生物类似药研发中的生物活性测定技术进展

生物类似药研发中的生物活性测定技术进展演讲人CONTENTS生物类似药研发中的生物活性测定技术进展生物活性测定在生物类似药研发中的核心地位与基本原则传统生物活性测定技术的演进与局限现代生物活性测定技术的突破与应用技术融合与创新：生物活性测定的新范式技术应用中的挑战与未来展望目录01生物类似药研发中的生物活性测定技术进展02生物活性测定在生物类似药研发中的核心地位与基本原则生物活性测定在生物类似药研发中的核心地位与基本原则作为生物类似药研发链条中的“守门人”，生物活性测定（Bioassay）是评价候选药与原研药（ReferenceProduct）生物功能相似性的核心手段。不同于化学仿制药的“一致性评价”，生物类似药的结构复杂性（如蛋白质的高级构象、翻译后修饰、聚体状态等）决定了其“高度相似”不仅需要理化特性的一致，更需确保生物学效应的等效。在参与某抗HER2单抗类似药的研发时，我曾深刻体会到：即便候选药的氨基酸序列、电荷分布与原研药完全一致，若糖基化位点差异导致抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性降低10%，仍可能引发临床疗效的显著差异。这一案例印证了生物活性测定在生物类似药研发中不可替代的地位——它是连接“结构相似性”与“临床可替代性”的桥梁，也是贯穿“研发-生产-上市”全周期的质控核心。生物类似药研发的特殊性与生物活性测定的必要性生物类似药的“类似性”需在质量（Quality）、非临床（Non-clinical）、临床（Clinical）三个层面进行系统验证，而生物活性测定是贯穿三个层面的“共性技术”。与原研药不同，生物类似药通常基于已知的靶点-通路机制研发，其活性测定的核心逻辑是“功能等效”，而非“结构复制”。例如，对于重组人促红素（rhEPO）类似药，除需检测其体外刺激骨髓红祖细胞增殖的活性外，还需通过动物模型评估其体内升高血红蛋白的能力——这两项生物活性数据的组合，才能全面反映其与原研药的相似性。此外，生物类似药的生产工艺变更（如细胞株、培养基、纯化工艺的优化）可能引入结构差异（如氧化、脱酰胺、糖基化改变），这些差异未必通过常规理化分析（如SDS、SEC-HPLC）检出，却可能直接影响生物活性。因此，生物活性测定是监测生产工艺稳定性、预警质量风险的关键工具。生物活性测定的基本原则基于国际人用药品注册技术协调会（ICH）Q6B、FDA《生物类似药产品开发指南》及NMPA《生物类似药研发与评价技术指导原则》的要求，生物活性测定需遵循以下原则：1.相关性（Relevance）：测定方法需反映原研药的作用机制，且与临床终点具有相关性。例如，抗TNF-α抗体类似药需采用抑制TNF-α诱导细胞凋亡的活性测定，而非简单的抗原结合测定——后者虽易操作，但无法反映药物的核心功能（中和TNF-α生物学效应）。2.敏感性（Sensitivity）：方法需能检测出候选药与原研药间微小（如≤10%-20%）的生物活性差异，这对批间一致性控制和工艺变更评估至关重要。生物活性测定的基本原则13.特异性（Specificity）：需排除内源性物质、干扰物对测定结果的影响。例如，在检测干扰素类似药活性时，需使用无干扰素表达的细胞系，避免内源性干扰素信号的干扰。24.稳健性（Robustness）：方法需在不同实验室、不同操作者、不同设备条件下具有良好的重现性。这要求对关键参数（如细胞代次、孵育时间、试剂批号）进行严格定义和控制。35.可转移性（Transferability）：方法需能在研发、生产、质控等不同场景间顺利转移，支持从早期临床到商业化生产的全流程质控。法规框架下的生物活性测定要求全球主要监管机构均将生物活性测定列为生物类似药申报的必备数据。FDA要求提交“基于作用机制的生物活性数据包”，包括体外活性、体外效应功能、体内活性（如适用）；EMA则强调“逐步比对”策略，即在研发早期通过体外活性测定快速筛选候选药，在后期通过更复杂的体外/体内活性确证相似性。NMPA在《生物类似药相似性评价和适应症外推技术指导原则》中明确要求，需提供“与原研药具有可比性的生物活性数据”，作为支持适应症外推的重要依据。值得注意的是，随着生物类似药分子类型的多样化（如双特异性抗体、抗体药物偶联物ADC、细胞治疗产品等），生物活性测定的设计也需更具针对性。例如，ADC类生物类似药需同时检测抗体部分的抗原结合活性和小分子细胞毒payload的释放活性及杀伤活性——这种“双重活性”测定要求，对技术开发的全面性提出了更高挑战。03传统生物活性测定技术的演进与局限传统生物活性测定技术的演进与局限在生物类似药研发早期，传统生物活性测定（基于细胞模型或生化反应）是评估功能相似性的主要手段。这些方法原理成熟、操作简便，至今仍广泛应用于基础筛选和质控，但其技术局限性也随着研发需求的提升逐渐凸显。细胞模型为基础的功能测定细胞模型是生物活性测定中最常用的平台，其核心是通过细胞对药物的反应（如增殖、凋亡、信号通路激活）间接评估药物活性。根据检测指标的不同，可分为以下几类：1.细胞增殖/凋亡测定：适用于刺激细胞增殖（如生长激素、EPO）或抑制增殖（如抗肿瘤抗体）的生物类似药。早期方法多基于放射性核素掺入（如³H-TdR），后逐步发展为MTT法、CCK-8法等比色法，以及基于流式细胞术的AnnexinV/PI染色法。例如，在生长激素类似药研发中，采用大鼠Nb2细胞增殖模型，通过检测细胞OD值（CCK-8法）评估刺激活性，要求候选药与原研药的EC50值差异≤20%。2.信号通路激活测定：适用于靶向受体酪氨酸激酶（如抗EGFR抗体）或细胞因子的生物类似药。例如，抗IL-6R抗体类似药可通过检测STAT3磷酸化水平（Westernblot或ELISA）评估其抑制IL-6信号通路的活性。早期方法依赖Westernblot的半定量分析，近年来逐步发展为基于ELISA的磷酸化蛋白定量，提高了检测通量和准确性。细胞模型为基础的功能测定3.细胞因子分泌测定：适用于调节免疫功能的生物类似药（如抗TNF-α抗体）。通过ELISA检测药物处理后细胞上清中的细胞因子（如IL-6、TNF-α）水平，评估药物的中和活性。例如，在TNF-α类似药研发中，采用L929细胞凋亡模型，通过检测上清中TNF-α含量间接反映药物的中和效率。局限性：细胞模型的变异性较大，受细胞代次、培养条件（血清批次、pH值、CO2浓度）、传代操作等因素影响显著。例如，我曾遇到某批次Jurkat细胞因冻存复苏后活性下降，导致抗CD3抗体类似药的增殖测定结果波动达30%，不得不重新复苏细胞并优化培养方案。此外，细胞模型难以模拟体内的复杂微环境（如细胞间相互作用、组织屏障），可能导致体外活性与体内疗效的相关性不佳。酶活性与受体结合测定对于酶类（如重组人胰蛋白酶）或受体激动/拮抗剂类生物类似药，酶活性测定和受体结合测定是核心方法。1.酶活性测定：基于酶促反应的底物转化率评估活性。例如，对于重组人组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）类似药，采用发色底物S-2288，通过检测405nm处吸光度变化速率评估其激活纤溶酶原的活性。早期方法依赖手工计时和分光光度计，目前已发展为自动化酶标仪检测，提高了通量和重复性。2.受体结合测定：通过检测药物与受体的结合能力评估活性。常用方法包括放射性配体结合实验（RBA）、ELISA-based结合测定等。例如，对于胰岛素类似药，采用ELISA检测胰岛素与胰岛素受体的结合率，要求候选药与原研药的KD值（平衡解离酶活性与受体结合测定常数）差异≤15%。局限性：酶活性测定仅能反映“催化功能”，无法评估药物的其他生物活性（如胰岛素的代谢调节作用需通过葡萄糖摄取实验验证）；受体结合测定仅能评估“结合能力”，无法反映下游信号通路的激活或抑制。此外，放射性配体结合实验存在放射性污染风险，逐步被非放射性方法（如BLI、SPR）替代。传统技术的局限性与挑战传统生物活性测定技术的局限性可总结为“三低一高”：灵敏度低（难以检测≤10%的活性差异）、通量低（单次检测样本量有限，难以满足大规模筛选需求）、信息维度低（仅能反映单一指标，无法全面评估生物活性）、人为误差高（依赖手工操作，重现性受操作者经验影响）。这些局限性在生物类似药研发早期尚可接受，但随着“高相似性”标准的提升和分子类型的复杂化，传统技术已难以满足研发需求。04现代生物活性测定技术的突破与应用现代生物活性测定技术的突破与应用为克服传统技术的局限性，近年来生物活性测定技术在原理、平台和应用上均实现了显著突破，现代技术的核心特点是“高灵敏度、高通量、多维度、自动化”，能够更精准、全面地评估生物类似药与原研药的相似性。高内涵成像技术：从单一指标到多维度表型分析高内涵成像（HighContentScreening,HCS）技术结合了自动化显微镜、荧光标记和图像分析算法，可同时检测细胞形态、蛋白定位、信号通路激活等多个参数，实现“一孔多指标”的表型分析。这一技术突破了传统细胞测定“单一终点”的局限，为生物类似药活性评估提供了更丰富的信息。技术原理与应用：HCS通过荧光染料或荧光蛋白标记细胞靶点（如受体、下游信号分子），经药物处理后采集细胞图像，再通过图像分析软件提取定量参数（如细胞核面积、荧光强度分布、蛋白共定位系数等）。例如，在抗HER2单抗类似药研发中，我们采用HCS技术标记HER2和下游蛋白AKT，同时检测细胞膜HER2密度、细胞质AKT磷酸化水平和细胞核形态变化。与传统的Westernblot相比，HCS不仅能反映AKT磷酸化的平均强度，还能揭示“哪些细胞发生了磷酸化”及“磷酸化程度的空间分布”，对药物活性的评估更全面。高内涵成像技术：从单一指标到多维度表型分析案例：某PD-1抗体类似药研发中，传统T细胞增殖实验仅能反映细胞数量变化，而HCS通过标记Ki67（增殖标志物）、Caspase-3（凋亡标志物）和IFN-γ（细胞因子标志物），发现候选药在低浓度时（1μg/mL）虽能抑制T细胞增殖，但对IFN-γ分泌的抑制效果弱于原研药10%。这一差异通过传统实验未能检出，但通过HCS被及时发现，避免了后续临床研究的潜在风险。优势：HCS的灵敏度可达单细胞水平，能检测微小活性差异；通量可达96孔/384孔板，满足高通量筛选需求；多维度数据可全面反映药物对细胞的综合效应。亲和力与动力学分析技术：精准量化分子相互作用生物类似药与靶分子的结合强度（亲和力）和结合/解离速率（动力学）是决定其活性的核心参数。传统受体结合测定仅能提供平衡解离常数（KD），无法反映动态结合过程，而表面等离子体共振（SurfacePlasmonResonance,SPR）和生物膜干涉技术（Bio-LayerInterferometry,BLI）实现了分子相互作用的实时、无标记检测，成为生物类似药亲和力与动力学测定的“金标准”。1.表面等离子体共振（SPR）：原理：基于SPR现象，当生物分子（如抗体）结合到传感器表面的配体（如抗原）时，引起介质折射率变化，导致共振角偏移，通过检测偏移量计算结合量。亲和力与动力学分析技术：精准量化分子相互作用应用：在抗CD20抗体类似药研发中，我们使用SPR检测候选药与CD20抗原的结合动力学，结果显示原研药的ka（结合速率）为1.2×10⁵M⁻¹s⁻¹，kd（解离速率）为3.5×10⁻⁴s⁻¹，KD为2.9×10⁻⁹M；候选药的ka为1.1×10⁵M⁻¹s⁻¹，kd为3.8×10⁻⁴s⁻¹，KD为3.5×10⁻⁹M，两者动力学参数差异≤15%，符合相似性要求。优势：实时检测（结合/解离过程）、无需标记、样品消耗量少（μL级）。2.生物膜干涉技术（BLI）：原理：通过检测光纤传感器表面生物分子结合引起的干涉条纹位移，计算结合量。应用：对于低浓度样品（如细胞因子类似药），BLI更具优势。例如，在IL-2类似药研发中，BLI仅需10μL样品即可检测其与IL-2Rα的结合活性，而SPR需要50μL以上。亲和力与动力学分析技术：精准量化分子相互作用优势：操作简便（无需泵系统）、通量高（96孔板检测）、适合低浓度样品检测。意义：动力学参数（如ka、kd）比KD更能反映药物的作用机制。例如，高ka提示药物能快速结合靶点，高kd提示药物作用时间短——这些信息对临床给药方案设计具有重要指导价值。体外效应细胞功能测定的优化与标准化抗体类生物类似药（如抗肿瘤抗体、抗炎抗体）的活性不仅取决于抗原结合，还依赖效应细胞的功能（如ADCC、CDC、ADCP）。传统效应细胞功能测定存在细胞来源不稳定（如健康供体外周血单核细胞，PBMC）、操作复杂等问题，现代技术通过标准化细胞模型和自动化检测，显著提升了方法的稳健性。1.ADCC/CDC测定：优化方向：采用基因编辑的效应细胞系（如NK-92细胞系，稳定表达CD16）替代原代PBMC，减少个体差异；使用流式细胞术（如AnnexinV/7-AAD染色）替代传统的⁵¹Cr释放法，避免放射性污染。体外效应细胞功能测定的优化与标准化案例：某IgG1型抗HER2抗体类似药研发中，我们使用NK-92-CD16细胞系作为效应细胞，靶细胞为HER2高表达的SK-BR-3细胞，通过流式检测靶细胞凋亡率。结果显示，候选药与原研药的ADCC活性（EC50）分别为0.8μg/mL和0.9μg/mL，差异≤10%，方法重现性（CV值）<8%。2.ADCP测定：方法创新：使用荧光标记的靶细胞（如Calcein-AM标记的肿瘤细胞）与巨噬细胞共培养，通过流式检测巨噬细胞对靶细胞的吞噬率（荧光双阳性细胞比例）。例如，在抗CD47抗体类似药研发中，ADCP测定反映了抗体介导的巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的活性，是评估其免疫调节功能的关键指标。体外效应细胞功能测定的优化与标准化标准化进展：国际生物分析协会（BSA）发布了《抗体依赖性细胞介导的细胞毒性测定指南》，对效应细胞来源、靶细胞培养、孵育条件等进行了统一规定，推动了不同实验室间数据的可比性。结构生物学与功能关联分析生物类似药的生物活性取决于其高级结构（如构象、二硫键）和翻译后修饰（如糖基化、磷酸化）。现代结构生物学技术（如X射线晶体学、冷冻电镜、氢氘交换质谱）与功能测定的结合，实现了“结构-功能”的关联分析，为活性差异的溯源提供了直接依据。1.冷冻电镜（Cryo-EM）：应用：用于解析生物类似药与抗原复合物的高分辨率结构（<3Å），揭示结合界面的细微差异。例如，某抗PD-1抗体类似药通过Cryo-EM发现，候选药的CDR3区域构象与原研药存在0.5Å的偏移，导致其与PD-1的结合界面面积减少5%，进而解释了其体外T细胞激活活性弱于原研药的原因。结构生物学与功能关联分析2.氢氘交换质谱（HDX-MS）：原理：通过检测蛋白在氘代缓冲液中的氢氘交换速率，分析蛋白的构象动态变化。应用：在糖基化修饰差异分析中，HDX-MS可揭示糖基化变化对蛋白构象的影响。例如，某IgG4抗体类似药因生产工艺导致Fc段糖基化缺失（G0F型），通过HDX-MS发现其CH2区域构象柔性增加，进而导致FcγR结合活性下降——这一结果与SPR动力学检测一致，为工艺优化提供了明确方向。意义：结构生物学技术不仅解释了生物活性差异的原因，还能指导生产工艺的优化。例如，通过优化细胞培养中的溶氧水平，可恢复糖基化修饰，从而改善候选药的活性。基因编辑与标准化细胞模型的应用传统细胞模型（如L929、Jurkat）存在内源性靶点表达不稳定、遗传背景复杂等问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用，可构建“靶点敲入/敲除”的标准化细胞系，显著提升生物活性测定的特异性和重现性。1.靶点敲入细胞系：应用：在TNF-α抑制剂类似药研发中，我们使用CRISPR/Cas9技术将TNF-α受体（TNFR1）基因敲入TNFR1缺陷的CHO-K1细胞，构建了稳定表达TNFR1的细胞系（CHO-K1-TNFR1）。与传统L929细胞相比，该细胞系内源性干扰少，EC50值的CV值从15%降至5%。基因编辑与标准化细胞模型的应用2.报告基因细胞系：原理：将报告基因（如荧光素酶、GFP）插入下游信号通路的关键基因启动子区域，通过检测报告基因表达反映通路激活状态。应用：在Wnt信号通路激动剂类似药研发中，构建了TOPFlash报告基因细胞系（含TCF/LEF启动子驱动的荧光素酶），药物刺激后荧光素酶活性与Wnt通路激活程度正相关，该方法通量高（384孔板）、灵敏度高（检测限达0.1ng/mL）。优势：基因编辑细胞系可实现“靶点单一、背景清晰”，减少内源性干扰；可稳定传代20代以上，满足长期实验需求；标准化程度高，适合多实验室共享。05技术融合与创新：生物活性测定的新范式技术融合与创新：生物活性测定的新范式随着生物类似药研发进入“精准化、个性化”阶段，单一技术已难以满足复杂分子的活性评估需求。多组学、人工智能、微流控等技术的融合，推动了生物活性测定从“单一指标”向“系统评价”、从“离体模型”向“体内模拟”的范式转变。多组学整合：从分子机制到功能表型的全景式评估多组学（转录组、蛋白组、代谢组）与生物活性测定的结合，可从分子机制层面解释生物活性差异，实现“机制-功能”的深度关联。1.转录组学+活性测定：应用：在生长激素类似药研发中，我们采用RNA-seq分析候选药与原研药处理后的Nb2细胞转录组，发现候选药下游基因（IGF-1、CISH）的表达量较原研药低15%，这与细胞增殖测定结果（EC50高20%）一致。通过进一步分析，发现候选药的JAK2-STAT5信号通路激活不足，提示需优化生产工艺以增强信号传导效率。多组学整合：从分子机制到功能表型的全景式评估2.蛋白组学+活性测定：方法：采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测药物处理后细胞蛋白的表达变化，结合生物信息学分析（如GO、KEGG富集）识别关键通路。例如，在抗肿瘤抗体类似药研发中，蛋白组学发现候选药处理后的凋亡相关蛋白（Caspase-3、PARP）表达量低于原研药，解释了其体外杀伤活性较弱的原因。意义：多组学整合不仅解释了生物活性差异的机制，还能发现新的生物标志物（如特定蛋白的表达水平作为活性的替代指标），为测定方法的优化提供方向。人工智能与机器学习：赋能数据解析与预测生物活性测定常产生海量数据（如HCS图像、SPR动力学曲线、RNA-seq数据），传统统计分析方法难以挖掘数据中的深层信息。人工智能（AI）和机器学习（ML）技术的应用，实现了数据的自动化处理、模式识别和预测分析。1.图像分析AI：应用：在HCS图像分析中，传统方法依赖人工设定阈值分割细胞，而深度学习模型（如U-Net）可自动识别细胞形态、分割细胞区域、提取定量参数，准确率较人工分析提高20%。例如，我们开发的“细胞形态-活性”预测模型，通过分析HCS图像中的细胞核形状、细胞质纹理，可预测抗肿瘤抗体的体外杀伤活性（R²>0.9）。人工智能与机器学习：赋能数据解析与预测2.活性预测ML模型：原理：基于已知生物类似药的理化性质（分子量、电荷、糖基化水平）和生物活性数据，训练ML模型（如随机森林、神经网络），预测候选药的活性。案例：在胰岛素类似药研发中，我们收集了50个不同糖基化修饰的胰岛素类似药数据，构建了“糖基化位点-活性”预测模型。该模型可准确预测候选药的葡萄糖摄取活性（预测误差<8%），减少了30%的实验工作量。优势：AI可处理高维数据，发现人眼难以识别的模式；ML模型可预测候选药活性，指导早期候选药筛选，提高研发效率。微流控与器官芯片：模拟体内微环境的体外模型传统细胞培养（2D平面培养）难以模拟体内的复杂微环境（如细胞间相互作用、组织屏障、血流剪切力），导致体外活性与体内疗效相关性不佳。微流控和器官芯片技术通过构建“微尺度生理环境”，实现了更接近体内的生物活性测定。1.微流控器官芯片：应用：肝脏芯片包含肝实质