虑：①最好为组织特异性细胞；②细胞易取得，具有增殖优势，生命周期长，能存活几个月至几年；③离体细胞较易受外源基因转化；④细胞坚固，能耐受处理，回植到体内易成活。当前惯用靶细胞有：

造血细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、肌肉细胞、肿瘤细胞等。第13页四、体细胞基因治疗路径当前体细胞基因治疗策略可分为两种：（1）间接体内法，即先体外后体内(exvivo)方法（2）直接体内（invivo）法。先体外后体内就是将靶细胞由患者体内取出，于体外完成基因转移后再回输到患者体内，此种方法优点为靶细胞明确、转染效率高；直接体内是将目标基因插入载体，经修饰后直接注入患者某特定组织中。此方法转染效率低，但较前者简便、费用低，对于一些疾病，如重症联合免疫缺点病(SCID)基因治疗效果是很好。第14页（一）

体外基因治疗或exvivo基因治疗：（1）从患者体内取出带有缺点基因细胞，并培养；（2）将带有目标基因载体经过转染或感染转移，到培养靶细胞中，进行遗传修正；（3）对遗传修正细胞进行选择和培养；（4）处理过细胞用融合或移植方法转入患者体内。第15页组注射织全身注入质粒DNA基因枪DNA脂质体重组病毒体内基因治疗第16页成纤维细胞体细胞先体外后体内基因治疗第17页（二）

体内基因治疗将含有治疗功效基因直接转入病人某特定组织中。（1）利用反转录病毒载体时，要求靶细胞处于分裂期，但许多需进行基因治疗组织多处于静止期。（2）当前用温和病毒载体（腺病毒和单纯性疱疹病毒）直接注入对应组织。第18页第二节基因转移方法

基因转运方法当前已经有各种，总可分为非生物方法和病毒方法两大类。前者包含裸露DNA直接注射、多价阳离子-DNA复合物转化，电转化，脂质体共转化和受体介导转化等。后者指经过携带目标基因病毒感染靶细胞并表示出目标基因方法。第19页一、基因转移非生物方法理化方法介导基因转移（非病毒载体）是当前发展较快新型载体系统，其优点是低毒和低免疫反应。其携带外源基因载体常独立存在细胞质中，不整合到宿主基因组中。非病毒载体普通不受基因插入片断大小限制，还有使用简单、取得方便、便于保留和检测等特点。当前惯用方法有以下几个：第20页（一）磷酸钙共沉淀法当将氯化钙，DNA和PBS（phosphate-bufferedsaline）迟缓混合时，即形成磷酸钙微沉淀。如有培养细胞（须先用氯化钙处理）存在时，DNA-磷酸钙沉淀物能附着在细胞膜上，经过内吞作用而进入细胞中。第21页（二）脂质体介导转染将磷脂，胆固醇或其它脂类乙醚溶液注入60℃

DNA水溶液中。乙醚在60℃

时气化蒸发，其速度达到2ml/h时即形成单层或双层脂质体小泡，其直径0.2~0.5µm，它将DNA包裹在其中。带有正电荷脂质体-DNA复合体很轻易和培养基上细胞融合，使DNA分子进入细胞内。这种简单技术由PhilipFelgner等建立。第22页（三）电穿孔法真核细胞电穿孔是将细胞重悬浮于含有一定浓度DNA（约0.1mg/ml）N-2-羟乙基哌嗪-N‘-2-乙磺酸（HEPES，N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonate)缓冲盐溶液中。然后将此悬浮细胞-DNA放到一个特殊电穿孔小槽中，小槽设有正、负电极与电源相连接。第23页（四）

直接注射法：(1)将含有外源DNA溶液直接注入肌肉

或甲状腺等可引发邻近细胞摄入DNA和目标基因表示产物。(2)重组DNA可贮存于5％～30％蔗糖溶液中，也可溶在生理盐水或PBS（磷酸缓冲液）中以备注射。第24页（五）

微粒子轰击法：用高能微粒子轰击，将外源DNA导入培养细胞或活哺乳动物组织内，在贴壁细胞、悬浮细胞、活体组织中均能很好表示。亚微粒钨和金能自发吸附DNA。用这种方法基因可在各种组织中表示。第25页（六）受体介导基因转移质粒DNA和某种特异配体之间形成复合体，而这种配体能被特定细胞表面受体所识别。使外源基因可在活体内导向特定细胞、组织或器官。但用受体介导时所形成内吞小泡通常要被送到溶酶体中，可使此小泡内溶物被降解。然而经过完整腺病毒诱导小泡破裂，可使内含DNA序列保持完整，使其表示绝对量显著提升。第26页普通采取配体＋多聚赖氨酸（PL＋DNA）策略，如用脱唾液酸蛋白（asialoglyco-protein，ASGP）作为配体与PL连接可将反义RNA带到肝中，这是因为肝细胞上有ASGP相应受体。第27页受体介导方法优点：（1）是无感染能力；（2）可特异性转染靶细胞；（3）理论上不受DNA大小限制；（4）构建灵活。

缺点：（1）转染效率低；（2）难以用于体内基因治疗；（3）可能有免疫原性；（4）只有短暂表示。第28页二、基因转移病毒方法

多数病毒可感染特异细胞，在细胞内不易降解RNA病毒能整合到染色体上；其基因表示水平较高等。当前已被用作载体病毒有：

反转录病毒、

腺病毒、

腺病毒相关病毒、

单纯性疱疹病毒和

肝炎病毒等。第29页（一）反转录病毒载体1．反转录病毒(retrovirus)属于正链RNA病毒，特点是：（1）可感染分裂细胞；（2）可整合到宿主染色体中；（3）表示时间较长。最广泛使用又是Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）。第30页反转录病毒基因组大约10kb，含有三个最重要基因：gag（编码关键蛋白）、pol（编码反转录酶）和env（编码病毒外膜蛋白）。两端存在LTR用于介导病毒整合。

LTRgagpolenvLTR第31页第32页第33页反转录病毒载体优点是：（1）基因组小而且简单，能稳定地整合到宿主基因组随机位点上；（2）能高效地感染宿主细胞，可将遗传信息传递给大量受体细胞，细胞感染率可达100％；（3）侵染范围广，可侵染不一样生物和细胞；（4）原病毒较稳定，且拷贝数低；（5）对宿主细胞无毒副作用；（6）可包装10kb外源DNA。第34页缺点是：（1）仅整合处处于分裂状态细胞；（2）一些反转录病毒中存在原癌基因，其会引发癌变发生；（3）反转录病毒LTR可致使细胞癌变；（4）经常只有短暂表示；（5）病毒滴度低（107pfu/ml）；插入容量有限，不能插入较大基因。第35页2．构建重组反转录病毒载体构建反转录病毒载体多起源于鼠白血病病毒（Mo-MLV），这类病毒为嗜双性病毒，既可感染鼠细胞亦可感染人细胞。反转录病毒载体基本成份包含：（1）病毒基因组分，如LTR、病毒包装识别信号、翻译所需剪接识别位点及poly（A）尾等；（2）高效治疗基因如抑癌基因、自杀基因等：（3）标识基因，用于筛选；（4）其它质粒必要成份，如复制起始区。

第36页反转录病毒用作载体时需进行几步改造：（1）基本标准是用标识基因和外源基因替换病毒编码基因。（2）制备包装细胞系，为载体DNA提供其丧失功效。（3）将载体DNA导入包装细胞系以产生病毒载体。（4）病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表示。

第37页gag

Ψ+LTRpolenvLTR人类基因Ψ+LTRLTRneor5'5'3'3'用一个或多个外源基因来置换病毒基因组中gag,pol和env基因。此病毒载体能以不一样方式插入到细胞染色体中。在此例中,用供选择标识基因（neor）置换了病毒gag和pol

基因，而用一个人类基因置换了env基因。第38页第39页5'-LTRLTR-3'

∆Ψgagpolenv

∆Ψ包装细胞系RNA

Ψ

-RNA

基因组编码病毒蛋白RNA

病毒蛋白

不产生病毒颗粒

gag

ΔΨLTRpolenvLTR5'3'助病毒插入到培养细胞中

细胞质

细胞核

第40页用非生物学方法或转染技术将重组DNA插入到培养包装细胞系中，因为载体提供了包装信号Ψ+，载体RNA基因组能被包装。细胞内助病毒中所合成衣壳蛋白自动包装成病毒颗粒，然后被包装细胞释放出来。但载体病毒只能感染，而不能再产生病毒颗粒，因为它没有gag、pol和env基因。第41页用载体病毒感染靶细胞(如人类骨髓细胞)，载体病毒整合到靶细胞DNA中，形成前病毒。其基因伴随基因组一道转录，整合目标基因合成特定蛋白质。第42页反转录病毒载体可分为以下几类：①双表示载体：在载体中插入两个外源基因分别取代gag，

pol和

env。外源基因表示受到5'LTR调控序列控制。②内部开启子载体（IPvector）：在载体中插入两个外源基因，由5'LTR调控；③自失活载体（pSIN）：前两种载体LTR作为开启子有可能激活原癌基因。同时5'LTR开启子和外源基因开启子可能会相互影响。为了克服以上缺点，人们构建了自失活载体。即删除5'LTR开启子，这么反转录时破坏了两端LTR区模板，消除了LTR潜在致癌作用。第43页

反转录表示载体提供了一个基因转移有效方法，使克隆基因在适当宿主细胞中得到表示。经过脂质体介导，用重组Ψ+反转录载体稳定转染Ψ-包装细胞系能建立非复制重组体反转录病毒库。重组体反转录载体基因组转录产生感染病毒产物，经过细胞膜释放到培养基中。恢复高滴度重组体反转录病毒库被用来感染宿主靶细胞，在细胞内重组体RNA基因组经过含在病毒衣壳中反转录酶反转录成双链cDNA。反转录病毒表示系统能被用来进行DNA转移和稳定转染

。第44页最优化腺病毒载体特点。图示腺病毒载体含有包装序列和ITR以及最低程度腺病毒基因组序列。腺病毒载体中腺病毒基因组上E1A（使原代细胞永生化）和E1B基因（造成全方面转化）已被目标基因所取代，因而在体内普通细胞中缺乏复制能力；仅在染色体上已整合有E1A和E1B包装细胞（如293细胞）中，复制缺点型重组腺病毒才能包装成完整腺病毒颗粒。第45页

腺病毒生物学特征：腺病毒DNA是36kb线性分子，两端各有一个50bp反向末端重复区（ITR），ITR

内侧为病毒包装信号。基因组上分布着四个早期转录区（E1、E2、E3、E4），和一个晚期转录区（负责结构蛋白编码）。重复序列（103～162bp)，其中含有复制起点和包装信号。E2，E4区编码复制蛋白；E3区和细胞免疫相关。第46页第47页第48页腺病毒载体制备（1）先构建含有E1(负责包装)或E3（和细胞免疫相关）区两侧序列质粒；（2）将外源基因插入E1或E3区，并保持转录方向一致；（3）与腺病毒基因组中也含有E1或E3区某一侧序列片断共转染细胞，在细胞中通过重组后挑取空斑，得到重组载体。第49页

E1区E1区第50页第一个DNA分子(即所谓穿梭载体，shuttlevector)含有腺病毒左侧反向末端重复序列（LITR）、腺病毒包装信号(ψ)等顺式作用元件以及目标基因表示盒和腺病毒基因组左端一段序列；另一个DNA分子（即骨架载体，backbonevector）与第一个DNA分子3′端略微重合，然后继续向右，包含有大部分病毒基因组序列。两种DNA分子共转染入能够表示腺病毒E1区蛋白细胞（如293、911以及PERC6等），并发生同源重组，即可得到预期复制缺点型重组腺病毒。第51页腺病毒载体优点：（1）易于制备、培养、纯化和浓缩；（2）基因组大，因而可插入大片段外源基因；（3）可高效地（体外试验通常靠近100%转导效率）转导不一样类型人组织细胞；（4）可转导非分裂细胞；（5）在细胞培养物中有高滴度重组病毒产量；（6）进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，因而安全性较高；（7）可在呼吸道和肠道中繁殖，所以不但可经过静脉注射进行基因治疗，而且还能够经过口服、喷雾、气管滴注等简单易行方法进行基因治疗。第52页缺点：（1）表示外源基因时间短，不能满足基因治疗需要。如需