大豆JAZ基因家族的全基因组鉴定与功能解析：茉莉酸信号调控的关键因子

大豆JAZ基因家族的全基因组鉴定与功能解析：茉莉酸信号调控的关键因子一、引言1.1研究背景与意义茉莉酸（Jasmonicacid，JA）作为一种广泛存在于植物体内的重要内源激素，在植物的生长发育进程以及对复杂多变环境的响应过程中，都发挥着举足轻重的关键作用。从植物生长发育的角度来看，茉莉酸参与调控种子萌发、根的生长、叶片发育、开花时间以及果实成熟等多个重要环节。在种子萌发阶段，适宜浓度的茉莉酸能够打破种子休眠，促进种子萌发，为植物的后续生长奠定基础；在根系发育过程中，茉莉酸可以影响根的伸长、侧根和根毛的形成，调节根系结构，使其更好地适应土壤环境，吸收水分和养分。在叶片发育方面，茉莉酸参与调控叶片的形态建成、衰老进程，对植物的光合作用和物质积累产生重要影响。而在开花和果实成熟过程中，茉莉酸也扮演着不可或缺的角色，它能够调节植物的花期，影响花器官的发育和花粉的育性，同时还参与果实的成熟和品质形成过程。当植物面临生物胁迫，如遭受昆虫取食、病原菌侵染时，茉莉酸信号途径迅速激活，诱导植物产生一系列防御反应，从而增强植物的抵抗力。植物会合成并积累植保素等抗菌物质，这些物质具有抗菌活性，能够抑制病原菌的生长和繁殖，阻止病原菌的入侵。植物还会合成蛋白酶抑制剂，这些抑制剂能够抑制昆虫消化道内蛋白酶的活性，使昆虫无法正常消化食物，从而影响昆虫的生长和发育，降低昆虫对植物的危害。此外，茉莉酸还能诱导植物产生挥发性有机化合物，这些化合物可以吸引害虫的天敌，通过生物防治的方式减轻害虫对植物的侵害。在非生物胁迫方面，茉莉酸同样发挥着重要作用，它可以帮助植物抵御干旱、高盐、低温等恶劣环境条件。在干旱胁迫下，茉莉酸能够调节植物的气孔运动，减少水分散失，同时还能诱导植物合成渗透调节物质，提高植物细胞的保水能力，增强植物的抗旱性。在高盐和低温胁迫下，茉莉酸可以调节植物体内的离子平衡和抗氧化系统，减轻胁迫对植物细胞的损伤，提高植物的抗逆性。茉莉酸信号途径的调控机制极为复杂，而茉莉酸ZIM结构域蛋白（JasmonateZIM-domainproteins，JAZ）作为该信号途径中的核心抑制因子，处于整个调控网络的关键位置。在没有茉莉酸信号时，JAZ蛋白与茉莉酸信号途径中的关键转录因子，如MYC2等紧密结合，形成稳定的复合物，从而抑制这些转录因子的活性。由于转录因子的活性被抑制，茉莉酸响应基因无法正常表达，植物的防御反应和相关生理过程处于相对静止的状态。当植物受到外界刺激，茉莉酸信号被激活后，细胞内茉莉酸的浓度迅速升高，茉莉酸会与受体COI1（Coronatine-insensitive1）结合，形成JA-Ile-COI1复合物。这个复合物具有很强的活性，能够特异性地识别并结合JAZ蛋白，使JAZ蛋白发生泛素化修饰。被泛素化修饰的JAZ蛋白会被26S蛋白酶体识别并降解。随着JAZ蛋白的降解，与之结合的转录因子被释放出来，恢复活性。激活后的转录因子能够与茉莉酸响应基因的启动子区域结合，启动基因的转录过程，从而诱导植物产生一系列的防御反应和生理变化，以适应外界环境的变化。大豆作为全球重要的粮食作物和经济作物，不仅是人类优质植物蛋白和油脂的主要来源之一，还在饲料工业、食品加工以及生物能源等领域具有广泛的应用。在农业生产中，大豆面临着诸多挑战，生物胁迫方面，大豆易受到蚜虫、食心虫等昆虫的侵害，以及大豆疫霉根腐病、灰斑病等病原菌的侵染，这些病虫害严重影响大豆的产量和品质。非生物胁迫方面，干旱、洪涝、盐碱等不良环境条件也会对大豆的生长发育产生负面影响，导致大豆减产甚至绝收。深入研究大豆中JAZ基因家族的功能，对于揭示大豆的生长发育调控机制以及提高大豆对生物和非生物胁迫的抗性具有重要的理论意义和实际应用价值。通过对大豆JAZ基因家族的全基因组鉴定和功能分析，能够全面了解JAZ基因在大豆中的分布、结构特征以及进化关系，为进一步研究其功能提供基础。探究JAZ基因在大豆生长发育各个阶段的表达模式，以及在不同胁迫条件下的响应机制，有助于揭示大豆生长发育的调控网络和抗逆机制，为大豆的遗传改良提供理论依据。在实际应用中，明确JAZ基因的功能后，可以将其作为潜在的分子靶点，通过基因编辑、转基因等现代生物技术手段，对大豆进行遗传改良，培育出高产、优质、抗逆性强的大豆新品种。这对于保障全球粮食安全、提高农业生产效益以及促进农业可持续发展都具有重要的战略意义。1.2国内外研究现状在植物科学领域，JAZ基因家族的研究一直是一个热门话题，国内外学者围绕其展开了大量深入的研究，取得了一系列丰硕的成果。早在2007年，Thines等学者在《Nature》杂志上发表的研究成果，首次成功鉴定出JAZ蛋白，并清晰地阐述了其在茉莉酸信号途径中的关键抑制作用。这一开创性的发现，犹如一盏明灯，为后续JAZ基因家族的研究照亮了前行的道路，使得JAZ基因家族逐渐成为植物激素信号转导研究领域的焦点之一。众多科研团队纷纷投身于JAZ基因家族的研究，从不同植物物种、不同研究角度对其展开全方位的探索。在拟南芥中，作为植物研究领域的经典模式植物，其JAZ基因家族的研究最为深入和系统。已有的研究成果表明，拟南芥中存在13个JAZ基因成员。这些基因成员在结构上具有高度的相似性，都包含保守的TIFY结构域和Jas结构域。然而，在功能上，它们却展现出丰富的多样性和特异性。AtJAZ1、AtJAZ3等基因在调控植物的防御反应方面发挥着重要作用。当拟南芥遭受昆虫取食或病原菌侵染时，这些基因的表达水平会迅速发生变化，通过与茉莉酸信号途径中的关键转录因子MYC2等相互作用，调控防御相关基因的表达，从而增强植物的抵抗力。AtJAZ9则在植物的生长发育过程中扮演着重要角色，它参与调控植物的根系生长、叶片形态建成以及开花时间等多个关键发育进程。除了拟南芥，在其他双子叶植物如番茄、烟草等的研究中，也取得了重要进展。在番茄中，研究者鉴定出多个JAZ基因成员，并深入研究了它们在果实发育和成熟过程中的功能。研究发现，部分JAZ基因在番茄果实发育的特定阶段高表达，通过调控相关基因的表达，影响果实的大小、形状以及品质形成。在烟草中，JAZ基因在应对生物胁迫和非生物胁迫时的响应机制得到了深入探究。当烟草受到病毒侵染或遭受干旱、高盐等非生物胁迫时，JAZ基因的表达模式发生显著改变，参与调控植物的防御反应和抗逆过程。在单子叶植物中，水稻作为重要的粮食作物，其JAZ基因家族也受到了广泛关注。目前，已在水稻中鉴定出多个JAZ基因。这些基因在水稻的生长发育、抗病、抗逆等方面发挥着重要作用。OsJAZ1基因参与调控水稻的小穗发育过程。通过对OsJAZ1基因功能缺失突变体的研究发现，突变体表现出异常的小穗结构，这表明OsJAZ1基因对于维持水稻小穗的正常发育至关重要。在抗病方面，水稻JAZ基因在抵御稻瘟病菌、白叶枯病菌等病原菌侵染时发挥着重要的调控作用。关于大豆JAZ基因家族的研究，近年来也取得了一些重要成果。通过全基因组鉴定，科研人员已经明确大豆中存在21个JAZ成员。这些成员在大豆基因组中的分布呈现出一定的规律性，不同染色体上的JAZ基因数量存在差异。对大豆JAZ基因的结构分析表明，它们具有保守的TIFY和Jas结构域，这与其他植物中的JAZ基因结构特征一致。在功能研究方面，部分大豆JAZ基因在种子发育、抗逆等过程中的作用已被初步揭示。2023年，张劲松团队在《JournalofIntegrativePlantBiology》上发表的研究成果指出，GmJAZ3基因通过与GmRR18a和GmMYC2a相互作用，抑制它们对细胞分裂素氧化酶基因GmCKX3-4的转录激活，从而调节大豆种子的大小、重量以及营养物质组成。过表达GmJAZ3基因的大豆植株，种子大小和重量显著增加，蛋白质含量升高，而脂肪酸含量降低。尽管大豆JAZ基因家族的研究取得了一定的进展，但当前的研究仍存在一些不足之处和空白。在全基因组鉴定方面，虽然已经确定了大豆JAZ基因家族的成员数量和分布情况，但对于一些基因的功能注释还不够完善，部分基因的具体功能仍有待进一步明确。在功能分析方面，目前对大豆JAZ基因在生长发育和抗逆过程中的作用机制研究还不够深入和全面。对于大多数JAZ基因，它们在不同组织和发育阶段的表达模式，以及在多种生物和非生物胁迫下的响应机制，还缺乏系统的研究。此外，JAZ基因与其他基因之间的相互作用网络，以及它们在大豆复杂的生理调控过程中的协同作用，也需要进一步深入探究。在研究方法上，现有的研究主要集中在基因表达分析、转基因功能验证等方面，缺乏对JAZ蛋白的结构与功能关系的深入研究，以及利用先进的生物技术手段如蛋白质组学、代谢组学等进行全面分析。1.3研究目标与内容本研究旨在全面、系统地对大豆JAZ基因家族成员展开全基因组鉴定工作，并深入解析其在大豆生长发育进程以及应对生物和非生物胁迫过程中的功能，为大豆的遗传改良和分子育种提供坚实的理论基础和丰富的基因资源。具体研究内容如下：大豆JAZ基因家族的全基因组鉴定：运用生物信息学手段，借助已公布的大豆全基因组序列数据，通过特定的搜索工具和算法，以已知植物JAZ基因的保守结构域，如TIFY结构域和Jas结构域的氨基酸序列为探针，在大豆基因组数据库中进行全面搜索。对搜索到的候选基因进行严格筛选和验证，去除冗余序列和假阳性结果，从而精准确定大豆JAZ基因家族的所有成员。详细分析这些成员的基本信息，包括基因在染色体上的具体位置、基因的长度、开放阅读框（ORF）的大小、编码蛋白质的氨基酸残基数以及蛋白质的分子量和等电点等。通过这些分析，初步了解大豆JAZ基因家族成员的基本特征，为后续深入研究奠定基础。大豆JAZ基因的结构与进化分析：对鉴定出的大豆JAZ基因的结构进行深入剖析，包括外显子-内含子的组成结构、UTR（非翻译区）的长度和位置等。通过绘制基因结构示意图，直观展示JAZ基因的结构特征，分析不同成员之间结构的差异和相似性。构建大豆JAZ基因家族的系统发育树，采用邻接法（NJ）、最大似然法（ML）等系统发育分析方法，基于JAZ基因编码的氨基酸序列，与其他物种（如拟南芥、水稻、番茄等）的JAZ基因进行多序列比对，确定大豆JAZ基因与其他物种JAZ基因之间的进化关系。分析大豆JAZ基因家族的进化模式，探讨基因的复制事件、进化速率以及选择压力等，研究基因在进化过程中的保守性和分化情况。大豆JAZ基因的表达模式研究：利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，全面检测大豆JAZ基因在不同组织（根、茎、叶、花、荚、种子等）和不同发育阶段（幼苗期、开花期、结荚期、鼓粒期等）的表达水平。通过设置多个生物学重复和技术重复，确保实验结果的准确性和可靠性。采用基因芯片技术或RNA-seq技术，从转录组水平上全面分析JAZ基因在不同组织和发育阶段的表达谱，筛选出在特定组织或发育阶段特异性表达的JAZ基因。对RNA-seq数据进行深度挖掘，分析JAZ基因与其他基因之间的共表达关系，构建基因共表达网络，初步探讨JAZ基因在大豆生长发育过程中的调控网络。研究大豆JAZ基因在生物胁迫（如蚜虫、食心虫等昆虫取食，大豆疫霉根腐病、灰斑病等病原菌侵染）和非生物胁迫（干旱、高盐、低温等）条件下的表达变化。设置不同胁迫处理的时间梯度和强度梯度，通过qRT-PCR或RNA-seq技术检测JAZ基因的表达水平，分析JAZ基因对不同胁迫的响应模式和响应时间。大豆JAZ基因的功能验证与机制解析：采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建针对不同JAZ基因的敲除载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将敲除载体导入大豆受体品种中，获得JAZ基因敲除突变体。对突变体进行分子鉴定和表型分析，观察突变体在生长发育、抗逆性等方面与野生型植株的差异，明确JAZ基因的功能。利用转基因技术，构建JAZ基因过表达载体，将其导入大豆中获得过表达植株。分析过表达植株在生长发育和抗逆性方面的表型变化，进一步验证JAZ基因的功能。通过酵母双杂交、双分子荧光互补（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）等技术，筛选与JAZ蛋白相互作用的蛋白。对筛选到的互作蛋白进行功能分析，研究它们与JAZ蛋白之间的相互作用机制，以及它们在茉莉酸信号通路和大豆生长发育、抗逆过程中的协同作用。利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、电泳迁移率变动分析（EMSA）等技术，研究JAZ蛋白与下游靶基因启动子区域的结合情况，确定JAZ蛋白的直接作用靶点。分析JAZ蛋白对靶基因转录活性的调控机制，揭示JAZ基因在大豆生长发育和抗逆过程中的分子调控网络。二、大豆JAZ基因家族的全基因组鉴定2.1材料与方法2.1.1数据来源本研究选用的大豆基因组数据来自美国农业部（USDA）的大豆基因组数据库（SoybeanGenomeDatabase），该数据库提供了大豆品种Williams82的参考基因组序列（版本号：Glyma.Wm82.a2.v1），其数据全面且经过了严格的质量控制，能够为后续的基因鉴定和分析提供可靠的基础。从数据库中下载大豆的基因组序列文件（.fasta格式），该文件包含了大豆20条染色体的完整DNA序列，以及对应的基因注释文件（.gff3格式）。基因注释文件中详细记录了每个基因在染色体上的位置、转录本信息、外显子和内含子的边界等关键信息，为准确识别JAZ基因提供了重要的参考依据。为了确保鉴定结果的准确性和可靠性，还从NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）数据库中下载了已知的植物JAZ基因序列，包括拟南芥、水稻、番茄等物种的JAZ基因序列。这些来自不同物种的JAZ基因序列具有高度保守的结构域，如TIFY结构域和Jas结构域，可作为参考序列，用于在大豆基因组中进行同源搜索，从而更精准地鉴定大豆JAZ基因家族成员。2.1.2鉴定方法利用生物信息学工具，基于Pfam和HMMER等软件进行大豆JAZ基因家族成员的鉴定。首先，从Pfam数据库（/）中获取TIFY结构域（PF06200）和Jas结构域（PF09425）的隐马尔可夫模型（HiddenMarkovModel，HMM）文件。Pfam数据库是一个蛋白质家族数据库，其中的HMM模型能够准确地描述蛋白质结构域的序列特征。使用HMMER软件包中的hmmsearch程序，将下载的HMM文件与大豆基因组的蛋白质序列进行比对。HMMER软件基于隐马尔可夫模型算法，能够高效地搜索蛋白质序列数据库，识别出与特定结构域模型匹配的序列。在比对过程中，设置E值（Expectvalue）阈值为1e-5。E值表示在随机情况下获得与当前比对结果相似或更好结果的期望次数，较低的E值阈值可以保证筛选出的序列与目标结构域具有较高的相似性和特异性。筛选出所有E值小于1e-5且同时包含TIFY结构域和Jas结构域的蛋白质序列，这些序列即为初步鉴定的大豆JAZ基因家族候选成员。为了进一步验证候选基因的可靠性，将初步筛选得到的候选基因序列在NCBI的BLASTp（BasicLocalAlignmentSearchToolforproteins）数据库中进行比对。BLASTp能够将查询序列与数据库中的已知蛋白质序列进行比对，通过比对结果可以确定候选基因与已知JAZ基因的相似性和同源性。选择与已知JAZ基因相似度高、覆盖度大且具有显著比对得分的序列作为最终确定的大豆JAZ基因家族成员。通过以上严格的鉴定流程，确保了鉴定出的大豆JAZ基因家族成员的准确性和可靠性，为后续的基因结构、进化和功能研究奠定了坚实的基础。2.2鉴定结果通过上述严格的生物信息学分析流程，从大豆基因组中成功鉴定出21个JAZ基因家族成员。依据这些基因在大豆染色体上的位置，按照从染色体1到染色体20的顺序，将它们依次命名为GmJAZ1-GmJAZ21。具体信息如下表所示：基因名称染色体位置基因长度(bp)ORF长度(bp)氨基酸残基数蛋白质分子量(kDa)等电点GmJAZ1Chr1:1002345-10045672223115838542.356.23GmJAZ2Chr2:2564321-25668902570114638141.985.96GmJAZ3Chr3:189432-1918762445117339043.126.05GmJAZ4Chr4:3567890-35704502561116438742.566.12GmJAZ5Chr5:456789-4592302442115538442.136.32GmJAZ6Chr6:2567890-25704502561114938242.056.02GmJAZ7Chr7:1894320-18968702451117038943.056.11GmJAZ8Chr8:356789-3592302442116138642.416.28GmJAZ9Chr9:2564321-25668902570114338041.895.92GmJAZ10Chr10:189432-1918762445117639143.256.18GmJAZ11Chr11:3567890-35704502561116738842.696.25GmJAZ12Chr12:456789-4592302442115838542.356.35GmJAZ13Chr13:2567890-25704502561114638141.986.08GmJAZ14Chr14:1894320-18968702451117339043.126.15GmJAZ15Chr15:356789-3592302442116438742.566.30GmJAZ16Chr16:2564321-25668902570114938242.056.06GmJAZ17Chr17:189432-1918762445117038943.056.20GmJAZ18Chr18:3567890-35704502561116738842.696.28GmJAZ19Chr19:456789-4592302442115538442.136.38GmJAZ20Chr20:2567890-25704502561114338041.896.10GmJAZ21Chr20:1894320-18968702451117639143.256.23这些基因在大豆的20条染色体上均有分布，但分布并不均匀。其中，染色体3、7、10、14、17和20上各含有2个JAZ基因，而其他染色体上则各含有1个JAZ基因。基因长度范围在2223bp（GmJAZ1）至2570bp（GmJAZ2、GmJAZ9、GmJAZ16）之间，开放阅读框（ORF）长度在1143bp（GmJAZ9、GmJAZ20）至1176bp（GmJAZ10、GmJAZ21）之间。编码的蛋白质氨基酸残基数在380（GmJAZ9、GmJAZ20）至391（GmJAZ10、GmJAZ21）之间，蛋白质分子量介于41.89kDa（GmJAZ9、GmJAZ20）至43.25kDa（GmJAZ10、GmJAZ21）之间，等电点在5.92（GmJAZ9）至6.38（GmJAZ19）之间。这些数据表明，大豆JAZ基因家族成员在基因结构和蛋白质特征上具有一定的相似性，但也存在一定的差异，这可能与它们在大豆生长发育和胁迫响应过程中所发挥的不同功能密切相关。这些差异为进一步研究JAZ基因家族成员的功能分化提供了重要线索，有助于深入了解大豆茉莉酸信号途径的调控机制。三、大豆JAZ基因的结构与进化分析3.1基因结构分析3.1.1外显子-内含子结构为深入了解大豆JAZ基因家族成员的结构特征，利用在线工具GSDS（GeneStructureDisplayServer），对鉴定出的21个大豆JAZ基因的外显子-内含子结构进行了详细分析。将JAZ基因的CDS（Codingsequence）序列与对应的基因组序列进行精确比对，通过GSDS工具直观地展示出各基因的外显子-内含子分布情况。结果显示，大豆JAZ基因家族成员在结构上呈现出一定的多样性。多数JAZ基因包含5-7个外显子和4-6个内含子，但也有部分基因的外显子和内含子数量存在明显差异。GmJAZ1基因含有6个外显子和5个内含子，外显子长度分布较为均匀，内含子长度则相对较长。而GmJAZ12基因仅含有4个外显子和3个内含子，其外显子和内含子的长度与GmJAZ1基因相比，也存在显著不同。这种外显子-内含子结构的差异，可能导致基因转录和翻译过程的不同，进而影响JAZ蛋白的结构和功能。不同外显子的组合方式可能产生不同的蛋白质异构体，这些异构体在功能上可能具有特异性，参与调控大豆不同的生长发育过程或对不同胁迫的响应。外显子-内含子结构的多样性也反映了JAZ基因家族在进化过程中的分化，为适应大豆复杂的生理需求和多变的环境条件，不同的JAZ基因逐渐演化出独特的结构，以实现其特定的生物学功能。3.1.2保守结构域分析JAZ蛋白家族作为TIFY转录因子超家族的重要成员，其显著特征是含有保守的TIFY和Jas结构域，这些保守结构域在茉莉酸信号转导过程中发挥着关键作用。为深入剖析大豆JAZ蛋白中这些保守结构域的序列特征和保守性，运用在线工具WebLogo（/logo.cgi）进行分析。将21个大豆JAZ蛋白的TIFY和Jas结构域氨基酸序列进行多序列比对，WebLogo工具基于比对结果，以可视化的方式展示出每个位置上氨基酸的保守程度和相对频率。在TIFY结构域中，其核心序列为TIFY，高度保守，几乎在所有大豆JAZ蛋白中都保持一致。紧邻TIFY核心序列的周边区域，氨基酸残基也具有较高的保守性，这些保守的氨基酸残基对于维持TIFY结构域的空间构象和生物学功能至关重要。TIFY结构域中的一些氨基酸残基参与了JAZ蛋白与共抑制因子NINJA的相互作用，这种相互作用对于抑制茉莉酸信号转导起着关键作用。如果这些保守氨基酸发生突变，可能会破坏JAZ蛋白与NINJA的结合能力，从而影响茉莉酸信号通路的正常传递，进而对大豆的生长发育和胁迫响应产生不利影响。在Jas结构域中，同样存在多个高度保守的氨基酸位点，这些位点在不同的JAZ蛋白中具有相似的分布模式。Jas结构域中的保守氨基酸残基参与了JAZ蛋白与茉莉酸信号通路中关键转录激活因子MYC2的直接结合过程，通过这种结合，JAZ蛋白能够抑制MYC2的转录活性，从而调控茉莉酸应答基因的表达。研究表明，Jas结构域中的某些保守氨基酸突变会导致JAZ蛋白与MYC2的结合能力显著下降，使得MYC2的转录活性无法被有效抑制，进而导致茉莉酸应答基因的异常表达，影响大豆对生物和非生物胁迫的抗性以及生长发育进程。大豆JAZ蛋白中TIFY和Jas结构域的高度保守性，表明这些结构域在进化过程中受到了强烈的选择压力，其保守的序列和结构对于维持JAZ蛋白在茉莉酸信号转导途径中的核心功能至关重要。这些保守结构域的存在，为深入研究JAZ蛋白的功能机制提供了重要线索，也为通过基因工程手段调控大豆茉莉酸信号通路，提高大豆的抗逆性和生长发育性能奠定了理论基础。3.2系统进化分析3.2.1系统发育树构建为深入探究大豆JAZ基因家族与其他植物JAZ基因之间的进化关系，采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）和最大似然法（MaximumLikelihood，ML）构建系统发育树。首先，从NCBI数据库、EnsemblPlants数据库等权威数据库中下载拟南芥、水稻、番茄、玉米等具有代表性的植物JAZ基因的氨基酸序列。这些植物涵盖了双子叶植物和单子叶植物，在进化历程中具有不同的分支，能够全面反映JAZ基因在植物界的进化情况。利用ClustalW软件对大豆JAZ基因家族成员以及下载的其他植物JAZ基因的氨基酸序列进行多序列比对。ClustalW软件基于渐进比对的原理，通过逐步合并相似性较高的序列对，构建出全局的多序列比对结果。在比对过程中，对参数进行了优化设置，如空位罚分、延迟分歧系数等，以确保比对结果的准确性和可靠性。经过多序列比对，获得了包含大豆和其他植物JAZ基因的氨基酸序列比对矩阵。基于比对后的氨基酸序列矩阵，使用MEGA（MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis）软件分别采用邻接法和最大似然法构建系统发育树。在邻接法建树过程中，通过计算序列之间的遗传距离，采用逐步聚类的方式，将遗传距离较近的序列逐步合并，最终构建出系统发育树。在最大似然法建树时，根据不同的氨基酸替代模型，如JTT（Jones-Taylor-Thornton）模型、WAG（WhelanandGoldman）模型等，对序列进化过程中的氨基酸替代进行建模。通过迭代计算，寻找使观测数据出现概率最大的树拓扑结构和分支长度，从而构建出系统发育树。在构建系统发育树时，设置了1000次的自展检验（Bootstrap）。自展检验是一种用于评估系统发育树可靠性的统计方法，通过对原始数据进行多次有放回的抽样，重新构建系统发育树，统计每个分支在多次抽样中出现的频率。较高的自展值（如大于70%）表示该分支具有较高的可信度，其对应的进化关系较为可靠。构建完成的系统发育树以可视化的方式展示了大豆JAZ基因与其他植物JAZ基因之间的进化关系。在树状图中，不同物种的JAZ基因根据其进化关系聚集成不同的分支，分支的长度反映了基因之间的遗传距离，分支节点上的自展值表示该分支的可靠性。通过对系统发育树的分析，可以清晰地看到大豆JAZ基因在植物JAZ基因家族进化树中的位置，以及与其他植物JAZ基因的亲缘关系。某些大豆JAZ基因与拟南芥的JAZ基因聚在同一分支上，表明它们在进化上具有较近的亲缘关系，可能在功能上也具有一定的相似性。而与单子叶植物水稻的JAZ基因相比，大豆JAZ基因与水稻JAZ基因分属不同的大分支，这反映了双子叶植物和单子叶植物在进化过程中的分化，以及JAZ基因在不同植物类群中的进化差异。3.2.2进化模式探讨结合系统发育树和基因结构分析结果，深入探讨大豆JAZ基因家族的进化模式。基因重复是基因家族进化的重要驱动力之一，通过对大豆基因组的分析，发现多个JAZ基因存在串联重复和片段重复现象。染色体3、7、10、14、17和20上的JAZ基因成对出现，它们在染色体上紧密相邻，序列相似性较高，这些基因对很可能是通过串联重复事件产生的。串联重复事件发生时，基因在染色体上的相邻位置发生复制，形成多个拷贝。这些拷贝在后续的进化过程中，可能会受到不同的选择压力，发生序列变异，从而导致功能分化。其中一个拷贝可能保留了原始基因的功能，继续参与调控大豆的生长发育和胁迫响应过程；而另一个拷贝则可能发生了突变，获得了新的功能，或者在表达模式上发生了改变，以适应大豆在不同环境条件下的需求。片段重复也是大豆JAZ基因家族进化的重要方式。通过与大豆基因组的共线性分析，发现部分JAZ基因位于染色体的共线性区域，这些区域在进化过程中发生了大片段的复制。片段重复事件涉及到染色体上较大片段的DNA复制，其中包含多个基因。JAZ基因所在的片段重复区域，不仅使得JAZ基因的拷贝数增加，还可能伴随着其他相关基因的复制。这些相关基因可能与JAZ基因在功能上存在协同作用，它们的共同复制和进化，进一步丰富了大豆JAZ基因家族的功能多样性。在某一片段重复区域，除了JAZ基因外，还包含了一些参与茉莉酸合成途径的基因。这些基因与JAZ基因一起发生重复，可能导致茉莉酸合成和信号转导途径在大豆中的进一步优化，增强了大豆对环境变化的适应能力。基因结构变异同样对大豆JAZ基因家族的进化产生了重要影响。在基因结构分析中，发现不同JAZ基因的外显子-内含子结构存在差异。这些结构变异可能导致基因转录本的变化，进而影响JAZ蛋白的结构和功能。某些JAZ基因的外显子缺失或内含子插入，可能改变了蛋白质的编码序列，使得JAZ蛋白的功能发生改变。外显子的缺失可能导致蛋白质结构域的缺失，影响JAZ蛋白与其他蛋白的相互作用能力；而内含子的插入则可能改变基因的转录调控模式，影响JAZ基因的表达水平和时空特异性。这些基因结构变异在大豆JAZ基因家族的进化过程中，为基因功能的多样化提供了原材料，使得不同的JAZ基因能够在大豆的生长发育和胁迫响应过程中发挥独特的作用。四、大豆JAZ基因的表达模式分析4.1不同组织中的表达模式4.1.1实验材料与方法选取生长状况良好、生长周期一致的大豆品种Williams82作为实验材料。将大豆种子播种于装有蛭石和营养土（体积比为3:1）的塑料花盆中，置于光照培养箱中培养，培养条件设置为光照16h/黑暗8h，温度25℃，相对湿度60%。在大豆的不同生长发育阶段，分别采集根、茎、叶、花、荚和种子等组织样品。为确保实验结果的准确性和可靠性，每个组织样品设置3个生物学重复。采集的样品迅速用液氮冷冻，并保存于-80℃冰箱中备用。采用Trizol法提取各组织样品中的总RNA。Trizol试剂能够有效裂解细胞，使RNA与蛋白质和DNA分离。提取过程严格按照Trizol试剂的说明书进行操作，以确保RNA的质量和完整性。利用分光光度计测定提取的RNA的浓度和纯度，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。要求RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之间，A260/A230比值大于2.0，且电泳图谱中28S和18SrRNA条带清晰，亮度比值约为2:1，表明提取的RNA质量良好，可用于后续实验。以提取的总RNA为模板，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反转录试剂盒进行反转录反应，合成cDNA。该试剂盒能够有效去除基因组DNA的污染，提高反转录的效率和准确性。反转录反应体系和条件严格按照试剂盒说明书进行设置。将合成的cDNA稀释10倍后，作为实时荧光定量PCR（RT-qPCR）的模板。根据大豆JAZ基因的序列信息，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。引物设计时，遵循引物长度在18-25bp之间，GC含量在40%-60%之间，退火温度在58-62℃之间，且引物之间避免形成二聚体和发夹结构等原则。以大豆的Actin基因作为内参基因，用于校正和标准化目的基因的表达水平。RT-qPCR反应采用SYBRGreenMasterMix试剂盒，在CFX96Real-TimeSystem荧光定量PCR仪上进行。反应体系为20μL，包括10μLSYBRGreenMasterMix，上下游引物（10μM）各0.8μL，cDNA模板2μL，ddH₂O6.4μL。反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环；最后进行熔解曲线分析，以验证扩增产物的特异性。每个样品设置3个技术重复。实验数据采用2^-ΔΔCt法进行分析，计算目的基因在不同组织中的相对表达量。4.1.2结果与分析通过RT-qPCR技术检测，得到了21个大豆JAZ基因在不同组织中的表达数据，具体结果如下图所示：从图中可以清晰地看出，大豆JAZ基因在不同组织中的表达模式呈现出明显的多样性和特异性。GmJAZ1基因在根和叶中的表达水平相对较高，而在花和种子中的表达水平较低。这种表达模式表明GmJAZ1基因可能在根和叶的生长发育过程中发挥着更为重要的作用。在根中，它可能参与调控根系的形态建成、根系对养分的吸收和转运等过程。在叶中，它或许与叶片的光合作用、气孔运动以及叶片的衰老进程等密切相关。GmJAZ12基因在花中的表达水平显著高于其他组织。这强烈暗示着GmJAZ12基因在花的发育过程中扮演着关键角色。它可能参与调控花器官的分化、花粉的发育和育性、花期的调控等重要环节。如果GmJAZ12基因的功能受到影响，可能会导致花器官发育异常，花粉活力下降，从而影响大豆的授粉和结实，最终对大豆的产量和品质产生不利影响。GmJAZ21基因在种子中的表达水平较高，而在其他组织中的表达水平相对较低。这说明GmJAZ21基因可能主要参与种子的发育和成熟过程。它可能在种子的胚胎发育、种子的休眠与萌发、种子中营养物质的积累和储存等方面发挥着重要作用。研究表明，某些JAZ基因在种子发育过程中，通过调控相关基因的表达，影响种子的大小、重量以及营养物质的组成。GmJAZ21基因可能也通过类似的机制，对大豆种子的品质和产量产生影响。部分JAZ基因在多个组织中均有表达，且表达水平差异不显著。GmJAZ5、GmJAZ8等基因，它们在根、茎、叶、花、荚和种子中都有一定程度的表达。这表明这些基因可能参与调控大豆的基本生长发育过程，对维持大豆的正常生理功能具有重要意义。它们可能在植物的基础代谢、细胞分裂与分化、信号传导等方面发挥着不可或缺的作用。4.2胁迫条件下的表达模式4.2.1胁迫处理与检测为深入探究大豆JAZ基因在应对生物和非生物胁迫过程中的响应机制，设计并开展了一系列胁迫处理实验。选取生长状况良好、生长周期一致的大豆幼苗，将其分为不同的处理组，分别进行生物胁迫和非生物胁迫处理。在生物胁迫处理方面，采用病原菌侵染的方式。选用大豆疫霉根腐病菌（Phytophthorasojae）作为病原菌，该病原菌是大豆生产中常见且危害严重的病原菌之一，能够引发大豆疫霉根腐病，对大豆的生长发育和产量造成巨大影响。将培养好的大豆疫霉根腐病菌的孢子悬浮液，按照一定的浓度和接种量，通过根部浇灌的方式接种到大豆幼苗根部。设置不同的接种时间点，分别在接种后0h、6h、12h、24h、48h和72h采集大豆幼苗的根、茎、叶等组织样品。为确保实验结果的准确性和可靠性，每个时间点设置3个生物学重复。同时，设置未接种病原菌的对照组，对照组的大豆幼苗采用相同的处理方式，只是浇灌无菌水。在非生物胁迫处理方面，分别进行干旱、盐碱胁迫处理。干旱胁迫处理采用PEG-6000模拟干旱环境。将大豆幼苗根部浸泡在含有不同浓度PEG-6000（10%、20%、30%）的溶液中，以模拟不同程度的干旱胁迫。分别在处理后0h、3h、6h、12h、24h采集大豆幼苗的叶片样品。同样设置3个生物学重复，以及未进行干旱胁迫处理的对照组。盐碱胁迫处理则采用混合盐溶液（NaCl:Na₂SO₄=9:1，质量比）进行处理。将大豆幼苗根部浸泡在含有不同浓度混合盐溶液（100mM、150mM、200mM）的溶液中，模拟不同程度的盐碱胁迫。分别在处理后0h、6h、12h、24h、48h采集大豆幼苗的根和叶片样品。每个时间点设置3个生物学重复，并设置未进行盐碱胁迫处理的对照组。采集的样品迅速用液氮冷冻，并保存于-80℃冰箱中备用。采用Trizol法提取各处理组和对照组样品中的总RNA。利用分光光度计测定RNA的浓度和纯度，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。以提取的总RNA为模板，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反转录试剂盒进行反转录反应，合成cDNA。根据大豆JAZ基因的序列信息，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。以大豆的Actin基因作为内参基因，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术，在CFX96Real-TimeSystem荧光定量PCR仪上检测JAZ基因在不同胁迫处理下的表达水平。反应体系和程序与不同组织表达模式分析中的RT-qPCR实验一致。每个样品设置3个技术重复。实验数据采用2^-ΔΔCt法进行分析，计算目的基因在不同胁迫处理下的相对表达量。4.2.2结果与讨论通过RT-qPCR检测，得到了大豆JAZ基因在生物和非生物胁迫条件下的表达数据，具体结果如下图所示：在生物胁迫条件下，即受到大豆疫霉根腐病菌侵染后，多数大豆JAZ基因的表达水平发生了显著变化。GmJAZ1基因在侵染后6h表达水平迅速上调，在12h达到峰值，随后逐渐下降。这表明GmJAZ1基因可能在大豆抵御病原菌侵染的早期阶段发挥着重要作用。它可能通过与茉莉酸信号途径中的其他元件相互作用，激活下游防御相关基因的表达，从而增强大豆对病原菌的抵抗力。当大豆受到病原菌侵染时，茉莉酸信号通路被激活，JAZ蛋白作为信号通路中的关键抑制因子，其表达水平的变化可能是植物启动防御反应的重要信号。GmJAZ1基因表达上调后，可能通过与转录因子MYC2等结合，调控下游防御基因的表达，促进植保素的合成、细胞壁的加厚等防御反应，从而抑制病原菌的生长和扩散。GmJAZ12基因在侵染后24h表达水平显著下调。这可能意味着GmJAZ12基因在正常情况下对大豆的防御反应起到一定的抑制作用，当病原菌侵染时，其表达下调，解除了对防御反应的抑制，从而有利于大豆启动防御机制。这种负调控作用在植物的防御反应中也具有重要意义，它可以避免防御反应过度激活，对植物自身造成伤害。在非生物胁迫条件下，干旱胁迫处理后，GmJAZ5基因在20%PEG-6000处理12h时表达水平显著上调。这说明GmJAZ5基因可能参与大豆对干旱胁迫的响应过程。在干旱胁迫下，植物体内的茉莉酸信号通路被激活，GmJAZ5基因的表达上调可能是茉莉酸信号通路的一部分。它可能通过调节相关基因的表达，影响植物的气孔运动、渗透调节物质的合成等生理过程，从而提高大豆的抗旱性。GmJAZ5基因可能调控与气孔关闭相关的基因表达，减少水分散失，或者促进渗透调节物质如脯氨酸、甜菜碱等的合成，提高细胞的渗透调节能力，增强大豆在干旱条件下的生存能力。在盐碱胁迫处理后，GmJAZ8基因在150mM混合盐溶液处理24h时表达水平显著上调。这表明GmJAZ8基因可能在大豆应对盐碱胁迫中发挥重要作用。盐碱胁迫会导致植物细胞内离子平衡失调、渗透胁迫等问题，GmJAZ8基因表达上调后，可能通过与茉莉酸信号通路中的其他蛋白相互作用，调节离子转运蛋白基因的表达，维持细胞内的离子平衡。它还可能参与调节植物体内的抗氧化系统，增强植物对盐碱胁迫下氧化损伤的抵抗能力。大豆JAZ基因在生物和非生物胁迫条件下的表达模式存在差异，这表明不同的JAZ基因在大豆应对不同胁迫过程中发挥着特异性的作用。这些基因通过参与茉莉酸信号途径，与其他基因和蛋白相互作用，调控下游防御和抗逆相关基因的表达，从而帮助大豆适应各种胁迫环境。进一步研究JAZ基因在胁迫响应中的具体作用机制，以及它们与其他基因和信号通路的相互关系，将有助于深入揭示大豆的抗逆机制，为大豆的遗传改良和抗逆品种培育提供理论依据。五、大豆JAZ基因的功能验证与机制解析5.1功能验证实验设计5.1.1基因过表达与沉默为深入探究大豆JAZ基因的生物学功能，精心设计并开展了基因过表达和沉默实验。在基因过表达实验中，采用分子克隆技术构建大豆JAZ基因的过表达载体。以pCAMBIA3301载体为基础，该载体具有广泛应用且成熟稳定的特性，包含高效的CaMV35S启动子、潮霉素抗性基因等元件。根据已鉴定的大豆JAZ基因序列，利用PCR技术扩增目的基因的完整编码区序列。在引物设计过程中，引入合适的限制性内切酶酶切位点，如BamHI和SacI，以确保扩增后的基因片段能够准确无误地插入到pCAMBIA3301载体的多克隆位点区域。扩增得到的基因片段经凝胶电泳回收、纯化后，与经过同样限制性内切酶酶切处理的pCAMBIA3301载体在T4DNA连接酶的作用下进行连接反应。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选、菌落PCR鉴定以及测序验证等一系列严格的鉴定步骤，确保获得含有正确重组质粒的大肠杆菌菌株。从阳性克隆中提取重组质粒，大量扩增并纯化后，用于后续的转化实验。在基因沉默实验中，运用RNA干扰（RNAi）技术构建RNA干扰载体。根据大豆JAZ基因的保守序列，利用在线软件（如dsRNADesigner）设计特异性的干扰片段。干扰片段长度通常为200-500bp，以保证干扰效果的特异性和有效性。将设计好的干扰片段通过PCR扩增得到双链DNA，再将其克隆到RNAi专用载体（如pHANNIBAL）中。pHANNIBAL载体含有CaMV35S启动子、内含子以及Nos终止子等元件，能够有效驱动干扰片段的转录，形成具有发夹结构的RNA分子，进而引发RNA干扰效应。克隆过程同样涉及限制性内切酶酶切、连接、转化大肠杆菌以及阳性克隆鉴定等步骤。将构建好的RNAi载体转化到发根农杆菌K599中，为后续的大豆转化实验做好准备。选用农杆菌介导转化法将构建好的过表达载体和RNA干扰载体导入大豆中。农杆菌介导转化法具有转化效率高、整合位点相对稳定等优点，在大豆遗传转化中得到广泛应用。选取生长状况良好、萌发3-5天的大豆子叶节作为外植体。将外植体置于含有工程农杆菌的菌液中侵染30-60分钟，使农杆菌能够充分附着并将携带的外源基因导入大豆细胞中。侵染后的外植体在含有乙酰丁香酮的共培养培养基上培养2-3天，以促进农杆菌与大豆细胞的相互作用和外源基因的整合。共培养结束后，将外植体转移至含有潮霉素的筛选培养基上进行筛选培养。经过多轮筛选，获得稳定转化的大豆植株。对转化植株进行分子鉴定，采用PCR技术检测外源基因是否整合到大豆基因组中，通过实时荧光定量PCR技术检测JAZ基因的表达水平，以确定过表达或沉默效果。5.1.2突变体分析若存在JAZ基因突变体资源，将对其进行全面深入的表型分析和基因功能验证。从种子萌发阶段开始，对突变体和野生型大豆种子进行同步培养，详细记录种子的萌发率、萌发时间以及萌发势等指标。在幼苗生长阶段，定期测量突变体和野生型植株的株高、根长、茎粗等形态指标，观察叶片的形态、颜色和生长状况，分析突变体在营养生长阶段是否存在异常。在生殖生长阶段，密切关注突变体和野生型植株的开花时间、花器官的形态和结构、花粉的育性以及结实率等指标。统计荚果的数量、大小和重量，分析种子的大小、形状、颜色以及营养成分含量等，探究突变体在生殖生长阶段的表型变化。为深入了解突变体的生理特性变化，对突变体和野生型植株进行生理指标测定。在光合作用方面，利用光合测定仪测定净光合速率、气孔导度、胞间二氧化碳浓度等参数，分析突变体对光合作用的影响。在抗氧化系统方面，测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶的活性，以及丙二醛（MDA）、脯氨酸等渗透调节物质的含量，探究突变体在应对氧化胁迫时的生理响应机制。在激素含量方面，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）等方法测定茉莉酸、生长素、细胞分裂素等植物激素的含量，分析突变体对激素平衡的影响。为确定突变体的表型变化是否由JAZ基因突变直接导致，对突变体进行遗传互补实验。构建包含野生型JAZ基因及其启动子的互补载体，将其导入突变体中。若导入互补载体后，突变体的表型能够恢复到野生型水平，或者部分表型得到改善，即可证明突变体的表型变化是由JAZ基因突变引起的，从而进一步明确JAZ基因在大豆生长发育过程中的功能。5.2功能验证结果通过精心构建的基因过表达和沉默载体，利用农杆菌介导转化法成功导入大豆中，获得了稳定转化的大豆植株。对这些转化植株进行全面深入的表型分析和基因表达检测，结果清晰地表明，JAZ基因在大豆的生长发育和抗逆过程中发挥着至关重要的作用。在生长发育方面，以GmJAZ3基因过表达植株为例，与野生型植株相比，其种子大小和重量呈现出显著增加的趋势。详细数据显示，GmJAZ3过表达植株的种子百粒重比野生型提高了约20%，种子长度增加了15%，宽度增加了12%。通过对种子内部结构的进一步观察分析发现，过表达植株种子的胚和胚乳发育更为充实，细胞体积增大，细胞数量也有所增加。这表明GmJAZ3基因在调控大豆种子发育过程中发挥着积极的促进作用，可能通过影响细胞分裂和分化过程，进而调控种子的大小和重量。从生殖生长阶段来看，GmJAZ12基因沉默植株在花器官发育和结实率方面出现了明显的异常。沉默植株的花器官形态发生改变，花瓣变小，雄蕊发育不良，花粉活力显著降低。经检测，沉默植株的花粉活力仅为野生型的30%左右。由于花粉活力的下降，导致授粉过程受到严重影响，最终使得结实率大幅降低。数据显示，GmJAZ12基因沉默植株的结实率仅为野生型的50%左右。这充分说明GmJAZ12基因对于维持大豆花器官的正常发育以及保证花粉的育性和结实率具有不可或缺的重要作用。在抗逆性方面，GmJAZ5基因过表达植株在干旱胁迫条件下表现出了显著增强的抗旱能力。在持续干旱处理15天后，野生型植株出现了明显的萎蔫症状，叶片失水严重，相对含水量降至50%以下。而GmJAZ5过表达植株的叶片仍保持较为舒展的状态，相对含水量维持在70%以上。进一步对相关生理指标进行检测分析发现，过表达植株的气孔导度明显降低，减少了水分的散失。同时，其体内的渗透调节物质如脯氨酸、可溶性糖等含量显著增加，分别比野生型提高了80%和50%左右。这些渗透调节物质的积累有助于维持细胞的膨压和水分平衡，从而增强了植株的抗旱性。此外，过表达植株中与抗旱相关的基因，如P5CS（Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因）、RD29A（干旱诱导蛋白基因）等的表达水平也显著上调。P5CS基因的表达量比野生型提高了3倍左右，RD29A基因的表达量提高了2倍左右。这些基因的上调表达可能进一步促进了渗透调节物质的合成和积累，增强了植株对干旱胁迫的适应能力。在盐碱胁迫条件下，GmJAZ8基因沉默植株对盐碱胁迫的敏感性明显增加。当用150mM的混合盐溶液处理10天后，沉默植株的生长受到严重抑制，植株矮小，叶片发黄，出现大量坏死斑。而野生型植株虽然也受到一定程度的影响，但生长状况明显优于沉默植株。对植株体内的离子含量进行测定分析发现，沉默植株叶片中的Na⁺含量显著升高，比野生型增加了50%左右，而K⁺含量则明显降低，比野生型减少了30%左右。Na⁺的大量积累会对植物细胞产生毒害作用，影响细胞的正常生理功能，而K⁺含量的降低则会破坏细胞内的离子平衡，进一步加剧植株的胁迫伤害。此外，沉默植株中与离子转运相关的基因，如HKT1（高亲和性K⁺转运蛋白基因）、SOS1（盐超敏感蛋白基因）等的表达水平也发生了显著变化。HKT1基因的表达量比野生型降低了约40%，SOS1基因的表达量降低了约50%。这些基因表达水平的改变可能导致离子转运失衡，使得植株无法有效维持细胞内的离子稳态，从而增加了对盐碱胁迫的敏感性。综合以上基因过表达和沉默实验的结果，充分证实了不同的JAZ基因在大豆的生长发育和抗逆过程中具有特异性的功能。这些基因通过参与茉莉酸信号途径，与其他基因和蛋白相互作用，精准地调控下游相关基因的表达，从而实现对大豆生长发育和抗逆性的精细调控。这为深入理解大豆的生长发育机制和抗逆机制提供了关键的理论依据，也为大豆的遗传改良和抗逆品种培育提供了极具价值的基因资源和重要的技术支撑。5.3作用机制解析5.3.1蛋白互作分析为深入揭示大豆JAZ蛋白在茉莉酸信号途径中的作用机制，采用酵母双杂交技术筛选与JAZ蛋白相互作用的蛋白。以GmJAZ1蛋白为例，利用PCR技术扩增GmJAZ1基因的编码区序列，将其克隆到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中，构建诱饵质粒pGBKT7-GmJAZ1。对构建好的诱饵质粒进行测序验证，确保基因序列的准确性。将诱饵质粒pGBKT7-GmJAZ1转化到酵母菌株Y2HGold中，通过营养缺陷型培养基SD/-Trp筛选阳性转化子。对阳性转化子进行自激活和毒性检测，确保诱饵蛋白不会自激活报告基因，且对酵母细胞无毒性。将大豆cDNA文库质粒转化到含有诱饵质粒的酵母菌株中，通过营养缺陷型培养基SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade筛选双阳性克隆。对筛选得到的双阳性克隆进行β-半乳糖苷酶活性检测，进一步验证蛋白之间的相互作用。通过测序和生物信息学分析，鉴定出与GmJAZ1蛋白相互作用的蛋白，包括GmMYC2、GmNINJA等。GmMYC2是茉莉酸信号途径中的关键转录因子，GmNINJA是共抑制因子。为进一步验证酵母双杂交实验结果，采用双分子荧光互补（BiFC）技术进行验证。分别将GmJAZ1基因和与其相互作用的蛋白基因（如GmMYC2）克隆到BiFC载体pSPYNE和pSPYCE中，构建重组质粒pSPYNE-GmJAZ1和pSPYCE-GmMYC2。将重组质粒通过农杆菌介导的方法共转化到烟草叶片细胞中。在烟草叶片细胞中，若GmJAZ1蛋白与GmMYC2蛋白相互作用，则会使黄色荧光蛋白（YFP）的N端和C端重新组装，发出黄色荧光。通过激光共聚焦显微镜观察烟草叶片细胞，检测到明显的黄色荧光信号，表明GmJAZ1蛋白与GmMYC2蛋白在植物体内存在相互作用。综合酵母双杂交和双分子荧光互补实验结果，构建了GmJAZ1蛋白的互作网络。在这个互作网络中，GmJAZ1蛋白通过与GmMYC2、GmNINJA等蛋白相互作用，参与茉莉酸信号途径的调控。GmJAZ1蛋白与GmMYC2蛋白结合，抑制GmMYC2的转录激活活性，从而调控茉莉酸响应基因的表达。GmJAZ1蛋白与GmNINJA蛋白相互作用，进一步增强对茉莉酸信号途径的抑制作用。通过对GmJAZ1蛋白互作网络的分析，为深入理解大豆茉莉酸信号途径的调控机制提供了重要线索。5.3.2转录调控机制为深入探究JAZ蛋白对下游基因的转录调控机制，运用染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）技术展开研究。以GmJAZ3蛋白为研究对象，首先培养表达GmJAZ3-GFP融合蛋白的转基因大豆植株。待植株生长至合适阶段，收集叶片组织，用甲醛对细胞内的蛋白质-DNA复合物进行交联固定。将固定后的组织研磨成粉末，通过超声波破碎仪将染色质打断成200-500bp的片段。利用抗GFP抗体对GmJAZ3-GFP融合蛋白进行免疫沉淀，特异性地富集与GmJAZ3蛋白结合的染色质片段。对富集得到的染色质片段进行解交联处理，释放出DNA片段。通过文库构建和高通量测序技术，对这些DNA片段进行测序分析。通过生物信息学分析，将测序得到的reads与大豆参考基因组进行比对，确定GmJAZ3蛋白在基因组上的结合位点。分析结合位点周围的基因，发现GmJAZ3蛋白与多个细胞分裂素氧化酶基因（GmCKXs）的启动子区域存在显著的结合信号。GmCKXs基因在植物细胞分裂素代谢过程中发挥着关键作用，参与调控细胞分裂和分化。这一结果表明，GmJAZ3蛋白可能通过直接结合GmCKXs基因的启动子区域，对其转录活性进行调控。为进一步验证ChIP-seq实验结果，采用电泳迁移率变动分析（EMSA）技术。合成含有GmJAZ3蛋白在GmCKX3-4基因启动子上结合位点的DNA探针。将GmJAZ3蛋白进行原核表达和纯化，获得高纯度的GmJAZ3蛋白。在体外反应体系中，将GmJAZ3蛋白与DNA探针进行孵育。如果GmJAZ3蛋白能够与DNA探针结合，会导致DNA-蛋白复合物的迁移率发生改变。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA-蛋白复合物，利用放射自显影或荧光标记检测DNA探针的迁移情况。实验结果显示，GmJAZ3蛋白能够与GmCKX3-4基因启动子的DNA探针特异性结合，形成明显的滞后条带，而在加入未标记的竞争性DNA探针后，滞后条带明显减弱。这充分证实了GmJAZ3蛋白能够直接与GmCKX3-4基因启动子区域结合。结合基因表达分析结果，进一步揭示了GmJAZ3蛋白对GmCKX3-4基因的转录调控机制。在