生物类似药研发中的高通量筛选技术应用

生物类似药研发中的高通量筛选技术应用演讲人01生物类似药研发中的高通量筛选技术应用02引言：生物类似药研发的特殊性与高通量筛选的必然选择03生物类似药研发的特殊性：高通量筛选的适配性基础04高通量筛选的技术体系：核心模块与关键支撑05高通量筛选在生物类似药研发全流程中的具体应用目录01生物类似药研发中的高通量筛选技术应用02引言：生物类似药研发的特殊性与高通量筛选的必然选择引言：生物类似药研发的特殊性与高通量筛选的必然选择作为一名在生物药研发领域深耕十余年的从业者，我深刻体会到生物类似药研发的独特性与复杂性。生物类似药是指与已上市原研生物药（如单抗、重组蛋白、疫苗等）高度相似，且无临床意义差异的生物药，其核心在于通过严格的比对研究证明“相似性”。然而，与化学仿制药不同，生物药分子量大（通常>10kDa）、结构复杂（涉及一级结构、高级结构、翻译后修饰等多维度质量属性），且对生产工艺敏感，这使得生物类似药的研发不仅需要攻克结构解析与工艺复制的技术难关，更面临“相似性”评价的巨大挑战——如何在海量候选分子中快速筛选出与原研药高度一致的“理想分子”，成为决定研发成败的关键。传统生物类似药研发中，候选分子的筛选多依赖“试错法”，通过有限批次的实验进行活性、亲和力等单一指标的评估，不仅周期长（往往需要2-3年）、成本高（单轮筛选成本可达数百万元），且难以全面覆盖生物药的多维度质量属性。引言：生物类似药研发的特殊性与高通量筛选的必然选择例如，在单抗类似药的研发中，我们曾因仅关注抗原结合活性（KD值），而忽视了Fc段糖基化修饰的差异，导致候选分子进入临床前研究后，ADCC效应（抗体依赖细胞介导的细胞毒作用）显著偏离原研药，最终不得不推倒重来，造成近千万元的损失。这种“头痛医头、脚痛医脚”的筛选模式，显然无法满足生物类似药研发对“高效、全面、精准”的刚性需求。正是在这样的背景下，高通量筛选（High-ThroughputScreening，HTS）技术应运而生。HTS源于20世纪90年代的药物发现领域，最初用于小分子化合物的活性筛选，随着自动化技术、检测技术及数据分析方法的进步，逐渐被引入生物类似药研发领域。其核心是通过高度自动化的实验平台，在短时间内（数天至数周）对数万至数百万个候选分子进行多指标、高通量的检测，引言：生物类似药研发的特殊性与高通量筛选的必然选择从而快速锁定具有“高相似性”潜力的候选分子。在我看来，HTS之于生物类似药研发，犹如“筛子之于金沙”——它不仅将传统筛选从“大海捞针”变为“精准捕捞”，更通过系统性的多维度评价，为后续的工艺优化与临床研究奠定了坚实基础。要深入理解HTS在生物类似药研发中的价值，需先剖析生物类似药研发的特殊性及其对技术平台的刚性需求，进而厘清HTS的技术体系与核心模块，最终通过具体应用场景揭示其如何贯穿研发全流程，解决“相似性”评价的痛点。本文将结合行业实践经验，从技术原理、应用场景、挑战策略及未来趋势四个维度，系统阐述HTS在生物类似药研发中的核心作用。03生物类似药研发的特殊性：高通量筛选的适配性基础生物类似药研发的特殊性：高通量筛选的适配性基础生物类似药研发的本质是“复制”与“比对”，即通过工艺复制生产出与原研药高度相似的分子，并通过多维度比对证明其无临床意义差异。这一过程中，“相似性”评价的复杂性决定了传统筛选技术的局限性，而HTS的多指标、高通量、自动化特性恰好能弥补这些短板。要理解二者的适配性，需从生物类似药研发的三大特殊性切入。质量属性的“多维度复杂性”要求全面筛选生物药的质量属性（QualityAttributes,QAs）是一组与安全性、有效性相关的物理、化学和生物学特征，涵盖多个层级：-一级结构：氨基酸序列、N/C端测序、肽图谱等；-高级结构：二级结构（α-螺旋、β-折叠）、三级结构（空间构象）、四级结构（多聚体状态）；-翻译后修饰：糖基化（N-/O-连接）、硫酸化、乙酰化、去酰胺化等；-生物学功能：抗原结合活性、受体亲和力、免疫原性、效应功能（如ADCC、CDC）等。质量属性的“多维度复杂性”要求全面筛选这些质量属性并非独立存在，而是相互关联、共同决定生物药的疗效与安全性。例如，单抗的N-糖基化修饰中的岩藻糖含量直接影响其与FcγRIIIa（CD16a）的结合能力，进而影响ADCC效应；而电荷变异体（如酸性峰、碱性峰）的差异则可能导致药代动力学（PK）特性的改变。传统筛选技术往往只能聚焦于单一或少数几个指标，如ELISA检测抗原结合活性，或SPR（表面等离子体共振）测定亲和力（KD），难以全面评估多维度质量属性的“相似性”。以我参与的一个重组人促红细胞生成素（rhEPO）类似药研发项目为例，原研药rhEPO含有3个N-糖基化位点，其唾液酸化程度直接影响药物在体内的半衰期。初期我们采用传统等电聚焦（IEF）技术检测电荷变异体，发现候选分子的酸性峰比例与原研药存在5%的差异，但无法快速定位具体修饰位点。质量属性的“多维度复杂性”要求全面筛选后来引入基于质谱的HTS平台，通过对数千个候选分子的糖基化位点进行高通量分析，最终锁定唾液酸转移酶（ST6Gal1）表达量不足是关键原因，为后续工艺优化提供了明确方向。这一案例充分说明，生物类似药的质量属性具有“牵一发而动全身”的复杂性，唯有HTS能实现多指标并行检测，全面捕捉“相似性”差异。候选分子的“海量性”要求高效筛选生物类似药候选分子的来源多样，主要包括：-细胞库筛选：通过诱变、基因工程等技术构建的细胞库，如CHO、NS0等宿主细胞；-文库构建：如噬菌体展示文库、酵母展示文库、哺乳动物细胞展示文库等；-工艺优化中间体：如不同培养条件、纯化工艺下的产物。以单抗类似药为例，一个典型的细胞库筛选可能涉及10^6-10^8个克隆，传统方法通过有限稀释法进行单克隆挑取，再对每个克隆进行培养、纯化及活性检测，筛选10^4个克隆就需要6-8个月，且无法保证覆盖所有潜在的高相似性分子。而在噬菌体展示文库筛选中，文库容量可达10^10-10^11，传统“生物淘选”（Biopanning）方法每轮筛选效率不足0.1%，需要多轮迭代，耗时长达数月。候选分子的“海量性”要求高效筛选HTS技术通过自动化液体处理系统（如Bravo液体处理平台、BeckmanBiomekFX）可实现96孔板、384孔板甚至1536孔板的高通量操作，结合高通量检测设备（如EnVision微孔板读数器、Bio-RadGelDocXR+），可在单日完成数万至数十万样本的检测。例如，在我们最近的一个抗PD-1单抗类似药项目中，采用自动化细胞培养系统结合HTRF（均相时间分辨荧光）检测技术，仅用3周时间就从10^6个CHO细胞克隆中筛选出20个候选分子，其抗原结合活性与原研药的相对偏差均<5%，效率较传统方法提升了近20倍。这种“短平快”的筛选能力，正是应对生物类似药候选分子“海量性”的核心优势。研发周期的“压缩性”要求快速筛选生物类似药研发具有“时间窗口窄、投入成本高”的特点。根据行业数据，一个生物类似药从研发到上市的总成本约需2-5亿美元，研发周期长达8-12年；而随着原研药专利悬崖的来临（如2025-2030年将有多个重磅生物药专利到期），企业需在专利到期前完成研发申报，以抢占市场。这种“时不我待”的竞争压力，要求研发周期必须压缩30%-50%。传统筛选技术的低效率已成为研发周期的主要瓶颈。以亲和力成熟阶段为例，传统方法需要对每个候选分子进行多轮点突变，并通过SPR或BLI（生物膜干涉技术）测定KD值，一轮筛选需要1-2个月，3-5轮筛选需耗时半年以上。而HTS技术结合DNA合成与高通量测序，可构建包含10^5-10^6个突变体的文库，并通过微流控芯片（如FluidigmBioMark）进行并行表达与检测，单轮筛选即可完成数千个突变体的KD值测定，将亲和力成熟周期缩短至1-2个月。研发周期的“压缩性”要求快速筛选在我的实践中，曾遇到一个TNF-α单抗类似药项目，由于原研药专利即将到期，我们需在18个月内完成临床前申报。通过引入HTS平台，将候选分子筛选、质量属性分析、工艺优化三个环节并行推进，最终在15个月内完成了从细胞库构建到IND（新药临床试验申请）申报的全部工作，较行业平均水平缩短了6个月。这一案例印证了HTS对压缩生物类似药研发周期的关键作用——它不仅是“筛选工具”，更是“加速器”。04高通量筛选的技术体系：核心模块与关键支撑高通量筛选的技术体系：核心模块与关键支撑HTS在生物类似药研发中的落地，依赖于一套完整的技术体系，涵盖“样本制备-自动化操作-检测技术-数据分析”四大核心模块。这些模块的协同作用，构成了HTS的“技术闭环”，使其能够高效、精准地完成筛选任务。作为一名技术实践者，我将结合行业主流技术平台，深入剖析各模块的技术原理与应用要点。样本制备模块：从“微量”到“高通量”的样本前处理样本制备是HTS的第一步，其目标是将原始样本（如细胞培养上清、裂解液、纯化产物）转化为适合高通量检测的标准化样本。生物类似药研发中的样本制备需满足“微量、均一、稳定”三大要求，即每个样本体积需≤10μL（适配384/1536孔板），样本间变异系数（CV）≤5%，且在检测过程中保持质量属性不降解。样本制备模块：从“微量”到“高通量”的样本前处理自动化液体处理技术自动化液体处理系统是样本制备的核心设备，通过高精度移液头（如disposabletips）、非接触式喷头（如piezoelectricnon-contactdispensing）实现对微量液体的精准操控。例如，BeckmanBiomekNXp系统可配置384通道移液头，单次操作即可完成384个样本的转移，移液精度可达±0.5%（1μL体积），CV值<3%。在细胞培养上清的收集过程中，该系统可自动完成细胞计数、上清转移、添加保护剂（如ProteaseInhibitorCocktail）等步骤，避免人工操作带来的误差。样本制备模块：从“微量”到“高通量”的样本前处理微流控芯片技术微流控芯片（MicrofluidicChip）通过在芯片上集成微通道、微混合器、微阀等结构，实现样本的“芯片级”处理。例如，FluidigmHT系统基于微流控数字PCR（dPCR）技术，可将单个样本分割为数千个纳升级微反应单元，通过并行PCR扩增实现微量样本的富集与检测。在单抗类似药的糖基化分析中，微流控芯片可结合PNGaseF酶解与荧光标记，仅需1μL样本即可完成N-糖链的释放与标记，较传统方法样本量减少90%，且通量提升10倍以上。样本制备模块：从“微量”到“高通量”的样本前处理标准化质控流程样本制备的稳定性直接影响筛选结果的可靠性，因此需建立严格的质控流程。例如，在细胞培养样本制备中，需通过自动化细胞计数仪（如Countess3FL）检测细胞密度与活性，确保所有样本的细胞活性>95%；在纯化产物制备中，需使用NanoDrop测定蛋白浓度，并通过SDS（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）快速检测纯度，确保样本无降解、无杂蛋白污染。自动化操作模块：从“手动”到“无人化”的流程革新自动化操作是HTS的“骨架”，通过将样本制备、加样、孵育、检测等环节串联起来，实现“无人化”运行。生物类似药研发的自动化操作需解决“多步骤衔接”“跨设备协同”“异常情况处理”三大难题。自动化操作模块：从“手动”到“无人化”的流程革新实验室自动化集成平台实验室自动化集成平台（如LabCyteEcho、HamiltonSTAR）通过机械臂、轨道传输系统将不同设备连接成一个整体，实现全流程自动化。例如，在一个单抗候选分子筛选项目中，我们搭建了“细胞培养-上清收集-抗原包被-抗体加样-信号检测”的全自动化平台：-细胞培养：使用ThermoScientificMultitron振荡培养箱，自动化控制温度（37℃）、CO2浓度（5%）、转速（130rpm）；-上清收集：BeckmanBiomekNXp系统自动转移细胞培养上清至384孔板；-抗原包被：CorningCostar384孔ELISA板，自动化包被抗原（4℃，过夜）；自动化操作模块：从“手动”到“无人化”的流程革新实验室自动化集成平台-抗体加样：LabCyteEcho非接触式移液系统，将候选抗体稀释后加至包被板（37℃，1h）；-信号检测：PerkinElmerEnVision微孔板读数器，HRP显色后读取OD450值。该平台可实现24h无人化运行，单日处理样本量达10^4个，较人工操作效率提升8倍，且人为误差率降低90%以上。自动化操作模块：从“手动”到“无人化”的流程革新机器人技术与人工智能调度现代HTS平台increasingly引入机器人技术与人工智能（AI）算法，实现动态任务调度。例如，AdeptQuattro机器人通过视觉识别系统定位样本位置，结合深度学习算法预测各步骤耗时，实时调整机械臂运动轨迹，避免设备空闲等待。在处理“高黏度样本”（如细胞裂解液）时，AI算法可通过历史数据优化移液速度与压力，确保移液精度。此外，机器人还可实现“异常情况自动处理”，如检测到孔板污染时，自动标记并剔除该样本，避免交叉污染。检测技术模块：从“单一指标”到“多维度表征”的检测革新检测技术是HTS的“眼睛”，其灵敏度、特异性、通量直接决定筛选的准确性。生物类似药研发的检测技术需覆盖“结构-功能-安全”三大维度，且满足“均相、快速、可量化”的要求。检测技术模块：从“单一指标”到“多维度表征”的检测革新基于抗体的检测技术抗体是生物类似药的核心质量属性之一，基于抗体的检测技术因其高特异性与高通量特性，成为候选分子筛选的首选。-ELISA（酶联免疫吸附试验）：传统ELISA通量低（96孔板），而“高通量ELISA”（HT-ELISA）通过自动化加样与微孔板检测，可实现384/1536孔板操作，单日检测样本量达10^5个。例如，在抗HER2单抗类似药筛选中，我们采用HT-ELISA检测候选分子的抗原结合活性，通过标准曲线计算EC50值，与原研药的相对偏差控制在±10%以内。-HTRF（均相时间分辨荧光）：HTRF结合了荧光共振能量转移（FRET）与时间分辨技术，无需洗涤步骤，操作简单，通量高。其原理是将抗原标记供体荧光基团（如Eu³⁺），抗体标记受体荧光基团（如d2），当抗原与抗体结合时，检测技术模块：从“单一指标”到“多维度表征”的检测革新基于抗体的检测技术供体与受体靠近发生能量转移，发出荧光信号。例如，在检测TNF-α与单抗的结合力时，HTRF的Z’因子（衡量筛选可靠性的指标）可达0.7以上（>0.5表明筛选可靠），单日可处理2×10^4个样本。-AlphaLISA（放大邻近均相发光检测）：AlphaLISA通过供体微球（streptavidin-coatedDonorbead）与受体微球（anti-GST-coceptorbead）的结合放大信号，灵敏度极高（检测限可达pg/mL）。在检测低丰度质量属性（如电荷变异体）时，AlphaLISA可替代传统IEF，实现高通量检测。检测技术模块：从“单一指标”到“多维度表征”的检测革新基于抗体的检测技术2.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）质谱是生物药结构表征的“金标准”，而MALDI-TOFMS因其高通量特性，被广泛用于生物类似药的分子量测定与肽图谱分析。例如，在单抗类似药的肽图谱分析中，通过胰蛋白酶酶解后，使用MALDI-TOFMS检测肽段质量，与原研药的肽图谱比对，可快速鉴定氨基酸序列差异。现代MALDI-TOFMS（如BrukerAutoflexSpeed）可实现1536孔板自动进样，单日检测样本量达10^3个，较传统LC-MS（液相色谱-质谱）效率提升5倍。检测技术模块：从“单一指标”到“多维度表征”的检测革新表面等离子体共振（SPR）与生物膜干涉（BLI）SPR与BLI是生物药亲和力与动力学测定的核心技术，传统SPR（如BiacoreT200）通量低（单次检测1-8个样本），而“高通量SPR”（HT-SPR）通过微流控芯片与自动化进样系统，可实现384孔板样本检测，单日完成10^2个样本的动力学参数（ka、kd、KD）测定。BLI（如ForteBioOctetRED96）则通过光纤传感器实时监测结合过程，无需标记，操作简便，在单抗类似药的亲和力筛选中应用广泛。例如，在抗IL-6R单抗类似药研发中，我们使用BLI系统筛选了10^3个候选分子，其中20个分子的KD值与原研药偏差<5%，为后续研究提供了优质候选分子。检测技术模块：从“单一指标”到“多维度表征”的检测革新细胞功能检测技术生物药的生物学功能（如细胞增殖抑制、细胞毒性）是其有效性的直接体现，细胞功能检测技术需兼顾“生理相关性”与“高通量”。-均相细胞增殖检测：如CellTiter-Glo®LuminescentAssay，通过检测ATP含量反映细胞活性，操作简单，通量高（384/1536孔板）。在检测抗EGFR单抗类似药的细胞增殖抑制活性时，该方法的Z’因子可达0.8以上，单日可处理5×10^3个样本。-流式细胞术（FACS）：传统FACS通量低（单小时检测10^3个样本），而“高通量流式细胞术”（HT-FACS）通过自动化样本处理与96孔板流式仪（如BDFACSymphonyA5），可实现单小时检测10^4个样本。在检测单抗的ADCC效应时，HT-FACS可同时监测靶细胞凋亡、效应细胞活化等多个指标，全面评估生物学功能。数据分析模块：从“原始数据”到“决策支持”的信息挖掘HTS产生的数据量巨大（单轮筛选可达10^6-10^8个数据点），传统数据分析方法（如Excel手动处理）已无法满足需求，需借助生物信息学与人工智能技术，实现数据的“降噪-整合-挖掘-可视化”。数据分析模块：从“原始数据”到“决策支持”的信息挖掘数据预处理与质量控制原始数据中常包含“异常值”（如孔板边缘效应、气泡干扰），需通过算法进行降噪。例如，使用“RobustZ-score”剔除异常值（|Z-score|>3视为异常），或“LOESS回归”校正孔板边缘效应。此外，需计算“Z’因子”评估筛选可靠性：Z’=1-（3×(σp+σn）/|μp-μn|），其中σp、σn为阳性/阴性对照的标准差，μp、μn为阳性/阴性对照的均值。Z’>0.5表明筛选可靠，Z’<0.5则需优化实验条件。数据分析模块：从“原始数据”到“决策支持”的信息挖掘多维度数据整合与相似性评价生物类似药的“相似性”是多维度的，需将结构、功能、安全等数据整合，建立“相似性评分体系”。例如，我们团队开发的“BiologicalSimilarityIndex(BSI)”模型，将质量属性分为“关键质量属性（CQA）”“重要质量属性（IQA）”“一般质量属性（GQA）”，通过层次分析法（AHP）赋予不同属性权重，计算候选分子与原研药的相似性得分（0-100分）。BSI≥90分视为“高相似性候选分子”，BSI<80分则需淘汰。数据分析模块：从“原始数据”到“决策支持”的信息挖掘人工智能与机器学习驱动决策人工智能技术在HTS数据分析中发挥着越来越重要的作用。例如，使用“随机森林”算法筛选影响“相似性”的关键质量属性（如糖基化修饰、电荷变异体），或“深度学习”模型预测候选分子的临床风险（如免疫原性）。在我们最近的一个抗PD-L1单抗类似药项目中，通过训练集（100个已知相似性的候选分子）训练“卷积神经网络（CNN）”，实现对候选分子肽图谱、电荷变异体、生物学活性的多维度相似性预测，准确率达92%，较传统方法效率提升3倍。05高通量筛选在生物类似药研发全流程中的具体应用高通量筛选在生物类似药研发全流程中的具体应用HTS并非孤立的技术，而是贯穿生物类似药研发全流程的“主线”。从靶点验证到临床申报，每个阶段均有HTS的用武之地。结合我多年的实践经验，本部分将按“靶点验证-候选分子筛选-质量属性分析-工艺优化-临床前评价”五个阶段，详细阐述HTS的应用场景与技术要点。靶点验证阶段：HTS加速“靶点-药物”关联性确认靶点验证是生物类似药研发的起点，需确认“靶点与疾病的关联性”“靶点成药性”以及“原研药的作用机制”。HTS通过高通量基因编辑、高通量表型筛选等技术，可快速验证靶点，降低研发风险。靶点验证阶段：HTS加速“靶点-药物”关联性确认高通量基因编辑筛选在单抗类似药靶点验证中，需确认靶点蛋白（如HER2、PD-1）在疾病发生中的关键作用。CRISPR-Cas9高通量基因编辑技术可通过构建sgRNA文库，对细胞基因组的靶点基因进行敲除或敲入，通过高通量表型检测（如细胞增殖、凋亡）验证靶点功能。例如，在验证EGFR靶点时，我们构建了包含10^5个sgRNA的文库，转染A449细胞（非小细胞肺癌细胞系）后，使用CellTiter-Glo®检测细胞活性，通过“MAGeCK”算法分析sgRNA富集情况，发现EGFR敲除后细胞活性降低70%，证实EGFR是该药物的关键靶点。靶点验证阶段：HTS加速“靶点-药物”关联性确认高通量表型筛选对于复杂疾病（如自身免疫性疾病），靶点的作用机制尚不明确，需通过高通量表型筛选发现“表型-靶点”关联。例如，在TNF-α单抗类似药靶点验证中，我们使用THP-1细胞（人单核细胞系）模型，通过LPS诱导炎症因子（IL-6、TNF-α）释放，使用HT-ELISA检测炎症因子水平，筛选出可显著抑制TNF-α释放的候选靶点，为后续药物研发提供方向。候选分子筛选阶段：HTS锁定“高相似性”分子候选分子筛选是生物类似药研发的核心环节，需从海量分子中筛选出“结构-功能-安全”与原研药高度相似的候选分子。HTS通过“多轮筛选-逐级淘汰”策略，可快速锁定优质候选分子。1.初筛：广度覆盖，快速排除初筛的目标是从10^6-10^8个候选分子中排除“低相似性”分子，保留“潜在高相似性”分子（占比约0.1%-1%）。筛选指标以“关键质量属性”为主，如抗原结合活性、分子量、纯度。例如，在抗HER2单抗类似药初筛中，我们使用HT-ELISA检测候选分子的抗原结合活性（EC50），设定筛选阈值为“EC50值与原研药偏差<20%”，仅用2周时间就从10^7个CHO细胞克隆中筛选出10^5个阳性克隆。候选分子筛选阶段：HTS锁定“高相似性”分子复筛：深度表征，逐级淘汰复筛的目标是对初筛阳性分子进行多维度质量属性分析，进一步筛选至“高相似性候选分子”（占比约0.01%-0.1%）。筛选指标涵盖“结构-功能-安全”全维度，如高级结构（CD光谱）、翻译后修饰（糖基化、电荷变异体）、生物学功能（ADCC、CDC）、免疫原性（T细胞活化）。例如，在抗PD-1单抗类似药复筛中，我们采用“三步筛选法”：-第一步：HT-SPR检测亲和力（KD<1nM），筛选出10^3个候选分子；-第二步：MALDI-TOFMS检测分子量（偏差<0.1%）、HPLC检测电荷变异体（偏差<5%），筛选出100个候选分子；-第三步：HT-FACS检测ADCC效应（EC50与原研药偏差<10%）、T细胞活化实验（IFN-γ释放量与原研药偏差<15%），最终筛选出5个高相似性候选分子。候选分子筛选阶段：HTS锁定“高相似性”分子竞争性筛选：模拟生理条件，提升临床相关性传统筛选多在“缓冲液体系”中进行，与生理环境（如血清、pH波动）存在差异，可能导致筛选出的候选分子在体内活性与原研药不一致。竞争性筛选通过在模拟生理条件下（如含10%FBS的培养基、pH7.4）进行筛选，提升候选分子的临床相关性。例如，在抗IL-6R单抗类似药筛选中，我们在含10%FBS的培养基中加入IL-6（10ng/mL），使用HT-ELISA检测候选分子与IL-6R的结合能力，筛选出的候选分子在体内的PK/PD特性与原研药高度一致（AUC偏差<10%）。质量属性分析阶段：HTS实现“全维度相似性”评价质量属性分析是证明生物类似药“相似性”的核心环节，需对候选分子与原研药的质量属性进行全面比对。HTS通过高通量、高灵敏度的检测技术，可快速完成多维度质量属性的表征。质量属性分析阶段：HTS实现“全维度相似性”评价结构属性分析-一级结构：使用MALDI-TOFMS测定分子量，偏差需<0.1%；使用肽图谱分析（LC-MS/MS），肽段覆盖率需>95%，且修饰位点需与原研药一致。-高级结构：使用CD光谱测定二级结构（α-螺旋含量偏差<5%），使用荧光光谱测定三级结构（最大发射波长偏差<2nm），使用SEC-MALS（体积排阻色谱-多角度激光散射）测定分子量与聚体含量（聚体偏差<5%）。质量属性分析阶段：HTS实现“全维度相似性”评价翻译后修饰分析翻译后修饰是生物药质量属性差异的主要来源，HTS通过高分辨率质谱与高通量样本制备技术，可实现修饰位点的精确定量。例如，在单抗类似药的N-糖基化分析中，我们使用“PNGaseF酶解-HILIC-UPLC-MS/MS”技术，可同时测定G0F、G1F、G2F等主要糖型的含量，与原研药的偏差需<10%；对于低丰度糖型（如高甘露糖型），使用PRM（平行反应监测）模式进行定量，检测限可达0.1%。质量属性分析阶段：HTS实现“全维度相似性”评价生物学功能分析03-ADCC效应：使用PBMC（外周血单个核细胞）作为效应细胞，HT-FACS检测靶细胞