RNA干扰与肿瘤研究及治疗课件

RNA干扰及其在肿瘤研究及治疗方面的应用2025/12/241内容1背景介绍2RNA干扰作用机制3RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用4问题及展望22025/12/24此处添加公司信息一、背景介绍32025/12/24此处添加公司信息RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是一种由短双链RNA(double-strandedRNA,dsDNA)所引起的序列特异性基因沉默,是真核生物体内一种阻断外源基因表达的自我防御体系,是dsDNA介导的,使与其互补的具有同源序列的单链RNA进行特异性降解的过程。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)最早是由Mello和Fire等1998年在线虫体内发现。RNAi作为一种简单、高效的基因敲除工具，正在基因组学和疾病基因治疗领域掀起一场革命，为肿瘤的基因治疗提供了新思路，可能成为今后的肿瘤治疗策略之一。二、RNA干扰作用机制42025/12/24此处添加公司信息转录水平转录后水平翻译水平RNA干扰的作用是在转录水平、转录后水平、翻译水平等多个不同层次上实现的。三个水平转录后水平起始阶段内源或外源的dsRNA由核酸酶III(RNaseIII)-Dicer在细胞内将dsRNA均匀切割成小干扰RNA(siRNA),长度约为21-23nt。其中5’端是磷酸端,3’端常带有突出的非配对碱基(多数是UU)效应阶段SiRNA结合一个核糖核酶复合物,形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，siRNA双链解旋，正义链释放,激活RISC,RISC识别靶mRNA,siRNA反义链与mRNA换位,在距siRNA3端12nt处切割靶mRNA,从而实现对mRNA的降解。扩增阶段siRNA作为prime，特异性与靶mRNA结合,再次形成新的dsRNA，接着dsRNA再次被Dicer切割成siRNA,新形成的siRNA为实现数量扩增的目的,进入下一轮循环,显著抑制了对靶基因的表达。52025/12/24此处添加公司信息62025/12/24此处添加公司信息转录水平72025/12/24此处添加公司信息小分子干扰核糖核酸(siRNA)与互补DNA直接结合而发挥作用,激发同源DNA甲基化的加强,使目的基因转录受限,表达关闭,进而加强基因沉默。如果甲基化出现在启动子区域,则转录不能进行,若甲基化出现在编码区,则转录进行,但在转录后水平上沉默。翻译水平82025/12/24此处添加公司信息翻译水平上的RNAi是抑制相应mRNA的翻译,使相应的蛋白质表达受阻,其中起重要作用的是小时序RNA(smalltemporalRNA,stRNA),它是由长度约70nt的RNA形成的茎环样前体经dicer酶作用后形成长约21~23nt的dsRNA,通过RISC结合在相应mRNA的3'末端非翻译区上,进而阻断mRNA的翻译。三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用92025/12/24此处添加公司信息（一）RNA干扰在肿瘤研究中的应用1.基因功能研究：由于RNA干扰能高效特异地阻断基因表达，通过基因沉默机制作用于癌基因、抑癌基因表达，影响肿瘤生长，在体外培养细胞中研究靶基因的功能。因而成为研究基因功能很好的工具。例如：肿瘤易感基因筛查和鉴定，Williams等通过结合cDNA芯片技术和RNAi技术鉴定了多个结肠癌高度相关基因。三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用102025/12/24此处添加公司信息2.肿瘤发生机制研究:设计多种小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）,可以产生多基因沉默的效果，用于细胞信号传导通路的研究。Harvey等用RNAi技术抑制Brk蛋白表达，结果发现乳腺癌细胞的增生受到抑制。同时还发现Brk的无激酶活性突变体，可以接合器的形式，通过非激酶依赖的机制，促进肿瘤细胞的生长。结果表明Brk可作为乳腺癌治疗的新目标。三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用112025/12/24此处添加公司信息（二）RNA干扰在肿瘤治疗中的应用1.不同siRNA之间的增效作用由于肿瘤是一种多基因调控的疾病，采用RNA干扰技术对肿瘤相关基因进行多重抑制会产生更好的疗效。邵荣光针对不同的肿瘤相关基因，设计合成了靶向bcl-2、cdk-2、mdm-2、H-ras、pkc-α的siRNA,这些siRNA各自都能抑制黑色素瘤细胞的增殖，其抑制率分别为68%、64%、72%、74%和53%。当5种siRNA联合应用时，能显著提高复合siRNA对黑色素瘤细胞的抑制作用。三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用122025/12/24此处添加公司信息2.SiRNA对靶分子药物具的增效作用

表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂埃罗替尼（erlotinib）被批准在临床上应用，但大多数晚期肺癌患者不应答,早期肺癌患者总是发展为耐药性,占一半的复发患者T790M-EGFR基因发生了突变。研究证明，领用RNA干扰技术敲除肝细胞生长因子受体（MET）和表皮生长因子受体（EGFR），能显著的促进埃罗替尼耐药的H1975细胞凋亡。三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用132025/12/24此处添加公司信息3.siRNA对DNA损伤剂的增效作用5-FU(5-氟尿嘧啶)或羟基喜树碱为两种常用的抗肿瘤药物，研究证明，Bcl-2/Bcl-xlsiRNA转染细胞对5-FU(5-氟尿嘧啶)或羟基喜树碱表现出更高的敏感性，提示Bcl-2/Bcl-xlsiRNA介导的基因沉默结合化疗药物可能是潜在的人肝癌治疗策略。三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用142025/12/24此处添加公司信息4.siRNA对放疗的增敏作用MDM2蛋白被证明在辐射应答和肿瘤放射敏感性方面发挥关键作用,是一个有吸引力的临床药物靶标,利用RNA干扰技术抑制MDM2可以加强肿瘤对放射治疗的敏感性。三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用152025/12/24此处添加公司信息5.抗肿瘤新药研发

利用RNAi特异性地抑制癌细胞内的内源性致癌基因的表达,而不影响正常细胞的基因表达,在研究肿瘤发生发展的信号通路以及表型变化可以发挥极大的作用,从而可以进一步为肿瘤的早期诊断和后期治疗找寻新的靶点。siRNA从发现到现在的短十几年时间内,很多研究工作者、生物技术公司和制药公司己经开始广泛利用siRNA药物治疗肿瘤。2008年,美国CalandoPharmaceuticals公司祀向核糖核苷酸还原酶M2亚基(M2subunitofribonucleotidereductase,RRM2)取得了突破性的进展,申请的治疗实体肿瘤的siRNA药物CALAA-01被美国H)A批准进入临床试验I期,成为最早siRNA药物治疗癌症的首例临床试验。

三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用162025/12/24此处添加公司信息2009年7月,德国著名制药公司SilenceTherapeutics公司开展了治疗实体肿瘤的靶向蛋白激酶PKN-3基因RNA干扰药物Atu027的I期临床试验,2011年,该公司报道了其进展,资料显示,24名患者经过Atu027多次治疗后,有9名患者病情稳定,6名患者的较好疗效表现在研究终点(治疗3个月),另外3名患者还在接受治疗,目前的结果还比较令人满意。

2010年12月,加拿大Tekmira制药公司宣布开始siRNA药物TKM-080301(靶向肿瘤细胞高表达的polo样激酶I(polo-likekinaseI,Plkl))的I期临床试验。目前临床前研究证明TKM-080301能特异性地杀死肿瘤细胞,而对正常细胞无明显毒副作用,对肝癌以及肝外肿瘤都有很好的抗肿瘤效果。

三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用172025/12/24此处添加公司信息（三）RNA干扰技术在肿瘤治疗方面的优势

与基因替代、反义核苷酸治疗、细胞因子基因治疗方法相比，RNAi技术有着无可比拟的优势。1.RNAi基因抑制效果确切：微量的siRNA即可使其编码致病基因产物的含量下降90%以上。因此，注入少量的siRNA足以产生强大的干扰效应，减少了传统基因治疗方法大剂量用药带来的毒副作用及免疫效应。三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用182025/12/24此处添加公司信息2.RNAi抑制具有严格的序列特异性，将一段与基因同源的siRNA注入细胞，它可以特异性地干扰相应基因的表达，其他基因即使与靶基因同属于一个基因家族也不会受到干扰。因此，RNAi干扰治疗的针对性很强，副作用小。3.肿瘤是多基因、多因素疾病，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制肿瘤的生长，，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以剔除多个基因，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除，而且抑制效果互补干扰。四、问题及展望192025/12/24此处添加公司信息（一）RNA干扰技术在肿瘤治疗方面要克服的问题理论上只有在siRNA和靶mRNA特异性结合才会沉默靶基因表达。脱靶效应在疾病治疗上存在潜在的危险。由拖把效应产生的意外的基因调控成为RNAi技术治疗的一个主要障碍。一些研宄工作者发现,由于siRNA的特殊结构、序列以及药物释放方式,会引起人体强烈的先天免疫反应,刺激干扰素和炎症细胞因子等化学物质的释放。由于siRNA本身稳定性差,穿透细胞膜的能力差,无靶向功能,在生理环境中极不稳定,易被血清中的酶迅速降解,被肝脏和肾脏清除,因此如何siRNA体内给药以及开发siRNA输送体系是siRNA疗法的最大挑战。免疫刺激系统给药脱靶效应四、问题及展望202025/12/24此处添加公司信息（二）

展望RNAi技术已经引起了实验生物学的巨大变革,在肿瘤治疗,它可以单独应用，也可以与药物等其它治疗手段联合应用。随着研究的深入，RNA干扰技术将日渐成熟并运用于更广更多的领域。随着新的小分子R