大学常规微生物实验注意事项及思考题

试验一细菌涂片的制备及革兰氏染色

1、制备细菌染色标本时应留意什么？

涂片不要太厚，要匀称，固定的时候肯定依据要求，快速，染色脱色时间要

限制好2涂片

2、固定的意义何在？固定时应留意什么问题？

固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，

即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变

形。此制片可用于染色.

3、革兰氏染色的原理及染色成败的关键？

机制：结果为阳性（紫色）和阴性（红色）两大类，与细菌细胞壁的结构组

成有关。细菌经结晶紫初染和碘液媒染之后，全部细菌都染上不溶于水的结

晶紫与碘的复合物，呈深紫色；阴菌的细胞壁含脂类较多，当以95%乙醇脱

色时，脂类被乙醇溶去，而肽聚糖少，且交联疏松，不易收缩，在细胞壁中

形成的孔隙较大，复合物极易被乙醇溶解洗脱，最终被红色的染料复染成红

色；阳菌与阴菌相反，复合物不能脱出，经红色染料复染后仍为紫色。{（麻）

结晶染色一碘媒染一酒精脱色f①可脱为G+②不脱为G-}

关键：革兰氏染色四大基本步骤：口结晶紫初染口碘液媒染口乙醇脱色口沙

黄复染口其中乙醇脱色是关键口因为假如脱色过度，有可能会使革兰氏阳性

菌呈假阴性口假如脱色不够，有可能使革拦氏阴性菌呈假阳性

试验二培育基的制备

1、为什么在校正培育基pH时,少量培育基时用0.1摩尔每升氢氧化钠，而大量

时用1摩尔每升氢氧化钠？

少量培育基在校正时，须要的氢氧化钠少，所以用浓度底的校正的结果会

更精确。而大量的就须要大量的，假如还用浓度低得话，结果会精确，但是

工作量极大，而换lmol/L的话，结果误差不会很大，综合考虑：在校正大

量的培育基时，应运用浓度高的。

2、为什么肉汤培育基在高压灭菌之前ph要略调高些？

牛肉膏中有些物质在加热后会分解出酸性物质导致pH下降。因此初始pH

应比须要值高0.2左右。

3、试述一般肉汤和琼脂培育基的主要用途？

琼脂培育基是在试验室做试验时特地配置的，一般植物源琼脂培育基适用

于培育真菌一类的微生物；动物源琼脂培肓基适用于细菌类微生物培育。动

物源琼脂培育基主要成分与肉汤差不多，只是培育基可以依据试验的要求进

行调整养分成分，以适应试验要求。琼脂培育基肯定会成“冻”，肉汤不肯

定。

试验三细菌分别培育、移植及培育特性视察

留意事项

1、接种环必需做得圆整平滑，运用前后须烧灼灭菌。

2、接种培育基时应严格无菌操作，要尽一切可能防止外界微生物的进入。

3、选择相宜的培育基，假如培育基选择不当，则材料中的细菌就可能难以分别。

4、要留意记录好接种名称刚好间。

思索题

1、分别培育的目的是什么？何谓纯培育？

分别培育的目的是：主要是在含多种细菌的病料或培育物中选择出某种细菌。

在分别培肓时应留意：选择适合于所分别细菌生长的培育基、培育温度、气

体条件等。纯培育：把从一个细胞或一群相同的细胞经过培育繁殖而得到的

后代，称纯培育。

2、在挑取固体培育物上的细菌作平板分区划线时，为什么在每区之间都要将接

种环上剩余的细菌烧掉？

在对下一个区划线之前灼烧接种环，可以杀死接种环上剩余的细菌，这

样，当接种环再从上个区拉出一条线的时候，环上的细菌数目就少了许多，

经过这样的灼烧、划线，环上的细菌数目渐渐削减，最终达到分别出单菌落

的目的。

3、培育皿培育时为什么要倒置？

缘由1：防止凝合在皿盖上的水蒸气流到培育基表面导致染菌！

2：有利于菌种利用培育基养分，加快生长速度！

试验四细菌的生化试验

1.说明所做生化试验的原理

（1）细菌生化试验各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对养分基质的分解实

力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区分，可供鉴别细菌之用。用生化试

验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的和属，

称之为细菌的生化反应。

（2）糖（醇）类发酵试验不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖

（醇）的实力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产

酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培育基时预先加入溟甲酚紫［P

HS.2（黄色）-6.8（紫色）］,当发酵产酸时，可使培育基由紫色变为

黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。

（3）甲基红试验（该试验简称MR试验）许多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄

糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培育基的pH降

低到4.2以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围

是pH4.4（红色）-pH6.2（黄色）。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖

产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培育基的pH仍在6.2以

上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。

（4）大分子物质代谢试验.靛基质（口引睬）试验某些细菌，如大肠杆菌，

能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛

结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。硫化氢试验某些细菌能分解含硫的

氨基酸（肌氨酸、半肌氮酸等），产生硫化氢，硫化氢与培育基中的铅盐或铁盐，

形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。明胶液

化试验某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固实力，呈现液体状态，

是为阳性。淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本试验不做）细菌对大分子的淀

粉不能干脆利用，须靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解为小分子糊精或进一

步水解为葡萄糖（或麦芽糖），再被细菌汲取利用，细菌水解淀粉的过程可通过

底物的改变来证明，即用碘测定不再产生蓝色。

（5）有机酸盐及氨盐利用试验柠檬酸盐利用试验柠檬酸盐培育基系一综合

性培育基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢按是氮的唯一来源。有的

细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培育基上生长，并

分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培育基变为碱性。此时培育基中的溟廖香草酚蓝

指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培育基上不生

长，培育基不变色。2、生化试验在细菌鉴定中的作用和意义生化试验在细菌

的鉴定中意义很大，因为要想确定一种菌详细属于哪一种就要通过一系列的生化

试验几菌落形态和显微视察来确定，生化试验是特别重要的一部分.但其实意义

不是很大，一般是依据《伯氏细菌手册》看的，不过现在基本上都是用16SRNA

来鉴定，要精确一些.

试验五药物敏感试验

1、圆纸片药物敏感试验操作留意事项

药物不能靠的太近，应尽量匀称分布在纸片上。

2、试述药物敏感试验的意义

药物敏感试验是为了对临床标本中分别的菌株选择何种药物进行治疗有

效而进行的一种试验。常用的有纸片扩散法和微量稀释法。依据试验结果

可以推断何种药物对该菌株治疗有效（即敏感），何种药物对该菌株治疗

无效（即耐药）。

试验六血凝及血凝抑制试验

1、病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原体反应？为什么？

不是，口有些病毒具有凝集红细胞的实力，不须要与抗体结合即可以凝

集血细胞，是非特异性的。□还有一些病毒，当与抗体结合后，可以引起红

细胞凝集反应，称为血凝试验，可用于特异性检查抗原或抗体。

2、HI试验是不是特异的抗原抗体反应？为什么？

是，因为HI试验本身就是一种测定抗原或抗体的技术，抗原与相应抗

体之间所发生的特异性结合反应。这种反应即可在机体内进行，也可以在

机体外进行。抗原抗体反应的过程是经过一系列的化学和物理改变，包括抗

原抗体特异性结合和非特异性促凝合两个阶段，以及由亲水胶体转为疏水胶

体的改变

试验七凝集试验

留意事项

1、每次试验应设标准阳性血清、标准阴性血清和生理盐水比照。

2、抗原保存在2〜8℃,用前置室温30〜60min,运用前摇匀，如出现摇不散的

凝块，不得运用。

3、被检血清必需簇新，无明显的溶血和腐败现象。

4、平板凝集反应温度最好在3〜5min内记录结昊，如反应温度偏低，可于5〜

8min内判定。5、平板凝集反应适用于普查初筛，筛选出的阳性反应血清,

需做试管凝集试脸，以试管凝集的结果为被检血清的最终判定.

6、结果判为可疑时，隔2飞周后采血重做。阳性畜群，重检时仍为可疑，可判

为阳性。对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判

阴性；牛、羊重检仍为可疑者，可判为阳性，或以补体结合反应核对。

4、加样时每加完一个样品必需更换滴头。

思索题

1、环状沉淀试验和琼脂扩散沉淀试验的试验原理是什么？操作时应留意事项是

什么？可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电介质存在下，经过肯

定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀试验。沉淀反应的抗原可以是细

菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒的可溶性抗原、组织渗出液、多糖、

蛋白质、类脂等。

测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个小孔,

将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗原和抗体在琼脂板上相互扩散.当二个

扩散圈相遇，如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗

体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透亮的白色沉淀线。

2、琼脂扩散沉淀试验结果为什么有时会出现沉淀带完全交叉现象？

若二孔中抗原不同，当抗血清中分别含有与抗原相应的抗体时，则出现沉淀

带完全交叉现象

3、琼脂扩散沉淀试验在实际中的应用价值？

本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量，

敏感性很高。通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原，或反之用已知抗原鉴定

抗体。

试验九：荧光抗体试验

留意事项

1、假如怀疑是急性猪瘟，可用活体采扁桃体进行荧光染色。

2、待检的组织病料（扁桃体、肾、淋巴结等）必须簇新，如不能刚好检查，

应冷冻保存。3、制备标本的载玻片越薄越好，应无色透亮，用前干净处理并

用绸布擦净；切片或组织触片尽可能薄，太厚不易视察而影响结果的判定。

4、对含病毒较低的病理组织需先在细胞培育上培养一段时期后再用荧光抗体检

测病毒抗原，可提高检出率。

5、视察标本片前荧光显微镜一般需预热15分钟，在暗室内进行，荧光显微镜

安装调试后，最好固定在一个地方加盖防护，不再移动。

6、标本染色后应马上视察，放置时间过久荧光会渐渐减弱，如不能刚好视察可

将标本放在聚乙烯塑料袋中于4。（2保存，可延长荧光保持时间。

7、不能长时间在同一个视野下视察，一般标本在高压汞灯下照耀超过3min即

有荧光减弱现象。

思索题

1、荧光抗体染色的基本原理及试验结果的判定。

基本原理：荧光抗体技术就是用不影响抗体活性的荧光素对抗原或抗体进

行标记，当标记物与相应的抗原或抗体结合后，就会形成带有荧光素的复合

物，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源激发的特定波长的光照耀，荧光

素就会发出光明的荧光，这样就可以对相应的抗原或抗体分析示踪。

结果判定：

黄绿色闪亮荧光++++

黄绿色的亮荧光+++

黄绿色荧光较弱++

仅有暗淡的荧光一

无荧光一

2、请举例说明该技术在动物疫病诊断中的作用？

用猪瘟荧光抗体染色检测猪瘟病毒，特异性强、精确率高，

试验十、酶联免疫吸附试验

留意事项

1.从冷藏环境中取出的试剂盒应平衡至室温后方可运用。

2.未运用的预包被板条应置于封口袋，2〜8T保存。

3.浓缩液用蒸馅水或超纯水稀释，若发觉有出现结晶，请放置37匕至溶解后

运用。

4.滴加试剂时，应先摇匀，并弃去1〜2滴后，垂直滴加。

5.运用完毕后，将全部样品、洗涤液和各种废物都进行灭活处理。

6.TMB（底物B）不要曝露于强光，避开接触氧化剂。

7.待检样品较多时，应先运用血清稀释板稀释完全部要检测血清