蚊子实验动物学实验标准流程

蚊子实验动物学实验标准流程一、实验准备

（一）实验动物选择与准备

1.选择健康、品系纯合的实验动物，常用昆明小鼠（Musmusculus）或SD大鼠（Rattusnorvegicus）。

2.动物年龄范围：4-8周龄，体重200-250g。

3.实验前适应性饲养7天，保持环境温度（25±2）℃，湿度（50±10）%。

（二）实验设备与试剂

1.设备：标准饲养笼（60cm×40cm×30cm）、BOD培养箱（温度控制精度±0.5℃）、计数器、解剖镜。

2.试剂：生理盐水、75%乙醇、无水乙醇（分析纯）、乙醚（分析纯）。

二、实验流程

（一）动物麻醉与处理

1.麻醉方法：腹腔注射乙醚（0.8-1g/kg体重），麻醉深度以翻正反射消失为准。

2.手术操作：

(1)消毒：75%乙醇消毒动物背部皮肤，范围直径5cm。

(2)剖开：沿脊柱正中切开皮肤及皮下组织，暴露椎管。

(3)椎管插管：用显微手术器械插入硅胶管（内径0.8mm），固定管口。

（二）蚊虫感染操作

1.蚊虫准备：

(1)蚊种：选择嗜人按蚊（Anophelesstephensi）或埃及伊蚊（Aedesaegypti）。

(2)感染：将蚊虫置于感染血（含1×10⁸/mL疟原虫子孢子悬液）中吸血30分钟。

2.动物感染：

(1)吸血：将感染蚊虫放入饲养笼内，保持12小时吸血环境。

(2)更换：吸血结束后更换新鲜空气，继续观察。

（三）感染指标监测

1.外周血检测：

(1)采血：尾静脉采血（5μL），使用厚血膜染色（如Giemsa染色）。

(2)计数：显微镜下计数每100个白细胞中的原虫数（感染率≥5%判定为成功感染）。

2.组织病理学检测：

(1)取材：感染7天后处死动物，采集脾脏、肝脏。

(2)染色：HE染色观察原虫在肝窦内的浸润情况。

三、实验数据记录与处理

（一）记录要点

1.记录每次感染蚊虫密度（1-3批/实验组）。

2.记录动物体重变化（每日测量）。

3.记录原虫血症曲线（感染后第3-14天每日采样）。

（二）数据分析方法

1.统计软件：SPSS26.0或GraphPadPrism9。

2.分析指标：

(1)感染指数（InfectionIndex）=（原虫密度×感染率）/动物数量。

(2)脾脏指数（SpleenIndex）=脾脏重量（mg）/体重（g）。

四、实验注意事项

（一）操作规范

1.严格无菌操作，避免交叉感染。

2.蚊虫吸血时间需精确控制，误差±5分钟。

（二）安全防护

1.使用防蚊手套（透气材质），实验结束后立即消毒。

2.原虫样本需高压灭菌（121℃，15分钟）。

五、结果判定

（一）阳性标准

1.外周血厚膜镜检发现原虫，感染率≥10%。

2.脾脏切片观察到疟原虫（肝细胞内或肝窦）。

（二）阴性标准

1.连续3次采样未发现原虫。

2.脾脏病理未见原虫浸润。

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一、实验准备

（一）实验动物选择与准备

1.选择健康、品系纯合的实验动物，常用昆明小鼠（Musmusculus）或SD大鼠（Rattusnorvegicus）。

(1)健康标准：动物活泼，反应灵敏，无异常行为（如震颤、抽搐），毛发光泽，无皮肤病、呼吸道症状或体重异常下降。

(2)品系纯合性：通过遗传学验证或由认证机构提供证明，确保遗传背景一致，减少实验变异。

(3)年龄与体重：4-8周龄为宜，此时动物免疫系统发育成熟，对外界刺激有较好反应，同时处于性成熟前期，避免生殖因素干扰实验结果。体重控制在200-250g，保证足够营养储备以应对感染和实验操作。

2.实验前适应性饲养7天：

(1)环境：置于标准饲养笼（60cm×40cm×30cm），笼内铺有吸水垫料（如木屑或专用无尘垫料），保持环境温度（25±2）℃，相对湿度（50±10）%，12小时/12小时光照周期。

(2)喂养：提供标准颗粒饲料和清洁饮用水，每日更换。观察动物适应情况，确保无应激反应。

（二）实验设备与试剂

1.设备：

(1)标准饲养笼：具备良好通风和光照，便于观察和操作。笼具材质需耐腐蚀、易清洁消毒。

(2)BOD培养箱（生化培养箱）：用于模拟蚊虫吸血环境，需配备湿度传感器，确保湿度稳定。箱内温度可精确控制在（27±1）℃，模拟适宜蚊虫活动的温度。

(3)计数器：手动或电子计数器，用于血涂片原虫计数，电子计数器需校准。

(4)解剖镜：配备不同放大倍数物镜（如10×，40×），用于观察动物内部结构和组织病理学样本。

(5)显微镜：配备油镜（100×），用于血涂片和病理切片的原虫观察。

(6)显微手术器械：显微镊子、显微剪刀、显微止血钳，确保器械锋利且无菌。

(7)尾静脉采血器：包括加热垫、尾静脉分离器、一次性采血管。

2.试剂：

(1)生理盐水：0.9%氯化钠溶液，用于清洗器械、稀释试剂及采血前尾静脉浸润。

(2)75%乙醇：用于皮肤消毒，确保无菌操作。

(3)无水乙醇（分析纯）：用于固定血涂片和脱水。

(4)乙醚（分析纯）：用于动物麻醉，需新鲜配制并避免挥发过快导致浓度变化。

(5)Giemsa染液：用于血涂片原虫染色，需按说明书比例配制和储存。

(6)HE染液：用于组织病理学切片染色，包括盐酸酒精分化液和苏木精染色液。

（三）实验环境准备

1.隔离饲养：将实验动物置于独立通风橱或隔离饲养单元，防止非目标蚊虫干扰。

2.无菌保障：所有操作台面需使用70%乙醇擦拭消毒，器械使用前后均需灭菌（如高压蒸汽灭菌或酒精浸泡）。

3.废弃物处理：实验废弃物（如垫料、血涂片、组织样本）需装入专用锐器桶或生物危害桶，按生物安全等级进行高压灭菌后丢弃。

二、实验流程

（一）动物麻醉与处理

1.麻醉方法：

(1)腹腔注射乙醚（0.8-1g/kg体重）：

(1)配制：取分析纯乙醚20mL，加入无菌生理盐水至100mL，配制成20%乙醚生理盐水溶液。

(2)注射：用1mL注射器吸取溶液，缓慢注入动物下腹部肌内或皮下，注射速度0.1mL/s。

(3)深度判断：观察动物翻正反射消失、呼吸平稳即为麻醉成功。

(2)备选方法：吸入式麻醉（将乙醚通入密闭容器，引导动物吸入）。需配备麻醉面罩和乙醚补充装置。

2.手术操作（椎管插管）：

(1)定位：暴露动物颈椎下段，确定椎管位置（沿脊柱正中线向下寻找棘突间隙）。

(2)剖开：用显微手术刀沿脊柱正中切开皮肤及皮下组织，深度约1cm，暴露皮下筋膜。

(3)分离：用显微止血钳轻轻分离椎骨间隙处的肌肉，暴露椎管。

(4)插管：将内径0.8mm、外径1.2mm的硅胶管（预润滑生理盐水）沿椎管方向缓慢插入，深度约0.5-1cm。确认插入方向正确（沿脊髓背侧），用组织胶或缝合线固定管口于皮肤表面，确保无脱落风险。

(5)缝合：用显微缝合针线缝合皮下组织及皮肤，避免压迫插管。

（二）蚊虫感染操作

1.蚊虫准备：

(1)蚊种与来源：选择嗜人按蚊（Anophelesstephensi）或埃及伊蚊（Aedesaegypti），由实验室昆虫饲养室提供，确保已知感染状态。

(2)感染源准备：

(1)原虫悬液：取含1×10⁸/mL子孢子的感染血（如鼠肝细胞系感染），用生理盐水稀释至1×10⁶/mL，混匀。

(2)感染血制备：取新鲜血液（如兔血或小鼠血），与上述子孢子悬液按1:1体积比混合，加入抗凝剂（如柠檬酸钠）保存于4℃备用。

(3)蚊虫吸血训练：将未感染蚊虫置于感染血环境中吸血1-2小时，重复3-5次，提高吸血效率。

2.动物感染：

(1)吸血环境设置：将带有插管的动物置于BOD培养箱内，箱内放置感染血（每只动物对应一支感染血针，针头插入硅胶管末端）。

(2)吸血时间控制：保持12小时吸血环境，期间维持培养箱温度（27±1）℃和湿度（80±10）%，确保蚊虫吸血效率。

(3)吸血结束后处理：蚊虫吸血完毕后，移出动物，更换培养箱内空气，继续观察动物状态。

（三）感染指标监测

1.外周血检测：

(1)采血时间点：感染后第3、5、7、9、11、14天每日采样。

(2)尾静脉采血：

(1)加热：将动物尾尖置于45℃温水浴中10-15秒，使血管扩张。

(2)血涂片制备：用毛细血管采血管采集5μL血，沿玻片边缘均匀涂抹成薄血膜。

(3)固定：将血膜置于空气中自然干燥30分钟。

(3)染色与镜检：

(1)染色：将血膜滴加Giemsa染液（按1:10稀释），染色30分钟，流水冲洗。

(2)镜检：使用显微镜（油镜）观察血膜，计数每100个白细胞中的原虫数，记录感染率和原虫密度。

(3)计算感染指数：InfectionIndex=(原虫密度×感染率)/动物数量，用于比较不同实验组感染程度。

2.组织病理学检测：

(1)取材时间：感染7天后处死动物。

(2)脾脏与肝脏采集：

(1)解剖：处死动物后，迅速解剖取出脾脏和肝脏，用生理盐水冲洗表面血污。

(2)固定：将组织置于4%多聚甲醛溶液中固定24小时。

(3)石蜡包埋与切片：

(1)脱水与透明：依次经乙醇梯度脱水（50%,70%,80%,90%,95%,100%）和二甲苯透明。

(2)包埋：将组织块浸入石蜡中，包埋成蜡块。

(3)切片：使用切片机将蜡块切成5μm厚切片，贴片于载玻片上。

(4)染色与镜检：

(1)染色：采用HE染色法，包括苏木精染色（染色10分钟）、盐酸酒精分化（30秒）、分化后自来水冲洗、氨水返蓝（1分钟）、自来水冲洗、脱水（95%,100%乙醇各1分钟）、透明（二甲苯2分钟）、封片（中性树胶）。

(2)镜检：观察脾脏和白髓、红髓结构，以及肝脏肝窦内是否存在原虫及其浸润情况。

（四）数据采集与记录

1.记录要点：

(1)每日记录动物体温、体重变化及行为状态（如活动量、进食情况）。

(2)记录每次感染蚊虫批次、数量及吸血效率（吸血蚊虫比例）。

(3)详细记录血涂片制备、染色过程及镜检结果，包括原虫形态特征（如疟原虫环状体、配子体等）。

(4)记录组织病理学切片染色步骤及显微镜观察到的病理改变（如巨噬细胞浸润、肝细胞变性等）。

2.数据整理：

(1)建立电子表格（如Excel），按时间点、动物编号、检测指标分类记录数据。

(2)绘制原虫血症曲线：以时间为横坐标，原虫密度为纵坐标，绘制感染后每日原虫血症变化趋势图。

(3)统计分析：使用SPSS26.0或GraphPadPrism9进行统计分析，计算组间差异（如t检验或方差分析），绘制脾脏指数变化图。

三、实验数据记录与处理

（一）记录要点（续）

1.动物生理指标：

(1)体温：每日固定时间测量，记录波动范围。

(2)体重：每日晨起称重，记录增减情况。

2.蚊虫感染参数：

(1)蚊虫种类与批次：记录蚊种学名、来源、饲养代数。

(2)吸血效率：统计每批蚊虫中成功吸血的个体比例。

3.实验结果量化：

(1)原虫计数标准：镜检时需设定标准视野（如400倍），确保计数准确性。

(2)病理评分：采用半定量评分法（如0-3分），评估肝窦、白髓等区域的炎症程度。

（二）数据分析方法（续）

1.统计软件：优先使用SPSS26.0（适用于多因素分析），GraphPadPrism9（适用于曲线绘制）。

2.分析指标补充：

(1)脾脏指数（SpleenIndex）=脾脏重量（mg）/体重（g），反映感染对免疫器官的影响。

(2)原虫清除率：计算感染峰值后原虫密度的下降速度（如每日下降百分比）。

3.结果呈现：

(1)表格：使用三线表格式呈现原始数据及统计结果。

(2)图表：结合直方图、折线图、散点图等多种形式展示数据，确保坐标轴标签清晰，图例完整。

四、实验注意事项

（一）操作规范（续）

1.无菌操作：

(1)手术前后严格洗手，佩戴无菌手套。

(2)所有接触动物的组织、器械需经高压灭菌（121℃，15分钟）或消毒（如75%乙醇浸泡30分钟）。

(3)实验台面使用70%乙醇擦拭消毒，避免微生物污染。

2.蚊虫管理：

(1)蚊虫饲养环境需定期消毒，防止逃逸或污染。

(2)感染蚊虫需在生物安全柜中操作，避免气溶胶传播。

3.动物福利：

(1)麻醉深度需掌握得当，避免过度麻醉导致动物死亡。

(2)手术操作轻柔，减少应激反应。

(3)实验结束后需人道处死动物（如CO₂窒息），并记录处死时间。

（二）安全防护（续）

1.个人防护：

(1)操作时佩戴防护眼镜、口罩，必要时穿戴实验服。

(2)处理生物样本时使用一次性手套，接触完毕后立即更换。

2.化学品安全：

(1)乙醚需在通风良好的地方使用，远离火源。

(2)染色试剂（如Giemsa、HE）具有刺激性，需在通风橱中操作。

3.废弃物处理（续）：

(1)污染性废弃物（如沾染血液的组织、培养基）需放入专用锐器桶或生物危害桶。

(2)化学废液需按实验室规定分