类器官与类器官：肿瘤微环境与肿瘤转移前微环境研究

1类器官技术：从基础生物学到肿瘤研究的跨越演讲人目录类器官技术面临的挑战与未来展望类器官模型在肿瘤转移前微环境（Pre-MN）研究中的应用类器官模型在肿瘤微环境（TME）研究中的应用类器官技术：从基础生物学到肿瘤研究的跨越总结与展望54321类器官与类器官：肿瘤微环境与肿瘤转移前微环境研究类器官与类器官：肿瘤微环境与肿瘤转移前微环境研究作为肿瘤生物学领域的研究者，我始终在寻找一种能同时还原肿瘤组织复杂性、反映患者个体差异，且能在体外稳定培养的研究模型。传统二维细胞系培养虽操作简便，却丢失了肿瘤的空间结构和细胞间相互作用；动物模型虽能模拟体内环境，却存在物种差异高、周期长、成本高等局限。直到类器官（Organoid）技术的出现——这种由干细胞或组织progenitor细胞在三维培养条件下自组织形成的、具有器官关键结构和功能的微型模型，为我们打开了一扇新的大门。尤其在肿瘤微环境（TumorMicroenvironment,TME）和肿瘤转移前微环境（Pre-metastaticNiche,Pre-MN）的研究中，类器官不仅重现了“肿瘤-微环境”的动态互作，更让我们得以在患者个体水平解析肿瘤转移的“种子-土壤”机制。本文将结合笔者在实验室中的实践与思考，系统阐述类器官技术在TME与Pre-MN研究中的核心价值、应用进展及未来挑战。01类器官技术：从基础生物学到肿瘤研究的跨越1类器官的定义与核心特征类器官（Organoid）是指在体外三维培养系统中，由干细胞、祖细胞或成体细胞通过自组织、自我分化形成的、模拟对应器官或组织部分结构与功能的微型三维结构。其核心特征可概括为三点：-细胞异质性：包含对应器官的主要细胞类型（如肠道类器官中的肠上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞、肠内分泌细胞等），且细胞比例可随培养条件动态调整；-三维自组织性：细胞在基质胶（如Matrigel）或水凝胶中通过细胞-细胞、细胞-基质相互作用，形成类似体内器官的极性结构（如肠类器官的隐窝-绒毛结构、肝类器官的胆管板结构）；-遗传与功能保守性：保留来源组织的遗传背景（如患者来源的肿瘤类器官，PDOs）和生理功能（如肠类器官的吸收、分泌功能，肝类器官的代谢功能）。23412类器官技术的发展历程类器官的概念源于干细胞生物学对“器官发生”机制的探索。2009年，HansClevers团队首次利用Lgr5+肠道干细胞成功构建出具有隐窝-绒毛结构的肠类器官，标志着类器官技术的正式诞生。此后，类器官培养体系迅速扩展至多个器官：-成体组织来源：胃、肝、胰腺、肺、肾、脑等器官的类器官均可通过成体干细胞或祖细胞诱导分化获得；-肿瘤来源：2011年，Clevers团队首次构建结直肠癌患者的来源类器官（PDOs），证实其保留了原发瘤的病理特征、基因突变谱和药物敏感性；-干细胞来源：诱导多能干细胞（iPSCs）可定向分化为心脏、脑、视网膜等类器官，为发育生物学和疾病建模提供了“发育中的模型”。3类器官在肿瘤研究中的独特优势相较于传统模型，类器官技术在肿瘤研究中展现出不可替代的优势：-患者个体化：PDOs直接来源于患者肿瘤组织，能忠实反映不同患者的肿瘤异质性（如分子分型、耐药机制），为精准医疗提供“患者替身”；-微环境可塑性：通过共培养基质细胞（如癌相关成纤维细胞，CAFs）、免疫细胞（如T细胞、巨噬细胞）或血管内皮细胞，可构建“肿瘤类器官-微环境”共培养体系，模拟TME的复杂性；-动态可观测性：活成像技术（如共聚焦显微镜、光片显微镜）可实时追踪类器官中肿瘤细胞的增殖、迁移及微环境细胞的重塑过程，弥补动物模型在动态观测上的不足；-高通量筛选：类器官体积小、培养周期短（通常1-2周），适合用于大规模药物筛选或基因编辑筛选（如CRISPR-Cas9筛选转移相关基因）。3类器官在肿瘤研究中的独特优势犹记笔者在博士期间首次构建结直肠癌PDOs的经历：将患者肿瘤组织消化成单细胞后，包埋于Matrigel中，加入含Wnt、R-spondin、Noggin等生长因子的培养基，仅7天后便在培养皿中观察到直径约200μm的类器官——其腺体结构与患者病理切片高度相似，且KRAS基因突变状态与原发瘤完全一致。这一刻，我深刻体会到类器官不仅是“培养的肿瘤”，更是“患者的缩影”。02类器官模型在肿瘤微环境（TME）研究中的应用类器官模型在肿瘤微环境（TME）研究中的应用肿瘤微环境是指肿瘤细胞所处的、由免疫细胞、基质细胞、细胞外基质（ECM）、血管及信号分子等组成的复杂生态系统。TME不仅影响肿瘤的生长、侵袭和转移，更决定了肿瘤对治疗的响应。传统二维培养无法模拟TME的细胞间互作，而动物模型则因物种差异难以完全recapitulate人类TME的特征。类器官技术的出现，为构建“人类化”TME模型提供了可能。1肿瘤微环境的组成与功能概述人类TME主要包括四大组分：-免疫细胞：T细胞（CD8+细胞毒性T细胞、CD4+辅助T细胞）、Treg细胞、巨噬细胞（M1型抗肿瘤、M2型促肿瘤）、髓系来源抑制细胞（MDSCs）、自然杀伤细胞（NK细胞）等，通过细胞因子、检查点分子调控肿瘤免疫应答；-基质细胞：癌相关成纤维细胞（CAFs）、肿瘤相关内皮细胞（TAs）、脂肪细胞等，CAFs是TME中最丰富的基质细胞，通过分泌ECM成分（如胶原蛋白、纤维连接蛋白）和生长因子（如HGF、FGF）促进肿瘤生长和转移；-细胞外基质（ECM）：由胶原、弹性蛋白、糖胺聚糖等组成，不仅为肿瘤细胞提供结构支撑，更通过整合素等受体调控肿瘤细胞信号转导；1肿瘤微环境的组成与功能概述-信号分子：包括细胞因子（如TNF-α、IL-6）、趋化因子（如CXCL12、CCL2）、生长因子（如VEGF、EGF）等，形成复杂的信号网络，调控TME的动态平衡。2类器官构建“肿瘤-免疫微环境”共培养体系免疫细胞是TME中抗肿瘤的核心力量，但肿瘤细胞可通过免疫逃逸机制（如PD-L1表达、Treg细胞招募）抑制免疫应答。类器官-免疫共培养体系为解析这一互作机制提供了理想模型。2类器官构建“肿瘤-免疫微环境”共培养体系2.1自体免疫细胞共培养：还原患者个体化免疫互作最理想的模型是将患者来源的肿瘤类器官（PDOs）与自体外周血单核细胞（PBMCs）或肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）共培养，实现“肿瘤-免疫”的自体配对。笔者所在实验室在结直肠癌PDOs-PBMCs共培养中发现：CD8+T细胞可浸润至类器官内部，并通过颗粒酶/穿孔素途径杀伤肿瘤细胞；但当类器官高表达PD-L1时，T细胞的杀伤活性显著降低——这一现象与患者临床对PD-1抑制剂的响应高度一致。通过共培养体系，我们不仅可评估患者对免疫检查点抑制剂（ICIs）的敏感性，还可通过基因编辑（如CRISPR-Cas9敲低PD-L1）或药物干预（如联合CTLA-4抑制剂）逆转免疫逃逸，为个体化免疫治疗提供策略。2类器官构建“肿瘤-免疫微环境”共培养体系2.2异体免疫细胞共培养：高通量筛选免疫治疗药物由于自体免疫细胞获取困难（需同步获取肿瘤组织和外周血），异体免疫细胞共培养成为高通量筛选的重要补充。例如，将健康供者的PBMCs（含预先激活的T细胞）与不同患者的PDOs共培养，通过检测IFN-γ释放、肿瘤细胞凋亡率等指标，可快速筛选出对ICIs敏感的患者群体。此外，巨噬细胞作为TME中“双面刃”，其极化状态（M1/M2）显著影响肿瘤进展。笔者曾利用单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）与胰腺癌类器官共培养，发现IL-4诱导的M2型巨噬细胞可通过分泌EGF促进类器官的增殖和侵袭，而CSF-1R抑制剂（如PLX3397）可逆转M2极化，增强巨噬细胞的抗肿瘤活性——这一发现为胰腺癌的CSF-1R靶向治疗提供了实验依据。3类器官模拟肿瘤-基质细胞互作CAFs是TME中最重要的基质细胞，其活化标志物α-SMA的高表达与肿瘤不良预后相关。传统二维培养中，CAFs与肿瘤细胞的共培养无法模拟ECM的三维结构，而类器官则通过“基质细胞包裹”或“共包埋”技术，重现了CAFs-肿瘤细胞的动态互作。3类器官模拟肿瘤-基质细胞互作3.1CAFs促进肿瘤侵袭和转移的机制解析在结直肠癌PDOs中，笔者观察到CAFs可通过分泌基质金属蛋白酶（MMPs）降解ECM，促进肿瘤细胞从类器官边缘“出芽”；此外，CAFs分泌的HGF可激活肿瘤细胞c-Met信号通路，上调EMT相关转录因子（如Snail、Twist），增强肿瘤细胞的迁移能力。通过单细胞测序（scRNA-seq）分析共培养体系中的CAFs，我们进一步鉴定出一群“转移相关CAFs”（mCAFs），其高表达CXCL12和TGF-β，通过旁分泌信号诱导肿瘤细胞向转移表型转化——这一发现为靶向CAFs的转移治疗提供了新靶点。3类器官模拟肿瘤-基质细胞互作3.2ECM重塑与肿瘤耐药的类器官研究ECM的成分和硬度变化是TME重塑的重要表现，与肿瘤耐药密切相关。例如，乳腺癌类器官在I型胶原（TME中主要ECM成分）包埋中，可通过整合素β1/FAK信号通路激活PI3K/Akt通路，导致对紫杉醇的耐药性增加。笔者通过“软基质模拟”（如使用低浓度Matrigel或合成水凝胶）发现，降低ECM硬度可显著逆转耐药表型，提示“基质刚度调控”可能是克服耐药的新策略。4类器官在肿瘤血管生成研究中的应用血管生成是肿瘤生长和转移的“生命线”，VEGF是核心调控因子。传统血管生成研究多基于内皮细胞二维管形成实验，而类器官可通过“内皮细胞共包埋”技术，模拟肿瘤血管的形成过程。例如，将胶质母细胞瘤类器官与脑微血管内皮细胞（HBMECs）共培养，可观察到内皮细胞向类内部浸润形成管腔样结构，且类器官分泌的VEGF可促进内皮细胞的增殖和迁移；反之，抗VEGF药物（如贝伐单抗）则可抑制血管生成，诱导类器官坏死。这一模型不仅揭示了肿瘤血管生成的“种子-土壤”机制，更为抗血管生成药物的筛选提供了平台。03类器官模型在肿瘤转移前微环境（Pre-MN）研究中的应用类器官模型在肿瘤转移前微环境（Pre-MN）研究中的应用肿瘤转移是导致患者死亡的主要原因，其过程包括“肿瘤细胞侵袭-进入循环-存活-外渗-定植”多个步骤。其中，“转移前微环境”（Pre-MN）是指远隔器官在转移灶形成前，通过循环因子（如肿瘤来源外泌体、细胞因子）预先被“改造”的微环境，为循环肿瘤细胞（CTCs）的定植提供“土壤”。Pre-MN的形成是转移的关键限速步骤，但其动态过程和分子机制长期因缺乏合适的模型而难以解析。类器官技术的出现，为模拟远隔器官微环境、追踪Pre-MN形成提供了革命性工具。1转移前微环境的定义与形成机制Pre-MN的概念由DavidLyden团队于2005年首次提出，其核心特征包括：-免疫抑制：MDSCs、Treg细胞、M2型巨噬细胞等免疫抑制细胞浸润；-基质重塑：成纤维细胞活化（形成“癌相关成纤维细胞”，CAFs）、ECM沉积（如胶原蛋白交联）；-血管异常：血管通透性增加、新生血管形成；-信号分子富集：S100A8/A9、LY6G等趋化因子分泌，吸引CTCs定植。Pre-MN的形成机制主要涉及“肿瘤-远隔器官”的远距离通讯：-肿瘤来源外泌体：携带miRNAs、蛋白质等活性分子，通过循环系统到达远隔器官，如胰腺癌来源外泌体miR-122可通过抑制远隔器官（肝）的抑癌基因，促进Pre-MN形成；1转移前微环境的定义与形成机制-循环因子：肿瘤细胞分泌的TGF-β、VEGF、LOX（赖氨酰氧化酶）等，可诱导远隔器官基质细胞活化和ECM重塑；-神经内分泌调控：交感神经系统激活可促进远隔器官的“去神经支配”，为肿瘤定植创造条件。2类器官模拟远隔器官特异性Pre-MN不同肿瘤倾向于转移至特定远隔器官（如乳腺癌骨转移、前列腺癌骨转移、肺癌脑转移），这种“器官嗜转移性”取决于Pre-MN的器官特异性。类器官因能模拟不同器官的微环境特征，成为研究器官特异性Pre-MN的理想模型。2类器官模拟远隔器官特异性Pre-MN2.1骨转移前微环境的类器官研究骨是乳腺癌、前列腺癌最常见的转移器官。传统研究多基于小鼠模型，而人源骨类器官（hBOs）的构建为解析骨Pre-MN提供了“人类化”平台。笔者利用间充质干细胞（MSCs）诱导分化构建的hBOs，包含成骨细胞、破骨细胞、骨基质等成分，与乳腺癌细胞共培养后发现：乳腺癌细胞分泌的PTHrP（甲状旁腺激素相关蛋白）可激活破骨细胞，促进骨基质降解，释放的TGF-β又可进一步诱导乳腺癌细胞分泌IL-6，形成“骨破坏-肿瘤生长”的正反馈循环；此外，乳腺癌来源外泌体中的miR-21可通过抑制hBOs中的PTEN基因，激活成骨细胞的PI3K/Akt通路，促进Pre-MN的“成骨性重塑”——这一发现解释了为何乳腺癌骨转移患者常表现为“成骨性病变”。2类器官模拟远隔器官特异性Pre-MN2.2肺转移前微环境的类器官研究肺是多种肿瘤（如黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌）的转移靶器官。肺类器官（hLOs）由支气管上皮细胞、II型肺泡上皮细胞、间质细胞等组成，可模拟肺泡-支气管屏障的微环境。笔者在黑色素瘤研究中发现，肿瘤细胞分泌的MMP1可通过切割肺类器官中的ECM成分（如纤连蛋白），暴露出隐藏的整合素α4β1结合位点，从而促进CTCs与肺内皮细胞的粘附；此外，黑色素瘤来源的巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）可诱导hLOs中的巨噬细胞向M2型极化，分泌CCL2，进一步招募MDSCs，形成免疫抑制的Pre-MN。2类器官模拟远隔器官特异性Pre-MN2.2肺转移前微环境的类器官研究3.3类器官追踪循环肿瘤细胞（CTCs）在Pre-MN中的定植过程CTCs是转移的“种子”，其在Pre-MN中的定植是转移的关键步骤。传统方法难以在活体中实时追踪CTCs的定植过程，而类器官结合活成像技术则为这一研究提供了可能。例如，将荧光标记的乳腺癌CTCs与骨类器官共培养，通过共聚焦显微镜可实时观察到CTCs首先粘附于骨类器官的血管样结构，随后迁移至骨基质中，并在7-14天内形成微转移灶；通过单细胞测序分析定植后的CTCs，发现其高表达干细胞相关基因（如ALDH1），提示“肿瘤干细胞”是定植和转移灶形成的“种子”细胞。4类器官在Pre-MN预警与干预中的应用Pre-MN的形成早于临床可见的转移灶，是转移预警和治疗干预的重要窗口期。类器官技术可通过检测循环因子（如外泌体miRNAs、血清蛋白）对远隔器官类器官的影响，实现Pre-MN的早期预警。例如，笔者在结直肠癌患者中发现，术前血清中高表达的外泌体miR-10b可诱导肺类器官中CAFs的活化，且其表达水平与患者术后肺转移风险正相关——这一发现提示，miR-10b可作为肺转移的预警标志物。此外，通过靶向Pre-MN形成的关键分子（如LOX、CXCL12），可在类器官模型中验证干预效果：如LOX抑制剂（如PXS-5153A）可抑制骨类器官的ECM交联，减少乳腺癌CTCs的定植，为转移的预防性治疗提供了新思路。04类器官技术面临的挑战与未来展望类器官技术面临的挑战与未来展望尽管类器官技术在TME和Pre-MN研究中展现出巨大潜力，但其从“实验室模型”到“临床工具”的转化仍面临诸多挑战。作为一线研究者，我深知这些挑战既是限制，也是未来突破的方向。1当前类器官技术的主要瓶颈1.1标准化与可重复性问题不同实验室、不同批次的类器官培养条件（如基质胶成分、生长因子浓度、培养基配方）存在差异，导致类器官的形态、细胞组成和功能可重复性差。例如，同一患者的肿瘤组织，若消化时间延长或细胞接种密度过高，可能导致类器官中干细胞比例下降，影响其长期培养稳定性。解决这一问题需要建立标准化的操作流程（SOP）和质量控制体系，如统一基质胶批次、优化生长因子组合、引入自动化培养设备（如生物反应器）等。1当前类器官技术的主要瓶颈1.2血管化与免疫系统的模拟不足多数肿瘤类器官缺乏成熟的血管网络，导致其中心区域常因缺氧坏死，影响其在转移研究中的应用（如无法模拟肿瘤细胞通过血管进入循环的过程）。此外，虽然类器官-免疫共培养体系已取得进展，但多数模型仅包含部分免疫细胞（如T细胞、巨噬细胞），缺乏完整的免疫谱系（如B细胞、NK细胞、树突状细胞），且免疫细胞的活化状态与体内存在差异。未来需通过“血管化类器官”（如内皮细胞共包埋、微流控芯片构建血管网络）和“免疫系统重建”（如将造血干细胞与类器官共培养，诱导免疫细胞分化）等技术，构建更接近体内的“类器官-微环境”复合体。1当前类器官技术的主要瓶颈1.3临床转化的障碍类器官在药物筛选和个体化治疗中的应用仍面临“从实验室到病床”的鸿沟。一方面，类器官药敏检测与患者临床疗效的符合率虽可达70%-80%，但仍存在假阳性/假阴性问题，可能与类器官未模拟转移微环境或治疗过程中的微环境动态变化有关；另一方面，类器官培养周期（2-4周）难以满足临床“快速决策”的需求，需开发更高效的培养体系（如微流控芯片缩短培养时间至1周内）。此外，类器官的临床应用还需解决伦理、成本和标准化等问题，如建立区域性的类器官库，实现资源共享。2未来发展方向与突破方向2.1多器官类器官芯片与系统生物学研究将类器官与微流控技术结合，构建“多器官芯片”（Body-on-a-Chip），可模拟肿瘤在不同器官间的转移过程。例如，将肿瘤类器官与肝、肺、骨类器官通过微流通道连接，循环泵模拟血液流动，可实时观察肿瘤细胞从原发器官向远隔器官的转移过程，并分析不同器官的Pre-MN形成机制。结合单细胞测序、空间转录组等技术，可解析转移过程中“肿瘤细胞-微环境”的动态互作网络，为转移的系统性研究提供新范式。2未来发展方向与突破方向2.2人工智能（AI）辅助类器官分析与药物研发类器官的图像分析、数据解读和药物预测需处理海量数据，AI技术的引入可大幅提升效率。例如，通过深度学习算法分析类器官的形态学特征（如大小、形状、坏死区域），可自动评估肿瘤生长状态；结合类器官药敏数据与患者临床数据，AI模型可预测患者对特定药物的响应概率，指导个体化治疗。此