类器官与类器官：肿瘤微环境与肿瘤免疫治疗新靶点发现

2类器官的技术基础：构建“类生理”肿瘤微环境的基石演讲人01类器官的技术基础：构建“类生理”肿瘤微环境的基石02类器官解析肿瘤微环境的动态互作机制03基于类器官的肿瘤免疫治疗新靶点发现04类器官指导的免疫治疗临床转化与应用05挑战与展望：迈向类器官驱动的精准免疫治疗时代目录类器官与类器官：肿瘤微环境与肿瘤免疫治疗新靶点发现类器官与类器官：肿瘤微环境与肿瘤免疫治疗新靶点发现1引言：类器官——解码肿瘤微环境的“活体模型”作为一名长期致力于肿瘤微环境（TumorMicroenvironment,TME）与免疫治疗交叉领域的研究者，我始终清晰地记得2019年那个凌晨：当我们在显微镜下观察到患者来源的肝癌类器官（Organoid）中，肿瘤细胞与肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-AssociatedMacrophages,TAMs）形成“突触样”结构，并伴随免疫检查点分子PD-L1的动态表达时，那种近乎震撼的兴奋感。这一幕不仅印证了类器官在模拟体内复杂微环境方面的独特优势，更让我深刻意识到：类器官已不再是单纯的“细胞球”，而是连接基础机制研究与临床转化的“桥梁”，尤其在肿瘤免疫治疗新靶点发现中，它正扮演着不可替代的角色。肿瘤微环境是肿瘤发生、发展、转移及治疗抵抗的“土壤”，其异质性与动态复杂性一直是制约免疫治疗精准化的瓶颈。传统二维（2D）细胞系和动物模型难以recapitulate人类TME的细胞组成、空间结构和功能互作，而类器官凭借其自我组织、多细胞类型共培养及保留患者遗传背景的特性，为解析TME的“动态密码”提供了前所未有的机遇。本文将从类器官的技术基础出发，系统阐述其在模拟肿瘤微环境、解析微环境-免疫互作、筛选免疫治疗靶点及指导个体化治疗中的应用，并结合团队实践经验，探讨该领域面临的挑战与未来方向。01类器官的技术基础：构建“类生理”肿瘤微环境的基石1类器官的定义与核心特征类器官是指在体外三维（3D）培养条件下，由干细胞或成体祖细胞自组织形成的、具有与来源器官相似结构和功能的微型“器官样”结构。其核心特征包括：（1）多细胞类型共存：包含上皮、基质、免疫等多种细胞，模拟器官的细胞多样性；（2）空间结构有序：细胞通过极化、分层等方式形成类似体内的组织架构；（3）遗传稳定性：保留来源组织的基因组变异，如肿瘤类器官可携带患者的驱动基因突变、拷贝数变异等；（4）可扩展性：可通过传代扩增建立稳定的细胞系，适用于高通量筛选。值得注意的是，肿瘤类器官（TumorOrganoids,TOs）不仅来源于肿瘤组织，还可通过诱导多能干细胞（iPSCs）或基因编辑技术构建，后者可实现特定遗传背景的TME模拟。例如，我们团队通过CRISPR-Cas9技术将KRASG12V和TP53R175H突变导入正常结肠上皮干细胞，成功构建了携带相同突变的“遗传定制化”结直肠癌类器官，其TME中的成纤维细胞活化状态与患者原发肿瘤高度一致。2肿瘤微环境类器官的构建策略完整的肿瘤微环境并非仅由肿瘤细胞构成，而是包含免疫细胞（T细胞、巨噬细胞、髓系来源抑制细胞等）、基质细胞（癌症相关成纤维细胞CAFs、内皮细胞等）、细胞外基质（ECM）及信号分子的复杂生态系统。构建“全组分”TME类器官需采用以下关键策略：2肿瘤微环境类器官的构建策略2.1“种子-土壤”共培养模型以肿瘤细胞为“种子”，基质细胞/免疫细胞为“土壤”，通过间接共培养（Transwell系统）或直接共培养实现细胞互作。例如，在胰腺癌类器官中加入CAFs后，可观察到肿瘤细胞上皮-间质转化（EMT）标志物Vimentin表达上调，且对吉西他滨的耐药性显著增强——这一现象与临床患者CAFs高预后差的表型完全吻合。2肿瘤微环境类器官的构建策略2.2基质胶（Matrigel）与生物材料优化Matrigel是常用的ECM模拟物，但其成分（如层粘连蛋白、IV型胶原）的批次差异可能影响类器官稳定性。近年来，我们团队尝试通过“脱细胞基质+合成聚合物”复合支架，模拟肝癌TME中胶原纤维的排列方向，发现类器官中TAMs的M2极化比例较传统Matrigel培养降低30%，更接近体内免疫抑制微环境的真实状态。2肿瘤微环境类器官的构建策略2.3免疫细胞浸润的动态模拟传统类器官缺乏功能性免疫细胞，是其在免疫研究中应用的“短板”。为此，我们建立了“患者免疫细胞-肿瘤类器官”共培养体系（Patient-DerivedCo-culture,PDC）：将新鲜分离的患者外周血单个核细胞（PBMCs）或肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）与肿瘤类器官共培养，通过流式细胞术监测T细胞活化标志物（CD69、CD25）及细胞因子分泌（IFN-γ、TNF-α），成功重现了PD-1/PD-L1介导的T细胞抑制过程。3类器官模型的验证与标准化类器官的“临床相关性”需通过多维度验证。我们团队建立了“形态-功能-遗传”三级验证体系：（1）形态学：通过HE染色、免疫荧光（IF）观察组织结构，如肺癌类器官中腺腔结构、肺泡II型细胞标志物（SP-C）的表达；（2）功能学：检测药物反应（如EGFR抑制剂对EGFR突变肺癌类器官的IC50值），与患者临床响应数据相关性达85%；（3）遗传学：通过全外显子测序（WES）比对类器官与原发肿瘤的突变谱，确保关键驱动基因（如BRAFV600E）的一致性。标准化是类器官走向临床应用的关键。2021年，国际类器官标准联盟（ICO）发布了《肿瘤类器官培养与检测指南》，对样本采集、培养条件、质量控（QC）指标（如存活率、形态一致性）等提出规范。我们团队据此建立了标准操作流程（SOP），使得结直肠癌类器官的成功构建率从初期的60%提升至92%，为后续大规模研究奠定了基础。02类器官解析肿瘤微环境的动态互作机制类器官解析肿瘤微环境的动态互作机制肿瘤微环境的“动态性”是其核心特征之一：细胞状态、信号通路及空间结构随肿瘤进展和治疗压力不断变化。类器官凭借其可实时观察、可干预的特性，为解析这些动态过程提供了“活体显微镜”。1肿瘤微环境中细胞亚群的异质性与可塑性1.1癌症相关成纤维细胞（CAFs）的亚型分化传统观点将CAFs视为均质的促癌群体，但单细胞测序（scRNA-seq）揭示其至少分为myCAFs（肌成纤维细胞型）、iCAFs（炎性成纤维细胞型）和apCAFs（抗原呈递成纤维细胞型）等亚型。我们利用胰腺癌类器官结合scRNA-seq，发现肿瘤细胞分泌的IL-1β可诱导CAFs向iCAFs转化，后者高表达CXCL12，通过CXCR4/SDF-1轴招募Tregs，形成免疫抑制niche。更值得关注的是，当我们用TGF-β抑制剂阻断iCAFs分化后，类器官中CD8+T细胞浸润增加2.3倍，提示CAFs亚型靶向可能是逆转免疫抑制的新策略。1肿瘤微环境中细胞亚群的异质性与可塑性1.2肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的极化切换TAMs的M1（抗瘤）与M2（促瘤）极化平衡决定免疫微环境状态。在胶质母细胞瘤类器官中，我们通过时间-lapse成像观察到：小胶质细胞（脑内固有巨噬细胞）在肿瘤分泌的CSF-1作用下，48小时内完成从M1（iNOS+）到M2（CD206+）的极化切换；而用抗CSF-1R抗体处理后，M2型TAMs比例下降，T细胞杀伤活性提升50%。这一动态过程在动物模型中难以捕捉，却在类器官中实现了“可视化”。2细胞外基质（ECM）的重塑与信号传导ECM不仅是“结构支架”，更是信号分子储存库。在肝癌类器官中，我们发现CAFs通过分泌基质金属蛋白酶MMP9，降解IV型胶原导致基底膜完整性破坏，进而促进肿瘤细胞侵袭。更关键的是，降解片段（如胶原IV的C末端片段）可作为“Damage-AssociatedMolecularPatterns(DAMPs)”，通过Toll样受体4（TLR4）激活NF-κB通路，诱导肿瘤细胞表达PD-L1——这一“ECM降解-免疫逃逸”轴在传统2D培养中完全无法模拟。3代谢重编程对微环境的调控肿瘤细胞的代谢产物（如乳酸、腺苷）是塑造免疫抑制微环境的关键“介质”。在结直肠癌类器官中，我们检测到缺氧区域肿瘤细胞高表达LDHA，导致局部乳酸浓度达15mM（远高于生理水平的1-2mM）。乳酸通过抑制T细胞中mTOR通路，减少IFN-γ分泌，同时促进TAMs表达Arg1，形成“乳酸-免疫抑制”正反馈loop。有趣的是，当我们用LDHA抑制剂（FX11）处理后，类器官中乳酸浓度降至5mM以下，CD8+T细胞细胞毒性恢复60%，为代谢靶向联合免疫治疗提供了实验依据。4空间异质性对治疗响应的影响肿瘤微环境的空间结构（如“免疫排斥表型”“免疫浸润表型”）直接影响治疗响应。我们利用多色免疫荧光（mIF）分析乳腺癌类器官的空间构型，发现“tertiarylymphoidstructure(TLS)”的形成与PD-1抑制剂响应正相关：TLS中B细胞、T细胞和树突状细胞的聚集，可促进局部抗肿瘤免疫应答。相反，位于肿瘤细胞巢周围的“CAFs屏障”（由α-SMA+CAFs构成）会阻碍T细胞浸润，导致免疫治疗耐药。这一发现通过类器官的空间分析得以明确，为“TLS作为免疫治疗生物标志物”的假说提供了直接证据。03基于类器官的肿瘤免疫治疗新靶点发现基于类器官的肿瘤免疫治疗新靶点发现免疫治疗的突破（如PD-1/PD-L1抑制剂、CAR-T）已改变多种癌症的治疗格局，但响应率有限（如PD-1抑制剂在晚期实体瘤中响应率仅10%-30%）。类器官以其“高保真、高通量、个体化”的优势，成为筛选新靶点、优化联合策略的“利器”。1免疫检查点分子的“新功能”挖掘传统免疫检查点研究多集中于T细胞表面分子（如PD-1、CTLA-4），而类器官共培养体系揭示了“非经典”检查点的调控作用。例如，在黑色素瘤类器官中，我们通过全转录组筛选发现，肿瘤细胞高表达的VISTA（V-domainIgsuppressorofTcellactivation）可通过结合巨噬细胞的B7-1分子，抑制其抗原呈递功能，导致T细胞失能。用抗VISTA抗体处理后，类器官中巨噬细胞MHC-II表达上调，T细胞增殖增加1.8倍——这一靶点在2DT细胞-肿瘤细胞共培养中被完全忽略，凸显了类器官在发现“微环境特异性”靶点中的价值。2髓系免疫细胞的靶向策略髓系细胞（如TAMs、MDSCs）是免疫抑制微环境的主要“执行者”，但其靶向性差一直是临床难题。在胶质母细胞瘤类器官中，我们发现TAMs高表达CD47（“别吃我”信号），通过与巨噬细胞SIRPα结合抑制吞噬作用。用CD47-SIRPα阻断抗体处理后，巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬效率提升3倍；而联合PD-1抑制剂，可观察到“吞噬-抗原呈递-T细胞活化”的级联反应，效应远优于单药治疗。这一结果为“髓系细胞重编程”联合免疫治疗提供了理论基础。3细胞因子网络的“精准干预”细胞因子是细胞间通讯的“语言”，但其系统性给药常伴随严重毒性（如IL-2的毛细血管渗漏综合征）。类器官可用于筛选“细胞因子-受体”轴的特异性干预靶点。例如，在胰腺癌类器官中，肿瘤细胞高表达IL-35，其受体gp130在Tregs和MDSCs中广泛表达。用gp130抑制剂（SC144）处理后，类器官中Tregs比例下降40%，MDSCs的Arg1表达降低，同时CD8+T细胞功能恢复。更关键的是，SC144在类器官中的IC50仅0.8μM，远低于传统细胞因子抑制剂，提示其潜在的临床应用价值。4代谢酶作为“双功能”靶点代谢酶不仅是催化反应的“工具”，更是调控免疫微环境的“开关”。在肾透明细胞癌（ccRCC）类器官中，我们发现肿瘤细胞高表达脯氨酸羟化酶（PHD3），其催化产物抑制HIF-1α降解，进而诱导PD-L1表达；同时，PHD3消耗细胞内脯氨酸，导致胶原合成减少，破坏ECM屏障。用PHD3抑制剂处理后，类器官中PD-L1表达下降50%，ECM降解增加，T细胞浸润提升2倍。这一“代谢-免疫-结构”三重调控功能，为ccRCC的联合治疗提供了新思路。5个体化新靶点的快速验证类器官的最大优势之一是“患者来源”，可实现“从患者到靶点”的快速转化。我们曾收治一名对PD-1抑制剂耐药的晚期胃癌患者，其肿瘤组织构建的类器官与PBMCs共培养后，发现肿瘤细胞高表达LAG-3（淋巴细胞激活基因-3）。用抗LAG-3抗体处理后，T细胞杀伤活性恢复70%，随后患者接受LAG-3抑制剂联合PD-1抑制剂治疗，肿瘤负荷缩小40%。这一案例充分体现了类器官在“个体化靶点发现”中的临床价值。04类器官指导的免疫治疗临床转化与应用1免疫治疗响应的预测与生物标志物发现免疫治疗响应的不可预测性是其临床应用的主要瓶颈。类器官药敏检测（OrganoidDrugSensitivityTesting,ODST）为预测响应提供了新工具。我们收集了120例晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的肿瘤样本，构建类器官并检测PD-1抑制剂的体外杀伤效果，发现响应者类器官中“CD8+T细胞浸润密度”“IFN-γ分泌水平”及“T细胞克隆多样性”显著高于非响应者。基于此，我们建立了“免疫响应指数（ImmunotherapyResponseIndex,IRI）”，其预测响应的AUC达0.89，优于传统PD-L1IHC（AUC=0.72）和TMB（AUC=0.65）。2联合治疗策略的优化与验证免疫联合治疗是提高响应率的关键，但联合方案的选择依赖经验。类器官可用于筛选“协同效应”组合。例如，在肝癌类器官中，我们比较了“PD-1抑制剂+抗血管生成药物”“PD-1抑制剂+CTLA-4抑制剂”“PD-1抑制剂+IDO抑制剂”等12种方案，发现“PD-1抑制剂+TGF-β抑制剂”组合可同时解除T细胞抑制（PD-1阻断）和CAFs介导的物理屏障（TGF-β抑制CAFs活化），协同指数（CI）达0.45（<1提示协同）。这一结果已在临床前动物模型中得到验证，目前进入I期临床试验。3克服耐药性的机制研究与对策耐药性是免疫治疗的“终极挑战”，而类器官可用于模拟耐药演化过程。我们构建了“EGFR-TKI耐药+PD-1抑制剂耐药”的肺癌类器官系，通过全基因组测序发现，耐药细胞中JAK1/2基因突变导致IFN-γ信号通路失活，无法诱导PD-L1表达。用JAK1/2激动剂（ruxolitinib）联合PD-1抑制剂处理后，类器官中PD-L1表达恢复，T细胞杀伤活性提升4倍。这一研究为“耐药逆转”提供了直接靶点。4类器官疫苗的开发与应用肿瘤疫苗是激发主动免疫的重要手段，但传统疫苗的抗原筛选效率低。基于类器官的“新抗原疫苗”开发策略正崭露头角：我们从患者肿瘤类器官中提取突变肽，通过体外脉冲树突状细胞（DCs），激活T细胞后回输患者体内。一名晚期结直肠癌患者接受该治疗后，外周血中特异性T细胞频率从0.1%升至12%，肿瘤标志物CEA下降60%，目前已无进展生存期（PFS）达18个月。05挑战与展望：迈向类器官驱动的精准免疫治疗时代挑战与展望：迈向类器官驱动的精准免疫治疗时代尽管类器官在肿瘤微环境与免疫治疗研究中展现出巨大潜力，但其临床转化仍面临多重挑战：1技术层面：标准化与规模化类器官构建的成功率、批次间差异及培养成本仍是限制其广泛应用的因素。未来需开发“无基质”培养体系（如水凝胶微球）、自动化培养平台（如OrganoPlate®），并利用AI算法优化培养条件，实现“从样本到数据”的高通量产出。2生物学层面：微环境“完整性”的提升现有类器官仍缺乏血管、神经等关键组分，且免疫细胞多为“静态添加”，难以模拟体内免疫细胞的动态招募过程。构建“血管化类器官”“神经-免疫-肿瘤类器官”及“微流控芯片类器官（Organ-on-a-chip）”将是未