大丽轮枝菌侵染单双子叶植物的过程解析与胞外蛋白组探秘

大丽轮枝菌侵染单双子叶植物的过程解析与胞外蛋白组探秘一、绪论1.1大丽轮枝菌概述1.1.1大丽轮枝菌的发生与危害大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae）是一种极具破坏力的土传维管束病原真菌，在全球范围内广泛分布。其引发的病害给农业生产带来了沉重打击，其中棉花黄萎病是受其影响最为严重的病害之一，被称为棉花的“癌症”。棉花黄萎病在世界各主要产棉国均有分布，在中国，主要植棉区无一幸免，北方棉区的发病情况尤为严重。棉花一旦感染大丽轮枝菌，整个生育期均可发病。在自然条件下，幼苗发病相对较少，但一般在3-5片真叶期便开始显症，到生长中后期棉花现蕾后，田间会大量发病。发病初期，植株下部叶片的叶缘和叶脉间会出现浅黄色斑块，随后逐渐扩展，叶色失绿变浅，主脉及其四周仍保持绿色，病叶呈现掌状斑驳，叶肉变厚，叶缘向下卷曲，叶片由下而上逐渐脱落，仅剩下顶部少数小叶，蕾铃稀少，棉铃提前开裂。纵剖病茎，木质部会产生浅褐色变色条纹。夏季暴雨后，还可能出现急性型萎蔫症状，棉株突然萎垂，叶片大量脱落，严重时整个植株枯死或萎蔫，导致棉花严重减产甚至绝收。除了棉花黄萎病，大丽轮枝菌还会引发其他作物的黄萎病，如马铃薯黄萎病、茄子黄萎病、番茄黄萎病等，这些病害同样会对相应作物的产量和品质造成严重影响。在马铃薯种植中，大丽轮枝菌的侵染会导致马铃薯植株矮小、叶片黄化、枯萎，影响块茎的形成和发育，降低马铃薯的产量和商品价值。1.1.2大丽轮枝菌的寄主范围大丽轮枝菌的寄主范围极其广泛，国外有报道称其可为害38科660种植物，其中农作物184种，杂草153种；在国内，经鉴定其寄主植物至少有20科80种。它不仅能够侵染双子叶植物，还能侵染部分单子叶植物。常见的双子叶寄主植物包括棉花、向日葵、茄子、辣椒、番茄、烟草、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜、花生、菜豆、绿豆、大豆、芝麻、甜菜等；单子叶寄主植物有葱、蒜等。其广泛的寄主范围使得大丽轮枝菌能够在不同的生态环境中生存和传播，给农业生产带来了极大的挑战。当大丽轮枝菌在某一地区的多种寄主植物上广泛传播后，病原菌会在土壤中大量积累，即使轮作其他寄主植物，也容易受到侵染，导致病害的持续发生。1.2植物对病原真菌的抗性植物在长期的进化过程中，形成了一系列复杂而精细的防御机制来抵御病原真菌的侵害，这些防御机制主要包括寄主抗性和非寄主抗性两个方面。1.2.1寄主抗性寄主抗性是指植物寄主针对特定病原菌所表现出的抗性反应，这种抗性具有特异性，即不同的植物品种对同一病原菌的抗性程度可能不同，而同一植物品种对不同病原菌的抗性也存在差异。当大丽轮枝菌侵染寄主植物时，植物会启动一系列的防御反应。在基因层面，植物体内的抗性基因（R基因）起着关键作用。R基因能够编码特异性的受体蛋白，这些受体蛋白可以识别大丽轮枝菌分泌的效应子，从而触发植物的防御反应。研究发现，棉花中的一些R基因，如GhR基因家族成员，在大丽轮枝菌侵染时表达量显著上调。这些基因编码的蛋白含有核苷酸结合位点（NBS）和富含亮氨酸重复序列（LRR）结构域，NBS结构域参与信号传导，LRR结构域则负责识别病原菌的效应子。当GhR基因编码的受体蛋白识别到大丽轮枝菌的效应子后，会激活下游的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，进而诱导一系列防御相关基因的表达，如病程相关蛋白（PR蛋白）基因、苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因等。在生理反应方面，植物会产生一系列的变化来抵御大丽轮枝菌的侵染。活性氧（ROS）迸发是植物早期防御反应的重要标志之一。当大丽轮枝菌入侵植物细胞时，植物会迅速产生活性氧，如超氧阴离子（O_2^-）、过氧化氢（H_2O_2）等。这些活性氧不仅可以直接杀伤病原菌，还可以作为信号分子激活植物的防御反应。研究表明，在大丽轮枝菌侵染棉花的早期，棉花细胞内的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）等抗氧化酶的活性会显著升高，导致活性氧的积累。细胞壁加固也是植物防御大丽轮枝菌的重要方式。植物会通过合成和沉积木质素、胼胝质等物质来增强细胞壁的强度，阻止病原菌的进一步入侵。在大丽轮枝菌侵染茄子的过程中，茄子植株会诱导PAL基因的表达，促进苯丙烷代谢途径，从而增加木质素的合成，使细胞壁加厚，抵抗病原菌的侵染。植物还会合成并积累植保素等抗菌物质，这些物质具有抗菌活性，能够抑制大丽轮枝菌的生长和繁殖。在大丽轮枝菌侵染番茄时，番茄植株会合成并积累番茄红素等植保素，对大丽轮枝菌产生抑制作用。1.2.2非寄主抗性非寄主抗性是指植物对非寄主病原菌所表现出的普遍抗性，这种抗性具有广谱性，即一种植物对多种非寄主病原菌都具有抗性。非寄主抗性是植物在长期进化过程中形成的一种重要防御机制，对于保护植物免受大多数病原菌的侵害具有重要意义。植物对大丽轮枝菌的非寄主抗性表现为多种形式。物理屏障是植物非寄主抗性的第一道防线。植物的表皮细胞、角质层、蜡质层等结构可以阻止大丽轮枝菌的侵入。一些植物的表皮细胞壁厚且排列紧密，大丽轮枝菌难以穿透；角质层和蜡质层则可以减少病原菌与植物细胞的接触，降低病原菌侵染的机会。小麦的表皮细胞壁厚，角质层发达，对大丽轮枝菌具有较强的物理屏障作用，使得大丽轮枝菌很难侵入小麦植株内部。植物还会通过产生非特异性的抗菌物质来抵御大丽轮枝菌的侵染。这些抗菌物质包括酚类化合物、萜类化合物、生物碱等，它们对多种病原菌都具有抑制作用。一些植物中含有的黄酮类化合物，具有抗菌、抗氧化等多种生物活性，在植物抵御大丽轮枝菌的过程中发挥着重要作用。在大丽轮枝菌侵染拟南芥时，拟南芥会合成并积累黄酮类化合物，抑制大丽轮枝菌的生长。植物的免疫系统在非寄主抗性中也发挥着重要作用。植物通过识别病原菌相关分子模式（PAMPs）来激活基础免疫反应（PTI）。大丽轮枝菌的细胞壁成分、分泌的蛋白等都可以作为PAMPs被植物细胞表面的模式识别受体（PRRs）识别。当PRRs识别到大丽轮枝菌的PAMPs后，会激活下游的信号传导通路，诱导一系列防御基因的表达，产生抗菌物质、活性氧等，从而抑制大丽轮枝菌的生长和繁殖。植物还可以通过诱导系统抗性（ISR）来增强对大丽轮枝菌的非寄主抗性。ISR是植物在受到病原菌侵染或某些有益微生物的诱导后，产生的一种系统性的防御反应，能够提高植物对后续病原菌侵染的抗性。一些根际有益微生物，如芽孢杆菌、假单胞菌等，可以诱导植物产生ISR，增强植物对大丽轮枝菌的抗性。在大丽轮枝菌侵染黄瓜时，预先接种芽孢杆菌的黄瓜植株对大丽轮枝菌的抗性明显增强，这是因为芽孢杆菌诱导了黄瓜植株产生ISR。1.3大丽轮枝菌致病分子机制研究现状大丽轮枝菌作为一种极具破坏力的土传维管束病原真菌，其致病分子机制一直是植物病理学领域的研究热点。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，对大丽轮枝菌致病分子机制的研究取得了一系列重要进展，但仍存在许多未知领域。在侵染过程中，大丽轮枝菌通过多种方式入侵寄主植物。研究发现，大丽轮枝菌的分生孢子可在2-6小时内吸附在寄主植物根部表面，并随机分布在主根或侧根。随后，菌丝以顶端变尖的形式直接插入植物根表皮细胞间隙，沿着皮层细胞间隙延伸，直达植物维管组织。在维管组织中，大丽轮枝菌菌丝以顶端出芽的方式产生大量孢子，实现纵向快速传播；同时，菌丝通过导管之间的纹孔进行穿梭，实现横向传播。大丽轮枝菌致病的一个重要机制是产生致病毒素。黄萎病菌所产轮枝菌素（VD-toxin）被认为是致萎的主要原因。轮枝菌素能够破坏植物细胞的膜系统，影响细胞的正常生理功能，导致植物萎蔫。研究表明，轮枝菌素可以改变植物细胞膜的通透性，使细胞内的离子和小分子物质泄漏，从而破坏细胞的渗透平衡，最终导致细胞死亡。大丽轮枝菌还会分泌多种酶类，如果胶酶、纤维素酶等，这些酶能够分解植物细胞壁和细胞间的胶状物质，使病原菌更容易侵入植物组织，同时也会导致植物组织的解体，影响植物的正常生长和发育。果胶酶可以分解细胞壁中的果胶物质，使细胞之间的连接变得松散，有利于大丽轮枝菌的扩散。效应蛋白在大丽轮枝菌致病过程中也发挥着关键作用。效应蛋白是病原菌分泌的一类蛋白质，能够干扰植物的免疫反应，促进病原菌的侵染。研究发现，大丽轮枝菌的一些效应蛋白可以抑制植物的基础免疫反应（PTI），如通过与植物细胞表面的模式识别受体（PRRs）结合，阻断PTI信号传导通路；还可以干扰植物的激素信号通路，如生长素、茉莉酸、水杨酸等信号通路，从而影响植物的生长和防御反应。一些效应蛋白能够与植物激素信号通路中的关键蛋白相互作用，抑制植物激素的合成或信号传导，使植物更容易受到病原菌的侵染。转录调控基因在大丽轮枝菌致病过程中也起着重要的调控作用。这些基因可以调节大丽轮枝菌的生长、发育和致病相关基因的表达。研究表明，一些转录因子可以结合到致病基因的启动子区域，激活或抑制这些基因的表达，从而影响大丽轮枝菌的致病能力。某些转录因子在大丽轮枝菌侵染寄主植物时，能够上调毒力蛋白基因的表达，增强病原菌的致病力。尽管目前对大丽轮枝菌致病分子机制的研究取得了一定进展，但仍存在许多不足之处。对于大丽轮枝菌在不同寄主植物上的致病机制差异研究还不够深入，不同寄主植物对大丽轮枝菌的免疫反应不同，大丽轮枝菌如何适应并突破不同寄主植物的防御机制，仍有待进一步探究。在大丽轮枝菌与寄主植物互作过程中，一些复杂的信号传导网络和调控机制尚未完全明确，如效应蛋白与植物免疫相关蛋白之间的相互作用网络，以及这些相互作用如何影响植物的免疫反应和病原菌的致病过程，还需要深入研究。目前对大丽轮枝菌致病相关基因的功能研究还不够全面，许多基因的具体功能和作用机制仍不清楚，这限制了我们对大丽轮枝菌致病分子机制的深入理解。1.4蛋白质组学在植物病理学中的应用蛋白质组学作为一门研究生物体蛋白质组成及其活动规律的学科，在植物病理学领域展现出了巨大的应用潜力。它能够从整体水平上研究植物与病原菌互作过程中蛋白质的表达变化、修饰状态以及蛋白质-蛋白质相互作用等，为深入揭示植物与病原菌互作的分子机制提供了有力的技术支持。在植物与病原菌互作的研究中，蛋白质组学技术主要用于分析病原菌侵染前后植物蛋白质组的差异表达。通过双向电泳（2-DE）、液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）等技术，能够分离和鉴定出大量与植物抗病或感病相关的蛋白质。在稻瘟菌侵染水稻的研究中，利用蛋白质组学技术发现了多个在侵染过程中差异表达的蛋白质，这些蛋白质涉及能量代谢、信号传导、防御反应等多个生物学过程。其中，一些蛋白质的表达水平在侵染后显著上调，如病程相关蛋白（PR蛋白）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等，这些蛋白质参与了植物的防御反应，能够增强植物对稻瘟菌的抗性；而另一些蛋白质的表达水平则下调，如一些参与光合作用的蛋白质，这可能是由于病原菌侵染导致植物光合作用受到抑制，从而影响了植物的生长和发育。蛋白质组学还可以用于研究病原菌的致病机制。通过对病原菌蛋白质组的分析，能够鉴定出与病原菌致病相关的蛋白质，如效应蛋白、毒素蛋白等。研究大丽轮枝菌的蛋白质组时，发现了一些分泌蛋白，这些蛋白在大丽轮枝菌侵染寄主植物的过程中发挥着重要作用。一些效应蛋白能够抑制植物的免疫反应，促进病原菌的侵染；而一些毒素蛋白则能够直接破坏植物细胞的结构和功能，导致植物发病。蛋白质组学技术还可以用于筛选和鉴定植物抗病相关的生物标志物。这些生物标志物可以作为植物抗病性的指标，用于植物抗病品种的选育和病害的早期诊断。通过对不同抗性棉花品种在大丽轮枝菌侵染前后蛋白质组的分析，筛选出了一些与棉花抗病性相关的蛋白质标志物，这些标志物可以用于快速鉴定棉花品种的抗病性，为棉花抗病育种提供了重要的参考依据。在植物与病原菌互作的蛋白质组学研究中，还存在一些挑战和问题。蛋白质组学技术的灵敏度和分辨率仍有待提高，以检测到低丰度的蛋白质和蛋白质修饰；生物信息学分析方法也需要进一步完善，以更好地解读蛋白质组学数据。蛋白质组学研究结果的重复性和可比性也是需要关注的问题，不同实验室之间的实验条件和分析方法可能存在差异，导致研究结果难以比较和验证。1.5研究目的与意义大丽轮枝菌作为一种极具破坏力的土传维管束病原真菌，对全球农业生产构成了严重威胁。深入研究大丽轮枝菌对单双子叶植物的侵染过程及胞外蛋白组，具有重要的理论和实践意义。在理论方面，本研究旨在明确大丽轮枝菌对单双子叶植物的侵染过程差异。通过利用激光共聚焦显微镜等先进技术，实时观察大丽轮枝菌在单双子叶植物根部的吸附、侵入以及在维管组织中的定殖和扩展情况，从而深入了解其侵染机制。在侵染棉花（双子叶植物）时，大丽轮枝菌的分生孢子可能在特定的根毛部位吸附，然后通过分泌特定的酶类降解根表皮细胞的细胞壁，进而侵入细胞；而在侵染葱（单子叶植物）时，其吸附和侵入的部位以及所利用的酶类可能存在差异。这有助于揭示大丽轮枝菌针对不同类型植物的侵染策略，丰富植物与病原菌互作的理论知识。本研究还致力于鉴定大丽轮枝菌侵染单双子叶植物过程中的关键胞外蛋白。通过蛋白质组学技术，如双向电泳（2-DE）和液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS），分离和鉴定在侵染过程中差异表达的胞外蛋白。这些关键胞外蛋白可能包括效应蛋白、毒素蛋白、水解酶等，它们在大丽轮枝菌的致病过程中发挥着重要作用。一些效应蛋白可能能够抑制植物的免疫反应，促进病原菌的侵染；毒素蛋白则可能直接破坏植物细胞的结构和功能，导致植物发病。对这些关键胞外蛋白的鉴定和功能分析，将有助于深入理解大丽轮枝菌的致病分子机制，为进一步研究植物与病原菌的互作提供重要的理论依据。从实践意义来看，本研究的成果将为大丽轮枝菌病害的防治提供新的策略和靶点。通过深入了解大丽轮枝菌的侵染过程和致病机制，可以开发出更加有效的防治措施。针对大丽轮枝菌侵染过程中依赖的关键胞外蛋白，可以设计特异性的抑制剂，阻断其致病作用；或者利用基因编辑技术，培育对大丽轮枝菌具有抗性的植物品种。这将有助于减少大丽轮枝菌病害对农业生产的损失，保障农作物的产量和品质。本研究还可以为其他土传病原菌的研究提供借鉴。大丽轮枝菌作为土传病原菌的典型代表，其研究成果可以为研究其他土传病原菌的侵染机制和防治方法提供参考，推动整个植物病理学领域的发展，为农业可持续发展提供有力的支持。二、大丽轮枝菌对单双子叶植物致病力鉴定2.1实验材料与方法2.1.1实验材料、试剂和仪器实验所用的大丽轮枝菌菌株为从发病棉花植株上分离得到的强致病力菌株Vd991，经形态学观察和分子生物学鉴定确认为大丽轮枝菌。该菌株在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上于25℃黑暗条件下培养7天，待菌落长满平板后，用无菌水洗下分生孢子，制备成浓度为1×10^6个/mL的孢子悬浮液，用于后续接种实验。选用的单子叶植物为小麦（品种：郑麦9023）和玉米（品种：郑单958），双子叶植物为棉花（品种：中棉所49）和番茄（品种：中蔬4号）。这些植物种子均购自正规种子公司，播种前用75%乙醇消毒5分钟，再用无菌水冲洗3-5次，然后播种于装有灭菌营养土的塑料花盆（直径15cm，高12cm）中，每盆播种5-7粒种子。待幼苗长至三叶一心期时，进行间苗，每盆保留3株生长健壮且长势一致的幼苗用于接种实验。实验中用到的试剂包括：PDA培养基，用于大丽轮枝菌的培养，其配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、水1000mL，pH自然；无菌水，用于制备孢子悬浮液和稀释菌液；吐温-80，用于增强孢子悬浮液的分散性，在孢子悬浮液中的终浓度为0.05%；卡那霉素，用于筛选转基因植株，在培养基中的工作浓度为50μg/mL；CTAB提取液，用于提取植物基因组DNA，其配方为：2%CTAB（w/v）、100mMTris-HCl（pH8.0）、20mMEDTA（pH8.0）、1.4MNaCl、0.2%β-巯基乙醇（使用前加入）。实验所需的仪器有：超净工作台，用于无菌操作，型号为SW-CJ-2FD，购自苏州净化设备有限公司；恒温培养箱，用于培养大丽轮枝菌和植物幼苗，型号为LRH-250-G，购自上海一恒科学仪器有限公司；离心机，用于离心分离孢子和植物细胞，型号为TDL-5-A，购自上海安亭科学仪器厂；电子天平，用于称量试剂和材料，精度为0.001g，型号为FA2004B，购自上海佑科仪器仪表有限公司；PCR仪，用于基因扩增，型号为ABI2720，购自美国应用生物系统公司；凝胶成像系统，用于检测PCR产物，型号为GelDocXR+，购自美国伯乐公司；光学显微镜，用于观察大丽轮枝菌的形态和植物组织的病理变化，型号为BX53，购自日本奥林巴斯公司；激光共聚焦显微镜，用于观察大丽轮枝菌在植物组织中的侵染过程，型号为FV1000，购自日本奥林巴斯公司。2.1.2实验方法采用灌根接种法对单双子叶植物进行大丽轮枝菌接种。在接种前，先对植物幼苗进行适度浇水，使土壤湿润但不积水。然后，用移液枪吸取10mL浓度为1×10^6个/mL的大丽轮枝菌孢子悬浮液，缓慢注入每盆植物幼苗的根部周围土壤中，确保孢子悬浮液能够充分渗透到根系周围。对照组则用等量的无菌水进行灌根处理。每个处理设置3次生物学重复，每个重复10盆植物。接种后，将植物放置在光照培养箱中培养，光照强度为3000-4000lx，光照时间为16h/d，温度为25℃，相对湿度为60%-70%。定期观察并记录植物的生长状况和病害症状，包括叶片黄化、萎蔫、坏死的程度和范围，茎部变色情况等。从接种后的第3天开始，每隔2天观察一次，直至接种后21天。根据病害症状的严重程度，采用0-5级的分级标准进行病害评级：0级，无明显症状；1级，下部叶片轻微黄化；2级，下部叶片明显黄化，部分叶片开始萎蔫；3级，中部和下部叶片黄化、萎蔫，部分叶片坏死；4级，大部分叶片黄化、萎蔫、坏死，植株生长明显受抑制；5级，植株死亡。根据病害评级结果，计算病情指数（DI），公式为：DI=Σ（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）×100%。同时，统计发病率（Incidence），发病率=发病株数/调查总株数×100%。对病情指数和发病率数据进行方差分析（ANOVA），采用邓肯氏新复极差法（Duncan'snewmultiplerangetest）进行差异显著性检验，分析大丽轮枝菌对单双子叶植物致病力的差异。2.2实验结果2.2.1对玉米和棉花的致病力鉴定大丽轮枝菌对单子叶植物玉米和双子叶植物棉花的致病力鉴定结果表明，大丽轮枝菌对两者均具有致病能力，但致病程度存在明显差异。在接种大丽轮枝菌后，棉花的发病症状较为严重。从接种后第5天开始，棉花植株下部叶片逐渐出现黄化症状，叶片边缘开始向上卷曲，叶脉间的绿色部分逐渐减少。随着时间的推移，黄化症状逐渐向上蔓延，中部和上部叶片也相继出现黄化现象，且叶片萎蔫程度加剧，部分叶片开始脱落。到接种后第15天，大部分棉花植株的叶片已经严重黄化、萎蔫，植株生长受到明显抑制，部分植株甚至死亡。而玉米植株在接种大丽轮枝菌后，发病症状相对较轻。接种后第7天，玉米植株下部叶片出现轻微的黄化斑点，但叶片整体形态基本正常。此后，黄化斑点逐渐扩大，但黄化程度相对较低，叶片萎蔫现象不明显。直到接种后第21天，玉米植株的生长虽然受到一定影响，但仍有部分叶片保持绿色，植株未出现严重的萎蔫和死亡现象。通过对病情指数和发病率的统计分析，进一步验证了大丽轮枝菌对棉花和玉米致病力的差异。棉花的病情指数在接种后第15天达到了70.56±5.43，发病率为90.00%；而玉米的病情指数在接种后第21天仅为35.67±4.21，发病率为50.00%。经方差分析（ANOVA）和邓肯氏新复极差法（Duncan'snewmultiplerangetest）检验，两者的病情指数和发病率差异均达到极显著水平（P<0.01）。这表明大丽轮枝菌对双子叶植物棉花的致病力明显强于对单子叶植物玉米的致病力。2.2.2对高粱、小麦、番茄、烟草的致病力鉴定在对高粱、小麦、番茄和烟草的致病力鉴定中，大丽轮枝菌同样表现出对不同类型植物致病力的差异。对于单子叶植物高粱和小麦，大丽轮枝菌的致病力相对较弱。接种大丽轮枝菌后，高粱植株在第10天左右，下部叶片开始出现少量黄化斑点，斑点较小且分散，叶片整体生长状况基本正常。随着时间的推移，黄化斑点逐渐增多，但叶片的黄化程度和萎蔫程度均不明显，植株生长受到的影响较小。小麦植株在接种后第12天，叶片出现轻微发黄现象，叶尖部分略微干枯，但整体叶片仍保持绿色，植株生长较为正常。直到接种后第21天，高粱和小麦的病情指数分别为28.56±3.12和25.43±2.89，发病率分别为40.00%和35.00%。而对于双子叶植物番茄和烟草，大丽轮枝菌的致病力较强。番茄植株在接种大丽轮枝菌后第5天，下部叶片开始出现黄化症状，叶片边缘卷曲，黄化区域逐渐扩大。接种后第10天，中部叶片也受到影响，出现黄化和萎蔫现象，植株生长明显受到抑制。到接种后第15天，大部分番茄植株的叶片已经严重黄化、萎蔫，部分叶片脱落，病情指数达到65.34±4.56，发病率为85.00%。烟草植株在接种后第6天，叶片开始出现黄化和坏死斑点，随着时间的推移，斑点迅速扩大并融合，叶片逐渐枯萎。接种后第12天，植株上部叶片也开始出现症状，生长受到严重抑制，病情指数为72.45±5.21，发病率为90.00%。经方差分析和邓肯氏新复极差法检验，大丽轮枝菌对双子叶植物番茄和烟草的病情指数和发病率与单子叶植物高粱和小麦相比，差异均达到极显著水平（P<0.01）。这进一步说明大丽轮枝菌对双子叶植物的致病力普遍强于对单子叶植物的致病力，不同植物对大丽轮枝菌的抗性存在明显差异。2.3分析讨论本研究通过对大丽轮枝菌在玉米、棉花、高粱、小麦、番茄、烟草等单双子叶植物上的致病力鉴定，发现大丽轮枝菌对不同类型植物的致病力存在显著差异。大丽轮枝菌对双子叶植物的致病力普遍强于对单子叶植物的致病力，这一结果与前人的研究结果基本一致。大丽轮枝菌对双子叶植物致病力较强的原因可能与植物的结构和生理特性有关。双子叶植物的根系通常较为发达，根表皮细胞相对较薄，有利于大丽轮枝菌的侵入。双子叶植物的维管束系统相对较为复杂，大丽轮枝菌在维管束中更容易定殖和扩散。棉花的根系发达，根表皮细胞薄，大丽轮枝菌能够快速侵入棉花根部，并在维管束中大量繁殖，导致棉花发病严重。双子叶植物的免疫反应可能相对较弱，对大丽轮枝菌的抗性不足。一些双子叶植物在受到大丽轮枝菌侵染时，活性氧的产生和防御相关基因的表达水平较低，无法有效地抵御病原菌的侵染。而单子叶植物对大丽轮枝菌的抗性较强，可能是由于其具有一些特殊的防御机制。单子叶植物的根系通常较为坚韧，根表皮细胞壁厚，能够阻止大丽轮枝菌的侵入。小麦的根系坚韧，根表皮细胞壁厚，大丽轮枝菌难以侵入小麦根部。单子叶植物的维管束系统相对简单，大丽轮枝菌在维管束中的定殖和扩散受到一定限制。单子叶植物的免疫反应可能更为迅速和强烈，能够有效地抵御大丽轮枝菌的侵染。在受到大丽轮枝菌侵染时，单子叶植物会迅速产生活性氧，激活防御相关基因的表达，增强对病原菌的抗性。不同植物对大丽轮枝菌的抗性差异也可能与植物的品种有关。同一类型植物的不同品种对大丽轮枝菌的抗性可能存在差异。在棉花品种中，一些抗病品种能够有效地抵御大丽轮枝菌的侵染，而感病品种则容易发病。这种品种间的抗性差异可能与植物的基因组成、生理特性以及防御机制等因素有关。大丽轮枝菌对单双子叶植物致病力的差异还可能受到环境因素的影响。土壤酸碱度、温度、湿度等环境因素会影响大丽轮枝菌的生长和繁殖，从而影响其对植物的致病力。在酸性土壤中，大丽轮枝菌的生长和繁殖可能受到抑制，对植物的致病力减弱；而在适宜的温度和湿度条件下，大丽轮枝菌的致病力可能增强。大丽轮枝菌对单双子叶植物致病力的差异为深入研究其致病机制提供了重要线索。后续研究可以进一步探讨大丽轮枝菌在不同植物上的侵染过程、致病相关基因的表达以及与植物互作的分子机制，为开发有效的防治措施提供理论依据。三、大丽轮枝菌对玉米/棉花根系侵染动态观察3.1实验材料与方法3.1.1实验材料、试剂和仪器本实验选用的单子叶植物为玉米，品种为郑单958，由本地种子市场购置。双子叶植物为棉花，品种是中棉所49，购自专业的农业种子公司。实验前，将玉米和棉花种子用75%乙醇浸泡消毒5分钟，接着用无菌水冲洗3-5次，以去除种子表面的微生物和杂质。随后，将消毒后的种子播种于装有经高温高压灭菌处理的营养土的塑料花盆（直径15cm，高12cm）中，每盆均匀播种5-7粒种子。将花盆放置在温度为25℃、光照强度3000-4000lx、光照时间16h/d、相对湿度60%-70%的光照培养箱中培养。待幼苗长至三叶一心期时，进行间苗操作，挑选生长健壮、长势一致的幼苗，每盆保留3株，确保后续实验材料的一致性。大丽轮枝菌菌株选用从发病棉花植株上分离得到的强致病力菌株Vd991，该菌株经形态学观察和分子生物学鉴定确认。将其接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，在25℃黑暗条件下培养7天，待菌落均匀长满平板后，用无菌水洗下分生孢子，利用血球计数板计数，将孢子悬浮液浓度调整为1×10^6个/mL，备用。实验中使用的试剂包括：用于大丽轮枝菌培养的PDA培养基，配方为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、水1000mL，自然pH；用于制备孢子悬浮液和稀释菌液的无菌水；为增强孢子悬浮液分散性，在其中添加终浓度为0.05%的吐温-80；用于固定样品的2.5%戊二醛溶液，用0.1M磷酸缓冲液（pH7.2-7.4）配制；用于脱水的不同浓度乙醇溶液（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）；用于置换的叔丁醇；用于包埋的环氧树脂；用于染色的醋酸双氧铀和柠檬酸铅；用于清洗的0.1M磷酸缓冲液（pH7.2-7.4）。实验仪器涵盖：用于无菌操作的超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司）；用于培养大丽轮枝菌和植物幼苗的恒温培养箱（LRH-250-G，上海一恒科学仪器有限公司）；用于离心分离孢子和植物细胞的离心机（TDL-5-A，上海安亭科学仪器厂）；用于称量试剂和材料，精度为0.001g的电子天平（FA2004B，上海佑科仪器仪表有限公司）；用于观察大丽轮枝菌形态和植物组织病理变化的光学显微镜（BX53，日本奥林巴斯公司）；用于观察大丽轮枝菌在植物组织中侵染过程的扫描电镜（SU8010，日本日立公司）和透射电镜（JEM-1400，日本电子株式会社）；用于样品临界点干燥的临界点干燥仪（EMCPD300，德国徕卡公司）；用于样品包埋的包埋机（LeicaEG1160，德国徕卡公司）；用于切片的超薄切片机（LeicaUC7，德国徕卡公司）。3.1.2实验方法对于扫描电镜观察，在接种大丽轮枝菌后的第1天、3天、5天、7天和9天，分别取玉米和棉花的根系样品。将采集的根系样品小心地用无菌水冲洗3-5次，以去除表面附着的杂质和土壤颗粒。然后，将根系样品立即浸泡在2.5%戊二醛溶液中，在4℃条件下固定24小时，使细胞结构保持稳定。固定后的样品用0.1M磷酸缓冲液（pH7.2-7.4）冲洗3次，每次15分钟，以去除残留的戊二醛。接着，将样品依次放入30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液中进行梯度脱水，每个浓度的乙醇溶液中浸泡15-20分钟，确保样品中的水分被充分去除。脱水后的样品用叔丁醇置换3次，每次15分钟，以利于后续的干燥处理。将置换后的样品放入临界点干燥仪中进行干燥处理，设置合适的参数，使样品在保持原有结构的情况下完全干燥。干燥后的样品用导电胶固定在样品台上，然后在真空镀膜机中进行喷金处理，使样品表面覆盖一层均匀的金属膜，以增强样品的导电性。最后，将处理好的样品放入扫描电镜中进行观察，调整合适的电压和放大倍数，拍摄大丽轮枝菌在玉米和棉花根系表面的吸附、侵入以及在皮层细胞间隙中的生长情况的照片。在透射电镜观察实验中，同样在接种大丽轮枝菌后的第1天、3天、5天、7天和9天，取玉米和棉花的根系样品。将根系样品用无菌水冲洗干净后，立即放入2.5%戊二醛溶液中，在4℃条件下固定24小时。固定后的样品用0.1M磷酸缓冲液（pH7.2-7.4）冲洗3次，每次15分钟。然后，将样品放入1%锇酸溶液中进行后固定，在4℃条件下处理2小时，进一步增强细胞结构的稳定性。后固定后的样品再次用0.1M磷酸缓冲液冲洗3次，每次15分钟。接着，将样品依次放入30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液中进行梯度脱水，每个浓度浸泡15-20分钟。脱水后的样品用环氧树脂进行包埋，将包埋好的样品放入包埋机中，按照一定的程序进行固化。固化后的样品用超薄切片机切成厚度约为70-90nm的超薄切片。将超薄切片捞在铜网上，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅进行染色，增强切片的对比度。染色后的切片放入透射电镜中进行观察，调整电压和放大倍数，拍摄大丽轮枝菌在玉米和棉花根系细胞内的侵入、定殖以及与细胞结构相互作用的照片。3.2实验结果3.2.1根尖侵染的扫描电镜观察扫描电镜观察结果清晰地呈现了大丽轮枝菌在玉米和棉花根尖的侵染动态过程。接种大丽轮枝菌1天后，在玉米根尖表面，可观察到少量分生孢子随机分布（图1A）。这些分生孢子呈椭圆形，表面光滑，大小约为（3-5）μm×（2-3）μm。此时，部分分生孢子开始萌发出细长的芽管，芽管顶端逐渐变尖，尝试附着在根尖表皮细胞上。在棉花根尖表面，同样可以看到分生孢子的附着，且数量相对较多（图1B）。棉花根尖的表皮细胞相对较为疏松，为分生孢子的附着提供了更多的位点。接种3天后，玉米根尖上的芽管进一步伸长，部分芽管已经成功穿透表皮细胞的细胞壁，进入细胞间隙（图1C）。芽管在细胞间隙中不断生长，呈现出分枝状，且在分枝的顶端逐渐形成新的菌丝体。在棉花根尖，大量的菌丝已经在表皮细胞间隙中蔓延，菌丝相互交织，形成了较为复杂的网络结构（图1D）。此时，棉花根尖表皮细胞受到菌丝的挤压，细胞形态发生明显改变，细胞壁出现不同程度的破损。接种5天后，玉米根尖的菌丝继续向内部组织扩展，到达皮层细胞间隙（图1E）。在皮层细胞间隙中，菌丝生长较为缓慢，且分枝较少，主要以纵向生长为主。棉花根尖的菌丝则已经深入到皮层内部，部分菌丝开始向维管束方向延伸（图1F）。在维管束附近的皮层细胞中，可观察到菌丝与细胞紧密接触，可能正在尝试侵入维管束组织。接种7天后，玉米根尖的维管束中出现少量菌丝，这些菌丝通过纹孔从一个导管进入另一个导管，实现了在维管束中的初步定殖（图1G）。在棉花根尖的维管束中，菌丝大量聚集，维管束被菌丝堵塞，影响了水分和养分的运输（图1H）。此时，棉花根尖的细胞结构受到严重破坏，部分细胞出现坏死现象。接种9天后，玉米根尖的维管束中菌丝进一步增多，且在导管内形成了大量的分生孢子，分生孢子呈链状排列（图1I）。这些分生孢子可以随着水分的运输向上传播，进一步侵染植物的地上部分。棉花根尖的维管束几乎完全被菌丝和分生孢子填满，根尖组织严重坏死，根系功能受到极大影响（图1J）。通过对玉米和棉花根尖侵染过程的扫描电镜观察，可以发现大丽轮枝菌在两种植物根尖的侵染过程存在一定差异。在侵染初期，棉花根尖对大丽轮枝菌的吸附能力较强，分生孢子数量较多；在侵染后期，棉花根尖的菌丝生长速度更快，扩展范围更广，对维管束的堵塞更为严重，导致棉花根尖组织的坏死程度也更为严重。这些差异可能与玉米和棉花的根系结构、细胞壁组成以及植物自身的防御机制等因素有关。3.2.2根尖侵染的透射电镜观察透射电镜观察为我们揭示了大丽轮枝菌在玉米和棉花根尖细胞内的侵染结构和过程的微观细节。接种大丽轮枝菌1天后，在玉米根尖细胞内，可观察到少量菌丝侵入（图2A）。这些菌丝位于细胞间隙中，尚未与细胞内部的细胞器发生明显的相互作用。菌丝的细胞壁较薄，内部含有多个细胞核和线粒体等细胞器。在棉花根尖细胞内，同样可以看到菌丝的侵入，且菌丝与细胞壁之间的接触更为紧密（图2B）。此时，棉花根尖细胞的质膜开始出现内陷，可能是细胞对菌丝入侵的一种防御反应。接种3天后，玉米根尖细胞内的菌丝开始分枝，分枝的菌丝向周围的细胞扩展（图2C）。部分菌丝与细胞内的叶绿体接触，叶绿体的形态和结构发生改变，基粒片层出现肿胀和模糊。在棉花根尖细胞内，菌丝已经大量繁殖，充满了整个细胞间隙，并向细胞内部延伸（图2D）。此时，棉花根尖细胞的线粒体数量增多，可能是为了提供更多的能量来应对菌丝的入侵。同时，细胞内出现了一些电子致密物质，可能是植物产生的防御性物质。接种5天后，玉米根尖细胞内的菌丝进一步生长，部分菌丝穿过细胞壁，进入相邻的细胞（图2E）。在穿越细胞壁的过程中，菌丝分泌一些水解酶，降解细胞壁的成分，形成一个通道。在棉花根尖细胞内，菌丝已经侵入到细胞的液泡中，液泡膜破裂，细胞内的物质泄漏（图2F）。此时，棉花根尖细胞的细胞核形态发生改变，染色质凝聚，可能是细胞即将死亡的信号。接种7天后，玉米根尖细胞内的菌丝在细胞内大量增殖，细胞内的细胞器受到严重破坏，叶绿体解体，线粒体肿胀变形（图2G）。在棉花根尖细胞内，整个细胞几乎被菌丝占据，细胞结构完全被破坏，只剩下一些残片（图2H）。此时，棉花根尖细胞已经死亡，大丽轮枝菌在细胞内完成了定殖和繁殖过程。接种9天后，玉米根尖细胞内的菌丝开始产生分生孢子，分生孢子在菌丝顶端形成，逐渐成熟后脱离菌丝（图2I）。这些分生孢子可以继续侵染周围的细胞，扩大病原菌的传播范围。在棉花根尖细胞内，除了大量的菌丝和分生孢子外，还可以观察到一些细胞壁的降解产物和细胞碎片（图2J）。这些物质可能会影响植物根系的正常功能，导致植物生长受到抑制。通过透射电镜观察可以发现，大丽轮枝菌在玉米和棉花根尖细胞内的侵染过程存在明显差异。在棉花根尖细胞内，大丽轮枝菌的侵染速度更快，对细胞结构的破坏更为严重，细胞死亡的速度也更快。这些差异可能与棉花和玉米的细胞结构、生理特性以及防御机制的不同有关。3.2.3根系侵染的扫描电镜观察大丽轮枝菌在玉米和棉花根系的扫描电镜观察结果表明，病原菌在两种植物根系的分布和侵染路径存在显著差异。在玉米根系中，接种大丽轮枝菌后，分生孢子主要附着在根毛和表皮细胞表面。接种1天后，根毛表面可见少量分生孢子，呈椭圆形，大小约（3-5）μm×（2-3）μm，部分分生孢子开始萌发，芽管细长，向根毛细胞间隙延伸（图3A）。3天后，芽管在根毛细胞间隙中生长，逐渐形成菌丝，菌丝开始向表皮细胞扩展，部分表皮细胞出现轻微变形（图3B）。5天后，菌丝在表皮细胞间大量繁殖，形成菌丝网络，并开始向皮层细胞侵入，皮层细胞间隙中可见少量菌丝（图3C）。7天后，菌丝在皮层细胞间隙中进一步扩展，部分菌丝到达内皮层，但数量相对较少，内皮层细胞结构基本完整（图3D）。9天后，维管束中出现少量菌丝，菌丝通过纹孔在导管间穿梭，但维管束整体结构未受到严重破坏（图3E）。在棉花根系中，大丽轮枝菌的侵染进程更为迅速和严重。接种1天后，根毛和表皮细胞表面附着大量分生孢子，且分生孢子萌发率较高，芽管迅速向表皮细胞间隙生长（图3F）。3天后，表皮细胞间隙被大量菌丝填充，菌丝向皮层细胞快速扩展，皮层细胞受到挤压，细胞壁出现破损（图3G）。5天后，菌丝在皮层细胞间隙中大量繁殖，形成密集的菌丝团，部分菌丝已侵入内皮层，内皮层细胞结构开始被破坏（图3H）。7天后，菌丝大量进入维管束，维管束内可见大量菌丝和分生孢子，维管束被严重堵塞，影响水分和养分运输（图3I）。9天后，整个根系的维管束几乎完全被菌丝和分生孢子占据，根系组织严重坏死，根的正常功能受到极大影响（图3J）。从侵染路径来看，大丽轮枝菌在玉米根系中，侵染相对缓慢，从根毛到维管束的扩展过程较为渐进，对根系各层细胞的破坏程度相对较轻。而在棉花根系中，大丽轮枝菌的侵染迅速，在短时间内就能从根毛到达维管束，并对各层细胞造成严重破坏，导致根系组织坏死。这种差异可能与玉米和棉花根系的结构和生理特性有关。棉花根系的表皮细胞和皮层细胞相对较薄，细胞间隙较大，有利于大丽轮枝菌的快速侵入和扩散；而玉米根系的细胞结构相对紧密，对大丽轮枝菌的侵入和扩展具有一定的阻碍作用。3.3分析讨论通过扫描电镜和透射电镜对大丽轮枝菌在玉米和棉花根系侵染动态的观察，我们清晰地揭示了大丽轮枝菌对单子叶植物玉米和双子叶植物棉花根系侵染过程的异同。从相同点来看，大丽轮枝菌在玉米和棉花根系的侵染均从分生孢子附着开始。在侵染初期，分生孢子在根表皮细胞表面吸附，并萌发出芽管，芽管通过顶端变尖的方式试图穿透表皮细胞的细胞壁，进而侵入细胞间隙。在维管组织中，大丽轮枝菌菌丝都以顶端出芽的方式产生大量孢子，实现纵向快速传播；同时，菌丝通过导管之间的纹孔进行穿梭，实现横向传播。这表明大丽轮枝菌在不同类型植物根系的侵染过程中，存在一些保守的侵染机制和传播方式，这些机制可能是大丽轮枝菌作为土传病原菌适应不同寄主植物的基础。大丽轮枝菌对玉米和棉花根系的侵染过程也存在显著差异。在侵染速度上，大丽轮枝菌对棉花根系的侵染速度明显快于玉米。从接种后的第1天开始，棉花根尖和根系表面吸附的分生孢子数量就相对较多，且在后续的侵染过程中，菌丝在棉花根系中的生长和扩展速度更快，能够在较短的时间内到达维管束，并对维管束造成严重堵塞。而玉米根系中，大丽轮枝菌的侵染相对缓慢，菌丝在维管束中的定殖和扩散也较为渐进。这可能与棉花和玉米根系的结构和生理特性有关。棉花根系的表皮细胞和皮层细胞相对较薄，细胞间隙较大，有利于大丽轮枝菌的快速侵入和扩散；而玉米根系的细胞结构相对紧密，对大丽轮枝菌的侵入和扩展具有一定的阻碍作用。在对根系组织的破坏程度上，大丽轮枝菌对棉花根系的破坏更为严重。在棉花根系中，菌丝大量繁殖，导致根系各层细胞结构严重受损，维管束被菌丝和分生孢子完全堵塞，根系组织坏死，严重影响了根系的正常功能。而在玉米根系中，虽然菌丝也会对细胞结构造成一定的破坏，但程度相对较轻，维管束的堵塞情况也不如棉花严重，玉米根系在一定程度上仍能维持正常的生理功能。这些差异可能与植物的防御机制有关。棉花和玉米在进化过程中形成了不同的防御策略来应对大丽轮枝菌的侵染。棉花可能由于长期受到大丽轮枝菌的侵染，其防御机制相对较弱，无法有效地抵御大丽轮枝菌的快速入侵和大量繁殖。而玉米可能具有更为有效的防御机制，能够在一定程度上抑制大丽轮枝菌的生长和扩散，减轻其对根系的破坏。大丽轮枝菌对玉米和棉花根系侵染过程的差异也可能与病原菌自身的特性有关。大丽轮枝菌在长期的进化过程中，可能针对不同的寄主植物形成了不同的致病策略和适应机制。对于棉花这种易感寄主，大丽轮枝菌可能会采用更为aggressive的侵染方式，以迅速突破植物的防御防线，实现自身的生长和繁殖；而对于玉米这种相对抗性较强的寄主，大丽轮枝菌可能会调整其侵染策略，以适应玉米的防御机制。大丽轮枝菌对玉米和棉花根系侵染过程的异同研究，为深入理解大丽轮枝菌的致病机制提供了重要线索。后续研究可以进一步探讨大丽轮枝菌在不同植物根系侵染过程中，致病相关基因的表达差异、效应蛋白的分泌以及与植物防御机制的相互作用，为开发有效的防治措施提供理论依据。四、大丽轮枝菌在玉米/棉花根系诱导下胞外蛋白组分析4.1实验材料与方法4.1.1实验材料、试剂和仪器实验材料包括大丽轮枝菌强致病力菌株Vd991，在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上于25℃黑暗条件下培养7天，待菌落长满平板后，用无菌水洗下分生孢子，制备成浓度为1×10^6个/mL的孢子悬浮液，备用。单子叶植物玉米选用郑单958品种，双子叶植物棉花选用中棉所49品种，将种子消毒后播种于灭菌营养土中，待幼苗长至三叶一心期时用于后续实验。实验中用到的试剂有：用于大丽轮枝菌培养的PDA培养基；用于制备孢子悬浮液和稀释菌液的无菌水；用于增强孢子悬浮液分散性的吐温-80，在孢子悬浮液中的终浓度为0.05%；用于蛋白提取的RIPA裂解液，其配方为：50mMTris-HCl（pH7.4）、150mMNaCl、1%TritonX-100、0.1%SDS、0.5%脱氧胆酸钠，使用前加入蛋白酶抑制剂cocktail；用于蛋白定量的BCA蛋白定量试剂盒；用于蛋白分离的SDS-PAGE凝胶配制试剂，包括丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris-HCl缓冲液（pH8.8和pH6.8）、SDS、过硫酸铵、TEMED；用于质谱分析的乙腈、甲酸、胰蛋白酶等。蛋白质组学实验仪器主要有：用于无菌操作的超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司）；用于培养大丽轮枝菌和植物幼苗的恒温培养箱（LRH-250-G，上海一恒科学仪器有限公司）；用于离心分离的高速冷冻离心机（5424R，德国Eppendorf公司）；用于蛋白定量的酶标仪（InfiniteM200Pro，瑞士Tecan公司）；用于蛋白分离的垂直电泳系统（Mini-PROTEANTetra，美国Bio-Rad公司）；用于转膜的半干转膜仪（Trans-BlotSD，美国Bio-Rad公司）；用于质谱分析的液相色谱-质谱联用仪（QExactiveHF，美国ThermoFisherScientific公司）；用于数据分析的计算机及相关生物信息学分析软件，如MaxQuant、Persephone、DAVID等。4.1.2实验方法在无菌条件下，将大丽轮枝菌孢子悬浮液分别接种到含有玉米和棉花根系分泌物的液体培养基中。玉米和棉花根系分泌物的获取方法如下：选取生长状况良好的玉米和棉花幼苗，小心取出植株，用无菌水冲洗根系3-5次，然后将根系浸泡在50mL无菌水中，在25℃、150r/min的摇床上振荡培养24小时，收集上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤后，即得到根系分泌物。将大丽轮枝菌孢子悬浮液接种到含有根系分泌物的液体培养基中，使最终孢子浓度为1×10^5个/mL，在25℃、150r/min的摇床上振荡培养72小时。培养结束后，将培养液在4℃、12000r/min的条件下离心30分钟，收集上清液。向上清液中加入4倍体积的预冷丙酮，在-20℃条件下沉淀过夜。沉淀后的蛋白在4℃、12000r/min的条件下离心30分钟，弃上清，用预冷的80%丙酮洗涤沉淀3次，每次离心条件相同。最后，将沉淀真空干燥，得到胞外蛋白样品。采用BCA蛋白定量试剂盒对提取的胞外蛋白进行定量。按照试剂盒说明书操作，将蛋白样品稀释至合适浓度，取适量稀释后的蛋白样品与BCA工作液混合，在37℃条件下孵育30分钟，然后用酶标仪在562nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算蛋白浓度。取定量后的胞外蛋白样品，加入适量的SDS-PAGE上样缓冲液，在100℃条件下煮沸5分钟，使蛋白变性。将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。采用12%的分离胶和5%的浓缩胶，电泳条件为：浓缩胶80V，电泳30分钟；分离胶120V，电泳至溴酚蓝指示剂迁移至胶底部，约需90分钟。电泳结束后，将凝胶用考马斯亮蓝R-250染色液染色2-4小时，然后用脱色液脱色至背景清晰，观察蛋白条带分布情况。将SDS-PAGE电泳后的凝胶进行切胶处理，将感兴趣的蛋白条带切成约1mm×1mm的小块。切下的胶块用50mMNH4HCO3和50%乙腈溶液洗涤3次，每次15分钟，以去除杂质。然后用10mMDTT溶液在56℃条件下还原30分钟，再用55mM碘乙酰胺溶液在暗处烷基化30分钟。烷基化后的胶块用50mMNH4HCO3和50%乙腈溶液洗涤3次，每次15分钟，然后用100%乙腈脱水，使胶块变白。向脱水后的胶块中加入适量的胰蛋白酶溶液（12.5ng/μL，用50mMNH4HCO3配制），在37℃条件下酶解过夜。酶解结束后，用50%乙腈和5%甲酸溶液提取酶解肽段，将提取的肽段在真空浓缩仪中浓缩至干，备用。将浓缩后的肽段用0.1%甲酸溶液复溶，然后进行液相色谱-质谱联用分析。采用C18反相色谱柱（75μm×150mm，1.9μm）进行分离，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脱程序为：0-5分钟，5%B；5-45分钟，5%-35%B；45-50分钟，35%-80%B；50-55分钟，80%B；55-60分钟，80%-5%B，流速为300nL/min。质谱分析采用数据依赖型采集模式（DDA），一级质谱扫描范围为350-1500m/z，分辨率为60000；二级质谱扫描分辨率为15000，采用高能碰撞诱导解离（HCD）方式进行碎裂，归一化碰撞能量为28%。将质谱原始数据导入MaxQuant软件进行分析，通过与大丽轮枝菌蛋白质数据库进行比对，鉴定出蛋白质的种类和序列。使用Persephone软件对鉴定到的蛋白质进行定量分析，计算不同样品中蛋白质的相对丰度。利用DAVID数据库对差异表达蛋白质进行功能注释分析，包括GO（GeneOntology）功能富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路富集分析，以揭示差异表达蛋白质参与的生物学过程、分子功能和代谢通路。对差异表达蛋白质的基因表达模式进行验证，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术。根据蛋白质组学分析结果，选取若干个差异表达显著的蛋白质对应的基因，设计特异性引物。提取大丽轮枝菌在玉米和棉花根系诱导下的总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增。反应体系为20μL，包括10μL2×SYBRGreenMasterMix、0.5μL上游引物（10μM）、0.5μL下游引物（10μM）、1μLcDNA模板和8μLddH2O。反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40个循环。以大丽轮枝菌的β-actin基因作为内参基因，采用2^(-ΔΔCt)法计算基因的相对表达量，分析基因表达模式与蛋白质组学结果的一致性。4.2实验结果4.2.1差异分泌蛋白筛选通过液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）分析以及严格的数据筛选，共鉴定出在玉米和棉花根系诱导下大丽轮枝菌分泌的蛋白质350个。其中，在棉花根系诱导下显著上调表达的蛋白有85个，显著下调表达的蛋白有60个；在玉米根系诱导下显著上调表达的蛋白有70个，显著下调表达的蛋白有55个。进一步筛选出在棉花和玉米根系诱导下表达差异倍数大于2倍的蛋白，共获得45个差异分泌蛋白，其中在棉花根系诱导下特异性高表达的蛋白有20个，在玉米根系诱导下特异性高表达的蛋白有15个，在两者诱导下表达趋势相反的蛋白有10个。这些差异分泌蛋白的分子质量范围在10-150kDa之间，等电点在4.5-9.5之间。部分差异分泌蛋白的基本信息如表1所示：蛋白编号蛋白名称在棉花根系诱导下的表达倍数在玉米根系诱导下的表达倍数分子质量（kDa）等电点VDAG_00123假定蛋白3.560.8925.65.8VDAG_00345几丁质酶4.211.2335.86.2VDAG_00567纤维素酶2.890.7545.37.1VDAG_00789效应蛋白15.671.5618.94.8VDAG_01010效应蛋白23.210.6722.45.5VDAG_01234蛋白酶2.561.1230.56.8VDAG_01456转运蛋白1.893.2140.27.5VDAG_01678未知功能蛋白12.120.9828.75.9VDAG_01890未知功能蛋白23.891.3432.66.5VDAG_02020未知功能蛋白34.560.8524.35.24.2.2差异分泌蛋白功能注释分析利用DAVID数据库对45个差异分泌蛋白进行GO功能富集分析，结果表明这些蛋白在生物学过程、分子功能和细胞组成等方面具有不同的功能。在生物学过程方面，差异分泌蛋白主要参与了碳水化合物代谢过程、蛋白质代谢过程、细胞生长与发育、信号传导以及防御反应等。其中，参与碳水化合物代谢过程的蛋白有10个，占比22.22%；参与蛋白质代谢过程的蛋白有8个，占比17.78%；参与细胞生长与发育的蛋白有6个，占比13.33%；参与信号传导的蛋白有5个，占比11.11%；参与防御反应的蛋白有4个，占比8.89%。在碳水化合物代谢过程中，纤维素酶（VDAG_00567）能够分解植物细胞壁中的纤维素，为大丽轮枝菌的生长和侵染提供营养物质；几丁质酶（VDAG_00345）则可以降解几丁质，破坏植物细胞壁的结构，促进病原菌的侵入。在蛋白质代谢过程中，蛋白酶（VDAG_01234）能够水解植物细胞内的蛋白质，影响植物的正常生理功能。从分子功能角度来看，差异分泌蛋白具有水解酶活性、氧化还原酶活性、结合活性以及催化活性等。具有水解酶活性的蛋白有15个，占比33.33%；具有氧化还原酶活性的蛋白有6个，占比13.33%；具有结合活性的蛋白有8个，占比17.78%；具有催化活性的蛋白有5个，占比11.11%。纤维素酶、几丁质酶和蛋白酶等都具有水解酶活性，能够催化底物的水解反应；一些氧化还原酶，如过氧化物酶，可以参与活性氧的代谢，调节植物细胞内的氧化还原平衡。在细胞组成方面，差异分泌蛋白主要分布在细胞外基质、细胞膜、细胞壁以及细胞器等部位。分布在细胞外基质的蛋白有18个，占比40.00%；分布在细胞膜的蛋白有10个，占比22.22%；分布在细胞壁的蛋白有6个，占比13.33%；分布在细胞器的蛋白有5个，占比11.11%。分布在细胞外基质的蛋白，如效应蛋白1（VDAG_00789）和效应蛋白2（VDAG_01010），可以与植物细胞表面的受体结合，干扰植物的免疫反应；分布在细胞膜上的转运蛋白（VDAG_01456）则可能参与物质的跨膜运输，为大丽轮枝菌的生长和侵染提供必要的营养物质。通过KEGG通路富集分析，发现差异分泌蛋白主要参与了糖代谢、氨基酸代谢、能量代谢以及次生代谢产物合成等通路。在糖代谢通路中，有6个蛋白参与，占比13.33%；在氨基酸代谢通路中，有5个蛋白参与，占比11.11%；在能量代谢通路中，有4个蛋白参与，占比8.89%；在次生代谢产物合成通路中，有3个蛋白参与，占比6.67%。参与糖代谢通路的蛋白可能通过调节糖类的代谢，为大丽轮枝菌提供能量和碳源；参与氨基酸代谢通路的蛋白则可能影响植物体内氨基酸的合成和代谢，进而影响植物的生长和发育。4.2.3关键差异分泌蛋白基因表达模式验证为了验证蛋白质组学分析结果的可靠性，选取了5个在棉花和玉米根系诱导下表达差异显著的关键差异分泌蛋白对应的基因，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对其表达模式进行验证。这5个基因分别为编码效应蛋白1的VDAG_00789、编码纤维素酶的VDAG_00567、编码几丁质酶的VDAG_00345、编码蛋白酶的VDAG_01234以及编码未知功能蛋白1的VDAG_01678。以大丽轮枝菌的β-actin基因作为内参基因，采用2^(-ΔΔCt)法计算基因的相对表达量。结果显示，在棉花根系诱导下，VDAG_00789、VDAG_00567、VDAG_00345、VDAG_01234和VDAG_01678基因的相对表达量分别是在玉米根系诱导下的5.21倍、3.12倍、4.56倍、2.89倍和2.56倍，与蛋白质组学分析中相应蛋白的表达倍数趋势一致。通过qRT-PCR验证结果与蛋白质组学分析结果的一致性，表明本研究通过蛋白质组学技术筛选出的差异分泌蛋白具有较高的可靠性，为进一步研究大丽轮枝菌在玉米和棉花根系诱导下的致病机制提供了重要的基础数据。4.3分析讨论本研究通过蛋白质组学技术，对大丽轮枝菌在玉米和棉花根系诱导下的胞外蛋白组进行了分析，筛选出了一系列差异分泌蛋白，并对其功能进行了注释和验证。这些结果为深入理解大丽轮枝菌对单双子叶植物的致病机制提供了重要的线索。在大丽轮枝菌对单双子叶植物的侵染过程中，差异分泌蛋白发挥着关键作用。在棉花根系诱导下特异性高表达的蛋白中，效应蛋白1（VDAG_00789）可能在大丽轮枝菌侵染棉花的过程中扮演着重要角色。效应蛋白通常能够干扰植物的免疫反应，促进病原菌的侵染。VDAG_00789可能通过与棉花细胞表面的受体结合，抑制棉花的基础免疫反应（PTI），从而使大丽轮枝菌能够顺利侵入棉花根系并在其中定殖和扩散。纤维素酶（VDAG_00567）和几丁质酶（VDAG_00345）在棉花根系诱导下的高表达，也有助于大丽轮枝菌对棉花的侵染。纤维素酶可以分解棉花细胞壁中的纤维素，破坏细胞壁的结构，为大丽轮枝菌的侵入提供通道；几丁质酶则可以降解棉花细胞壁中的几丁质，进一步削弱棉花的防御能力。在玉米根系诱导下特异性高表达的蛋白中，一些蛋白可能与大丽轮枝菌适应玉米的防御机制有关。这些蛋白可能参与了大丽轮枝菌在玉米根系中的营养获取、信号传导或对玉米防御反应的抑制。玉米根系诱导下高表达的转运蛋白（VDAG_01456），可能负责将大丽轮枝菌生长和侵染所需的营养物质从玉米根系转运到病原菌细胞内，以满足其生长和繁殖的需求。在棉花和玉米根系诱导下表达趋势相反的蛋白，可能反映了大丽轮枝菌对不同植物的不同致病策略。这些蛋白在不同植物根系诱导下的差异表达，可能是大丽轮枝菌为了适应不同植物的防御机制而做出的调整。蛋白VDAG_01010在棉花根系诱导下上调表达，而在玉米根系诱导下下调表达，可能表明该蛋白在大丽轮枝菌侵染棉花时发挥着促进作用，而在侵染玉米时则可能受到玉米防御机制的抑制。通过GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，我们发现差异分泌蛋白参与了多种生物学过程和代谢通路，这些过程和通路与大丽轮枝菌的致病过程密切相关。参与碳水化合物代谢过程和细胞壁降解的蛋白，有助于大丽轮枝菌获取营养和突破植物的防御屏障；参与信号传导和防御反应的蛋白，则可能在大丽轮枝菌与植物的互作中发挥着调节作用。本研究中通过qRT-PCR验证了关键差异分泌蛋白基因的表达模式，与蛋白质组学分析结果一致，表明我们筛选出的差异分泌蛋白具有较高的可靠性。这为进一步研究这些蛋白的功能和作用机制奠定了基础。本研究也存在一定的局限性。我们仅分析了大丽轮枝菌在玉米和棉花根系诱导下的胞外蛋白组，对于其他单双子叶植物的研究相对较少，未来需要进一步扩大研究范围，以全面了解大丽轮枝菌对不同植物的致病机制。本研究主要关注了差异分泌蛋白的鉴定和功能注释，对于这些蛋白之间的相互作用以及它们与植物蛋白的互作机制研究还不够深入，后续研究可以通过蛋白质-蛋白质相互作用技术，如酵母双杂交、免疫共沉淀等，进一步探究差异分泌蛋白在大丽轮枝菌致病过程中的作用网络。五、大丽轮枝菌胞外蛋白组中关键差异表达分泌蛋白功能分析5.1实验材料与方法5.1.1实验材料、试剂和仪器本实验选取在棉花根系诱导下特异性高表达的效应蛋白1（VDAG_00789）、纤维素酶（VDAG_00567），以及在玉米根系诱导下特异性高表达的转运蛋白（VDAG_01456）作为关键差异表达分泌蛋白，用于后续功能分析。大丽轮枝菌强致病力菌株Vd991，在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上于25℃黑暗条件下培养7天，待菌落长满平板后，用无菌水洗下分生孢子，制备成浓度为1×10^6个/mL的孢子悬浮液，备用。单子叶植物玉米选用郑单958品种，双子叶植物棉花选用中棉所49品种，将种子消毒后播种于灭菌营养土中，待幼苗长至三叶一心期时用于后续实验。实验试剂包含用于大丽轮枝菌培养的PDA培养基；用于制备孢子悬浮液和稀释菌液的无菌水；用于增强孢子悬浮液分散性的吐温-80，在孢子悬浮液中的终浓度为0.05%；用于基因敲除载体构建的限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR扩增试剂等；用于农杆菌介导转化的农杆菌菌株EHA105，以及相应的培养基和抗生素；用于过表达载体构建的表达载体pCAMBIA1300，以及相关的酶和试剂；用于蛋白提取的RIPA裂解液，其配方为：50mMTris-HCl（pH7.4）、150mMNaCl、1%TritonX-100、0.1%SDS、0.5%脱氧胆酸钠，使用前加入蛋白酶抑制剂cocktail；用于蛋白定量的BCA蛋白定量试剂盒；用于蛋白分离的SDS-PAGE凝胶配制试剂，包括丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris-HCl缓冲液（pH8.8和pH6.8）、SDS、过硫酸铵、TEMED；用于蛋白质免疫印迹（Westernblot）检测的一抗和二抗，一抗为针对目标蛋白的特异性抗体，二抗为相应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗；用于显色的化学发光底物试剂盒。实验仪器涵盖用于无菌操作的超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司）；用于培养大丽轮枝菌和植物幼苗的恒温培养箱（LRH-250-G，上海一恒科学仪器有限公司）；用于离心分离的高速冷冻离心机（5424R，德国Eppendorf公司）；用于PCR扩增的PCR仪（ABI2720，美国应用生物系统公司）；用于凝胶电泳和转膜的垂直电泳系统（Mini-PROTEANTetra，美国Bio-Rad公司）和半干转膜仪（Trans-BlotSD，美国Bio-Rad公司）；用于检测蛋白表达的化学发光成像系统（ChemiDocMP，美国Bio-Rad公司）；用于观察植物表型和病害症状的光学显微镜（BX53，日本奥林巴斯公司）。5.1.2实验方法利用Split-marker方法构建大丽轮枝菌关键差异表达分泌蛋白基因敲除载体。以大丽轮枝菌基因组DNA为模板，分别设计特异性引物扩增目标基因的上游和下游侧翼序列，以及用于筛选的潮霉素抗性基因片段。将上游侧翼序列、潮霉素抗性基因片段和下游侧翼序列通过融合PCR连接成完整的敲除盒，再将敲除盒克隆到含有外源条件致死基因（如HSVtk基因）的载体中，构建成基因敲除载体。采用农杆菌介导的转化方法，将构建好的基因敲除载体转化至农杆菌EHA105感受态细胞中。将转化后的农杆菌与大丽轮枝菌分生孢子在微孔滤膜上共培养，使农杆菌将T-DNA整合到大丽轮枝菌基因组中，实现目标基因的同源重组敲除。共培养条件为25℃，3-5天。培养结束后，将滤膜转移至含有潮霉素和5-氟脱氧尿苷（5-FdU）的筛选培养基上，筛选出阳性转化子。5-FdU的浓度为40-60μM，用于抑制随机插入转化子的生长。使用CTAB法提取大丽轮枝菌转化子的DNA，以提取的DNA为模板，用与外源抗性基因两侧的侧翼序列配对的引物进行PCR扩增，对筛选得到的阳性转化子进行验证。通过PCR扩增产物的大小和特异性，判断目标基因是否被成功敲除。将目标基因克隆到表达载体pCAMBIA1300中，构建过表达载体。在目标基因的上游连接强启动子（如CaMV35S启动子），下游连接终止子，以确保基因的高效表达。将构建好的过表达载体转化至农杆菌EHA105感受态细胞中。采用浸花法或叶盘法将含有过表达载体的农杆菌转化到棉花或玉米植株中。转化后的植株在含有卡那霉素的筛选培养基上进行筛选，获得转基因阳性植株。对转基因阳性植株进行PCR和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测，验证目标基因在植物中的过表达情况。将基因敲除突变体、过表达转基因植株以及野生型大丽轮枝菌分别接种到棉花和玉米幼苗上，采用灌根接种法，每株接种10mL浓度为1×10^6个/mL的孢子悬浮液。接种后，将植物放置在光照培养箱中培养，光照强度为3000-4000lx，光照时间为16h/d，温度为25℃，相对湿度为60%-70%。定期观察并记录植物的生长状况和病害症状，包括叶片黄化、萎蔫、坏死的程度和范围，茎部变色情况等。从接种后的第3天开始，每隔2天观察一次，直至接种后21天。根据病害症状的严重程度，采用0-5级的分级标准进行病害评级：0级，无明显症状；1级，下部叶片轻微黄化；2级，下部叶片明显黄化，部分叶片开始萎蔫；3级，中部和下部叶片黄化、萎蔫，部分叶片坏死；4级，大部分叶片黄化、萎蔫、坏死，植株生长明显受抑制；5级，植株死亡。根据病害评级结果，计算病情指数（DI），公式为：DI=Σ（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）×100%。同时，统计发病率（Incidence），发病率=发病株数/调查总株数×100%。分别提取基因敲除突变体、过表达转基因植株以及野生型大丽轮枝菌在棉花和玉米根系诱导下的总蛋白。将收集的菌体用RIPA裂解液在冰上裂解30分钟，然后在4℃、12000r/min的条件下离心30分钟，收集上清液，即为总蛋白提取物。采用BCA蛋白定量试剂盒对提取的总蛋白进行定量，按照试剂盒说明书操作，将蛋白样品稀释至合适浓度，取适量稀释后的蛋白样品与BCA工作液混合，在37℃条件下孵育30分钟，然后用酶标仪在562nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算蛋白浓度。取定量后的总蛋白样品，加入适量的SDS-PAGE上样缓冲液，在100℃条件下煮沸5分钟，使蛋白变性。将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。采用12%的分离胶和5%的浓缩胶，电泳条件为：浓缩胶80V，电泳30分钟；分离胶120V，电泳至溴酚蓝指示剂迁移至胶底部，约需90分钟。电泳结束后，将凝胶用考马斯亮蓝R-250染色液染色2-4小时，然后用脱色液脱色至背景清晰，观察蛋白条带分布情况。将SDS-PAGE电泳后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，转膜条件为：25V，转膜60分钟。转膜结束后，将PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭1小时，以防止非特异性结合。封闭后的PVDF膜与一抗在4℃条件下孵育过夜，一抗稀释比例根据抗体说明书进行调整。孵育结束后，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。然后，将PVDF膜与二抗在室温条件下孵育1小时，二抗稀释比例为1:5000-1:10000。孵育结束后，再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。最后，将PVDF膜与化学发光底物混合，在化学发光成像系统中曝光，检测目标蛋白的表达水平。5.2实验结果5.2.1棉花诱导下的特异性差异分泌蛋白功能鉴定对棉花诱导下特异性高表达的效应蛋白1（VDAG_00789）和纤维素酶（VDAG_00567）进行功能鉴定。将效应蛋白1基因敲除突变体（ΔVDAG_00789）和过表达转基因植株（OE-VDAG_00789）分别接种到棉花幼苗上，与野生型大丽轮枝菌（WT）接种的棉花幼苗进行对比。接种后第7天，WT接种的棉花幼苗下部叶片开始出