T-CSTM 00999-2023 玉米褪绿斑驳病毒 形态学检测 透射电子显微镜法

ICS65.020.01CCSN33Maizechloroticmottlevirus--Morphologicalidentificationm中关村材料试验技术联盟发布T/CSTM00999—2023本文件参照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》，GB/T20001.4《标准编写规则第4部分：试验方法标准》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国材料与试验标准化委员会科学试验标准化领域委员会（CSTM/FC98）提出。本文件由中国材料与试验标准化委员会科学试验标准化领域委员会（CSTM/FC98）归口。2T/CSTM00999—2023玉米褪绿斑驳病毒（maizechloroticmottlevirus,MCMV）是侵染玉米的重要检疫性病毒病原，被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。该病毒与马铃薯Y病毒科（Potyviridae）的几种病毒之一复合侵染引起的玉米致死坏死病（cornlethalnecrosis，CLN是玉米生产的毁灭性病害，一旦发生将带来严重的经济损失。MCMV为直径30nm的二十面体对称球状粒子，可经汁液、介体叶甲和蓟马传播，也可经种子传播，田间扩散容易，在病毒分类学上归属于类番茄丛矮病毒目（Tolivirales）、番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）、玉米褪绿斑驳病毒属（Machlomovirus附录A）。应用透射电子显微镜可观察其形态结构以及细胞病理学特征，是验证抗体检测和分子检测结果的重要形态学检测依据。透射电镜制样方法的细节以及制样质量直接关系到该病毒的形态成像及正确鉴定，为了正确指导玉米褪绿斑驳病毒形态学检测诊断工作，特制定该病毒透射电子显微镜形态学检测方法的标准。T/CSTM00999—2023玉米褪绿斑驳病毒形态学检测透射电子显微镜法重要提示：使用本文件的人员应有植物病毒检测能力的实验室工作实践经验。本文件并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。本文件规定了应用透射电子显微镜对玉米褪绿斑驳病毒进行形态学检测的方法。本文件适用于玉米褪绿斑驳病毒的形态学鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T31810玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定方法JY/T0581透射电子显微镜分析方法通则SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法SN/T2964植物病毒检测规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1病毒virus由核酸和蛋白质外壳组成，具有侵染活性并能够在寄主细胞内复制的非细胞生物。3.2病毒粒子virion成熟的或结构完整、具有侵染性的病毒个体。3.3玉米褪绿斑驳病毒maizechloroticmottlevirusMCMV一种严重侵害玉米等作物的检疫性植物病毒，详见附录A。3.4抗原antigenT/CSTM00999—20234能刺激动物机体产生抗体和致敏淋巴细胞并能与之发生特异性免疫结合反应的物质。3.5抗体antibody动物机体受到抗原刺激而产生的、能与相应抗原发生特异性免疫结合反应的一种免疫球蛋白。3.6负染色negativestain采用高密度的重金属盐染色液提高生物样品颗粒背景电子密度的染色方法。3.7免疫电子显微术immunoelectronmicroscopy利用抗原抗体特异性结合的原理在超微结构水平上定位、定性及半定量显示抗原的技术方法，分为免疫复合物电镜技术和免疫标记电镜技术两大类。3.8超薄切片术ultrathinsectiontechnique采用超薄切片机把经过包埋后的样品切成厚度为50nm~100nm薄片的方法。4原理4.1负染色技术原理：采用高密度的重金属盐染色液（如磷钨酸、醋酸双氧铀等）包围低密度的样品颗粒，使样品颗粒周围的电子密度得到增强，在透射电镜下显示暗背景衬托的浅色样品颗粒形态及微细结构，图像呈现负反差。该方法直接对病毒悬液样品进行负染色，操作简便，可用于多数病毒快速检测。4.2免疫复合物电镜技术原理：在电镜载网上进行抗原抗体免疫反应，然后对免疫反应复合物进行负染色电镜观察，适用于病毒快速检测诊断。4.3超薄切片技术原理：将经过固定和脱水的生物样品包埋在树脂介质中，采用超薄切片机将含有样品的聚合树脂包埋块切成厚度为50nm~100nm的薄片，供透射电镜观察。5仪器设备、试剂和材料、实验室资质及环境条件5.1仪器设备5.1.1透射电子显微镜；5.1.2超薄切片机；5.1.3玻璃制刀机；5.1.4高速离心机；5.1.5光学显微镜；5.1.6涡旋振荡仪；5.1.7辉光放电仪；T/CSTM00999—202355.1.8包埋聚合箱；5.1.9移液器。5.2试剂和材料5.2.1磷酸二氢钠（分析纯）；5.2.2磷酸氢二钠（分析纯）；5.2.3戊二醛（分析纯）；5.2.4四氧化锇（结晶体）；5.2.5丙酮（分析纯）；5.2.6乙醇（分析纯）；5.2.7环氧树脂包埋剂；5.2.8醋酸双氧铀（分析纯）；5.2.9柠檬酸铅（分析纯）；5.2.10磷钨酸（分析纯）；5.2.11亚甲基蓝；5.2.12玉米褪绿斑驳病毒多克隆抗体；5.2.13PCR检测离心管（0.5mL，1.5mL）；5.2.14封口膜；5.2.15滤纸；5.2.16包埋管；5.2.17覆Formvar膜的200目电镜铜网。5.3实验室安全资质及环境条件5.3.1实验室安全资质：植物病毒对于哺乳动物和人不具感染性，本文件规定的实验操作可以在普通生物实验室进行。5.3.2环境条件：超薄切片机、透射电镜应安装在独立的房间内，工作环境应符合以下要求。a)超薄切片机：相对湿度小于60%，温度（20±5）℃,电源电压（220±22）V，电源频率（50±1）Hz，满足防振要求；b)透射电镜：相对湿度小于60%，温度（20±5）℃,电源电压（220±22）V，电源频率（50±1）Hz，具备仪器专用地线，接地电阻值参照仪器说明书的要求。6样品6.1样品类型6.1.1玉米种子。6.1.2田间的玉米病株叶片、茎等新鲜材料。T/CSTM00999—202366.1.3人工接种MCMV的玉米叶片、茎等新鲜材料。6.2取样要求6.2.1田间作物取样及样品处理按SN/T2964的规定执行。6.2.2进出境植物检疫的取样按SN/T2122的规定执行。6.2.3其他来样按送检要求进行取样。6.3样品贮存和传递待检种子样品可保存于室温或4℃冰箱内；用于超薄切片的叶片样品应保湿存放于4℃冰箱内，其它病株样品可在-20℃以下冰箱冻存。种子样品在室温下传递，新鲜病株样品须0℃~15℃保湿传递。6.4样品预处理6.4.1组织粗汁液样品：将玉米叶片组织加等体积0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.0在研钵中研磨，过滤或离心后获得粗汁液；小片的组织可用微型研磨器研磨；种子取种皮在液氮中研磨制备组织粗汁液，也可以在适当温度和光照条件下使其发芽后再制备获取组织粗汁液。6.4.2提纯病毒样品：将分离提纯的MCMV样品用双蒸馏水或0.01mol/L的磷酸缓冲液（pH7.0）稀释至适合电镜观察的浓度。6.4.3超薄切片样品：选择有明显褪绿斑驳症状的玉米叶片，用双面刀片切取病叶的褪绿斑驳边缘部位供超薄切片制样之用。7检测步骤7.1电镜样品制备7.1.1负染色样品制备悬滴法：以镊子夹持铜网，用移液器吸一滴病毒样品液体滴在覆膜的铜网上，吸附1min~2min，然后用滤纸片从铜网边缘吸掉多余液体，待液体完全干燥前，用2%磷钨酸负染色液（pH6.8）进行负染色，染色时间1min~2min，用滤纸片从铜网边缘吸掉多余染色液，干燥后待检。负染色液配制参见附录B。漂浮法：在培养皿内铺封口膜，用移液器吸一滴病毒样品液体滴在封口膜上，将铜网膜面朝下倒扣在病毒悬液滴上静置1min~2min，然后夹起铜网，用滤纸片从铜网边缘吸掉多余液体，再将铜网倒扣在2%磷钨酸负染色液滴（pH6.8）上进行负染色，染色时间1min~2min，用滤纸片从铜网边缘吸掉多余染色液，干燥后待检。7.1.2免疫吸附样品制备在培养皿内铺上封口膜，用移液器吸一滴1:10~1:100倍稀释的MCMV抗体滴在封口膜上，将铜网膜面朝下放置于抗体液滴上，在培养皿中保湿15min。用滤纸片吸掉抗体余液后，将铜网膜面朝下放置于病毒样品悬液滴上，在培养皿中保湿反应30min（如种子的病毒含量低，反应时间可延长至数小时或过夜）。T/CSTM00999—2023反应结束后用20滴0.05mol/L的磷酸缓冲液、30滴双蒸馏水先后连续滴洗样品铜网。用滤纸片吸除余液后，用2%磷钨酸（pH值6.8）进行负染色，染色时间1min~2min，干燥后待检。7.1.3超薄切片样品制备前固定：将病株叶片切成1mm×3mm的小块，置于0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配制的2%~3%戊二醛固定液中前固定2h（4℃)。戊二醛固定液配制参见附录B。漂洗：用0.1mol/L磷酸缓冲液充分漂洗三次，每次10min~15min。后固定：经过漂洗后的样品置于0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配制的1%四氧化锇固定液中后固定1h~2h（4℃),再用相同缓冲液充分漂洗三次，每次10min~15min。四氧化锇固定液配制参见附录B。脱水：采用50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇梯度脱水，各浓度脱水时间为10min~15min，然后用100％丙酮脱水2次，每次30min。浸透与包埋：样品脱水后在丙酮：包埋剂（1：1）浸透1h1：3）浸透3h，然后在纯包埋剂中浸透过夜，用胶囊或包埋管进行样品包埋。推荐采用Spurr低粘度包埋剂，其配制参见附录B。聚合：包埋后的样品在包埋聚合器或恒温烘箱内进行聚合。修块和定位：聚合后的包埋块修成易于超薄切片的形状，然后在超薄切片机上用玻璃刀进行半薄切片，切片厚度为0.5μm~1μm，经1%亚甲基蓝染色后在光学显微镜下进行病变细胞定位。超薄切片：修块和定位后的包埋块在超薄切片机上用玻璃刀或钻石刀切成超薄切片，切片厚度50nm~100nm，用覆膜铜网捞取超薄切片。染色：采用醋酸双氧铀和柠檬酸铅在室温下对超薄切片进行双重染色，醋酸双氧铀染色时间15min~30min，柠檬酸铅染色时间5min~10min，干燥后待检。染色液的配制参见附录B。7.2透射电镜检测步骤7.2.1按照透射电镜操作程序开机，抽真空至正常工作状态，精确合轴，消除聚光镜和物镜像散，使仪器处于最佳工作状态。7.2.2透射电镜放大倍数校准按JY/T0581的规定进行。7.2.3推荐加速电压范围：60kV~80kV。7.2.4推荐放大倍率范围：4,000×~50,000×。7.2.5负染色样品和免疫吸附样品的观察：先在低倍率（4,000×左右）下选择负染色剂着色的电子密度较大斑块，观察样品全貌。逐步提高放大倍率，仔细寻找直径30nm的球状病毒粒子，由于田间样品往往是MCMV与另一种线状植物病毒复合侵染，因此在负染色样品中可以同时观察到长度约600nm-900nm线状病毒粒子。种子样品中的病毒含量通常较低，电镜视野下可观察到的病毒粒子较少。病毒粒子图像精细聚焦后用CMOS或CCD相机记录并储存。MCMV病毒粒子的典型形态见附录C。T/CSTM00999—202387.2.6超薄切片样品的观察：在低倍率模式（50×~1,000×)找到切片，切换到正常放大模式观察呈现病变的细胞。逐步提高放大倍率，仔细观察细胞超微结构的异常变化。在MCMV侵染的病变细胞中可以观察到大量直径30nm典型的球状病毒粒子分布在细胞质内，局部还有结晶状排列的病毒聚集体；过氧化物酶体增生并聚集，在过氧化物酶体外膜周边形成复制小泡；线粒体呈现囊泡化畸变，在囊泡结构中积累了大量纤维状物质，后期线粒体崩解，纤维状物质释放到细胞质。MCMV感染的细胞图像精确聚焦后用CMOS或CCD相机记录并储存。感染MCMV的病变细胞特征和健康对照图片见附录C。7.3结果判定电镜下观察到直径30nm的球状病毒粒子，病变细胞的线粒体呈现囊泡化畸变并含有纤维状物质，过氧化物酶体形成周边复制小泡等细胞超微结构变化，符合附录A和附录C的典型形态特征。在所有侵染玉米的植物病毒中，唯有MCMV才引起线粒体囊泡化畸变并含有纤维状物质，并且过氧化物酶体产生周边复制小泡，根据这些细胞形态学特征就可判定样品携带MCMV。在仅对样品进行负染色电镜观察的情况下，或者有植物检疫的技术要求，可按GB/T31810的规定进一步做抗体检测和分子检测验证。8样品无害化处理MCMV检测过程中使用过的样品材料，在检测完毕后需要进行消毒和无害化处理。送检种子样品保存在4℃冰箱内，病叶样品保存在-20℃以下冰箱或冻干保存三个月备查，保存期满后及时进行灭活销毁，以防病毒在田间扩散。9检测报告检测结果报告至少应包括以下信息：a)检测报告的唯一编号；b)样品名称；c)送检人姓名、单位和地址；d)样品的接收日期；e)检测仪器及其工作条件；f)检测依据；g)检测结果和必要的说明；h)检测人签字；i)检测报告负责人签字；j)检测报告的页码；k)检测机构名称和地址；l)检测报告的日期。T/CSTM00999—2023玉米褪绿斑驳病毒相关资料A.1病毒学名及分类学地位（引自：国际病毒分类委员会ICTV2021病毒分类系统。）目（Order类番茄丛矮病毒目（Tolivirales）科（Family）：番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）属（Genus）：玉米褪绿斑驳病毒属（Machlomovirus）种（Species）：玉米褪绿斑驳病毒（Maizechloroticmottlevirus,MCMV）A.2寄主范围玉米褪绿斑驳病毒的自然寄主为玉米，还可侵染小麦、大麦、燕麦、高粱、甘蔗等禾本科植物。A.3病害症状病毒引起褪绿斑驳、坏死、矮化、穗发育差或无穗、过早死亡等症状。常与甘蔗花叶病毒等马铃薯Y病毒科病毒共同复合侵染，产生更严重症状，造成严重危害。A.4传播病毒易通过机械接种传播，也可以经种子、介体叶甲、蓟马传毒，在田间扩散容易。A.5地理分布分布于阿根廷、墨西哥、秘鲁、美国，在东非和东南亚地区也有发现，2009年在中国云南首次发现并报道。A.6血清学特性MCMV具有中等到强的免疫原性，在凝胶扩散中形成单条沉淀线，与其他一些禾谷类植物病毒无血清学关系。A.7病毒粒子形态病毒粒子为等轴对称二十面体（T=3直径为30nm，无包膜，有的被染色剂渗透，有180个蛋A.8理化特性相对分子质量为6.1×106，标准沉降常数S（20W）=109S，在氯化铯中的浮力密度为1.365g/cm3，病毒对乙醚、氯仿和非离子去垢剂不敏感，在体外可稳定33天以上，热钝化点在80℃~85℃,病毒在pH6稳定，可由二价阳离子稳定。A.9基因组结构单分子正义单链RNA，长度为4437nt。RNA的3'端无Poly（A），5'端可能是未加帽的。病毒基因组含有4个ORF，ORF1编码一个32kDa蛋白，ORF2编码48kDa蛋白，对ORF2琥珀终止密码子的超读使翻译持续到ORF2-RT，产生一个112kDa蛋白，该蛋白也可以在病毒RNA的体外翻译中得到。ORF3编码一个7kDa蛋白，推测对ORF3的UGA终止密码子超读产生一个33kDa蛋白。ORF4编码25kDa的外壳蛋白，在体内由其3'端亚基因组RNA表达产生。ORF1与ORF3编码蛋白以及ORF3超读产物的功能尚不清楚，ORF2编码蛋白及其超读产物可能是病毒的聚合酶。T/CSTM00999—2023A.10细胞病理学大量病毒粒子分布在细胞质中；过氧化物酶体增生并聚集，形成周边复制小泡；线粒体囊泡化，在由线粒体内脊扩张形变而成的囊泡中产生大量细纤维状物质。与马铃薯Y病毒科病毒复合侵染的细胞质中可观察到线状病毒和风轮状内含体。T/CSTM00999—2023常用试剂配方B.1磷酸缓冲液配方B.1.10.2mol/L磷酸缓冲液母液配制A液：0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液NaH2PO4.H2O27.60g（或NaH2PO4.2H2O加双蒸馏水至1000mL，混匀。B液：0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液Na2HPO4.2H2O35.61g（或Na2HPO4.12H2O71.64g）加双蒸馏水至1000mL，混匀。B.1.20.2mol/L磷酸缓冲液贮存液配制不同pH值磷酸缓冲液贮存液配制见表B.1，表B.1不同pH值磷酸缓冲液贮存液配制表pH值7.07.8A液73.562.551.039.028.0B液26.537.549.061.072.091.5B.1.30.1mol/L磷酸缓冲液配制取0.2mol/L磷酸缓冲液贮存液，加1倍双蒸馏水即为0.1mol/L磷酸缓冲液。按不同比例稀释可配制成不同浓度的磷酸缓冲液。B.2固定液配方B.2.1戊二醛固定液配制戊二醛固定液配制见表B.2。表B.20.1mol/L磷酸缓冲液配制的戊二醛固定液配制表0.2mol/L磷酸缓冲液/mL25%戊二醛水溶液/mL46820加双蒸馏水至/mL戊二醛最终浓度2.0%2.5%4.0%T/CSTM00999—2023B.2.2四氧化锇固定液配制B.2.2.12％四氧化锇贮存液将装有四氧化锇晶体的安瓿（0.5g）清洗干净，用玻璃划割器在上面刻痕，再用双蒸馏水冲洗几次，放入洁净棕色广口瓶内，加上25mL双蒸馏水，用洁净玻璃棒捣破安瓿，快速盖上瓶盖，用封口膜将瓶口密封，贴上标签并用黑纸包裹避光备用。B.2.2.20.1mol/L磷酸缓冲液配制的四氧化锇固定液取等量的0.2mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）与2％四氧化锇贮存液混合，现配现用。B.3包埋剂配方B.3.1Spurr低黏度包埋剂配制见表B.3。表B.3Spurr低黏度包埋剂配制表试剂标准偏硬性硬性软性快速聚合慢速聚合ERL-4221DER-7364.0g7.0gNSA26.0g26.0g26.0g26.0g26.0g26.0gDMAE0.4mL0.4mL0.4mL0.4mL0.2mL聚合时间/h88883混合时间/d3~43~43~43~427B.3.2按表B.3比例将前三种成份混合均匀，再加DMAE催化剂搅拌。配好的包埋剂在低温和防潮状态下可保存数月。此包埋剂在聚合时包埋管需要加盖，在70℃温度下聚合8h即可完全聚合。此包埋剂不易受潮。B.4染色液配方B.4.12%磷钨酸负染色液配制称取1g磷钨酸，用50mL双蒸馏水配制成2%的水溶液，用1mol/LNaOH调至pH6.7~6.8，过滤后在4℃下保存备用。B.4.2饱和醋酸双氧铀负染色液配制低盐的病毒提纯试样也可用饱和醋酸双氧铀水溶液进行负染色，具有更高的图像分辨率。饱和醋酸双氧铀负染色液用双蒸馏水配制，pH值4.2，室温下避光保存备用。B.4.3超薄切片染色液配制B.4.3.1醋酸双氧铀染色液：用50%乙醇配制成1%~3%的饱和溶液，呈淡黄色，室温下避光保存。B.4.3.2柠檬酸铅染色液：称取硝酸铅1.33g、柠檬酸三钠1.76g，放入50mL容量瓶中，加预先煮沸过的双蒸馏水30mL，混合后摇荡30min，呈乳白色混悬液，加1mol/LNaOH溶液8mL，待混悬液逐渐变澄清，pH值为12，再加双蒸馏水定容至50mL，封闭瓶口。T/CSTM00999—2023玉米褪绿斑驳病毒电镜照片C.1玉米褪绿斑驳病毒（MCMV）的形态见图C.1。AACBBD图C.1玉米褪绿斑驳病毒（MCMV）的形态T/CSTM00999—2023C.2玉米褪绿斑驳病毒（MCMV）侵染玉米叶片的细胞病理特征见图C.2。BDACBDAC图C.2玉米褪绿斑驳病毒（MCMV）侵染玉米叶片的细胞病理特征T/CSTM00999—2023C.3健康对照玉米叶片细胞超微结构见图C.3。BABA图C.3健康对照玉米叶片细胞超微结构T/CSTM00999—2023本文件起草单位：浙江大学，云南省农业科学院，拱北海关技术中心，上海海关动植物与