T-TPPA 0002-2022 RBL-2H3肥大细胞RTCA法评价中药注射剂类过敏反应操作规程

CCSC272022-12-22发布2022-12-22实施天津市医药行业协会发布T/TPPA0002-2022前言 I 12规范性引用文件 3术语和定义 4检测原理 5材料与设备 5.1材料 25.2设备 26实验方法 6.1溶液配制 26.2实验步骤 27数据处理及判定 T/TPPA0002-2022本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由天津天士力之骄药业有限公司提出。本文件由天津市医药行业协会归口。本文件起草单位：天津天士力之骄药业有限公司、天津中医药大学、天津市药品检验研究院、天津市中药注射剂安全性评价企业重点实验室、创新中药关键技术国家重点实验室河南天地药业股份有限公司、天津红日药业股份有限公司。IT/TPPA0002-20221RBL-2H3肥大细胞RTCA法评价中药注射剂类过敏反应操作规程本文件规定了RBL-2H3肥大细胞RTCA法评价中药注射剂类过敏反应的实验方法。本文件适用于中药注射剂通过BL-2H3肥大细胞RTCA法对类过敏反应的评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时细胞分析real-timecellanalysis实时细胞分析即RTCA，是基于电子阻抗技术，以细胞指数的形式实时反映细胞形态及结构变化，用以监测细胞活性的检测方法。3.2细胞指数cellindex细胞指数是基于电子阻抗技术，以电阻值曲线的变化趋势反映细胞活性的评价指标。4检测原理RBL-2H3细胞常被用于检测过敏或类过敏反应。当细胞与相应的抗原结合后，细胞处于致敏态，引起细胞膜的稳定性下降，通透性增强，分泌性颗粒由胞内分泌到胞外，即为脱颗粒，随之释放生物活性介质如组胺、β-氨基己糖苷酶以及相应细胞因子，介导过敏或类过敏反应的发生。因而无论是I型过敏或类过敏反应都可通过检测RBL-2H3细胞脱颗粒后释放的炎症介质或其信号分子来检测过敏程度，用于评价药物是否有致敏性，进一步评价药物的致敏类型及致敏程度。RTCA系统包括由16孔电极板、电极槽及分析系统组成的实时、连续、定量跟踪细胞增殖分化改变T/TPPA0002-2022的细胞阻抗传感监测系统。电极板依据电阻显示实验结果，细胞接种于电极板，通过检测实时传感器表2面的电阻抗信号，测量的电阻来持续监控细胞。可对细胞进行实时监测，能反映细胞增殖、存活、形态变化等细胞生物学状态。可实时定量地来测量加药后RBL-2H3细胞状态，包括细胞数量、粘附、活力和形态的改变，并提供精确的定量信息，全程实时连续动态监控。细胞的动态变化作用于电极板引起电阻值连续的变化，实验结果根据实时测得的电阻值换算为细胞指数作为指标，通过细胞指数曲线上升及下降等变化趋势表示电极板中细胞的变化。肥大细胞激活不仅导致明显的细胞形态改变，而且会引起细胞黏附能力增加，这两者在RTCA系统中都会引起细胞指数的上升，从而反映类过敏反应的发生。5材料与设备5.1材料5.1.1细胞RBL-2H3细胞。5.1.2试剂试药C48/80、DMEM培养基、胎牛血清、胰酶、青-链霉素、PBS缓冲液。5.2设备RTCA实时细胞分析系统。6实验方法6.1溶液配制将DMEM培养基、胎牛血清和青-链霉素按照89:10:1的体积比混合均匀，即得DMEM完全培养基，4℃保存备用。6.2实验步骤6.2.1细胞培养将RBL-2H3细胞加入DMEM完全培养基中，置于5%CO2培养箱中37℃培养。观察细胞的生长状态，当细胞汇合度达90%时，可进行传代或冻存。6.2.2细胞传代将可传代的细胞从CO2培养箱中取出，弃去培养液，PBS缓冲液清洗2～3遍，随后加入2mL胰酶消化液，CO2培养箱中孵育1～2min至细胞完全脱落，迅速加入2mLDMEM完全培养基中止消化，轻轻吹打，将细胞收集于离心管中，800rpm离心5min，弃上清液。计数细胞，以1:3进行传代培养。为保证T/TPPA0002-2022实验所用细胞的稳定性，细胞代数控制在5～20代内。36.2.3细胞浓度确定将150μL不同浓度（2.5×104个/mL、5.0×104个/mL、7.5×104个/mL、1.0×105个/mL、2.0×105个/mL）的RBL-2H3细胞分别接种于16孔电极板中，随后置于RTCA的电极槽上在5%CO2培养箱中37℃培养，另设DMEM完全培养基作为对照组。RTCA系统实时监测细胞增殖24h后，可观察到不同浓度接种的RBL-2H3细胞的生长曲线及对应的细胞指数，选定细胞指数为0.3～1.4的细胞浓度为最适浓度，用于后续实验。上述细胞实验均应符合GB19489的要求。6.2.4样品分组设对照组、阳性药组和供试品组，对照组加入DMEM完全培养基，阳性药组加入含20μg/mLC48/80的DMEM完全培养基，供试品组加入含适宜浓度供试品的DMEM完全培养基，每组设5个平行。6.2.5RTCA检测a）在16孔电极板的孔中加入50µLDMEM完全培养基。b）将16孔电极板放入CO2培养箱中RTCA的电极槽上。c）RTCA分析系统自动进行扫描，检查是否接触良好。d）开始基线测量，确定所选择的电极孔接触正常。e）取出16孔电极板，在孔中加入100µL混合均匀的RBL-2H3细胞悬液，使每孔中细胞数目约为0.5×104。f）将16孔电极板放入CO2培养箱中RTCA的电极槽上，开始细胞监测。g）取出16孔电极板，在各电极孔中加入100µL不同浓度的样品溶液，开始样品细胞监测。h）通过NormalizedCellIndex得到Plot图，得到各电极孔的细胞指数，导出图片、数值等数据，绘制出RBL-2H3细胞指数曲线。表1RTCA程序设置表 操作内容扫描次数间隔时间总时间 基线测量601s1min细胞监测9615min24h样品细胞监测