牛羊炭疽病诊断技术征求意见稿

3牛羊炭疽病诊断技术本文件规定了牛羊炭疽病的临床诊断、病原分离与鉴定、PCR检测方法、实时荧光PCR检测方法、NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范4缩略语BHQ1：淬灭剂（BlackHoleQuencher®)Ct值：在荧光定量PCR反应中，每个反应管中荧光信号量达到所设定的阈值经历的循环数（CycleDNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicaciFAM：6-羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein）PBS：磷酸盐缓冲液(PhosphatebufferedsalinPCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReactioqPCR：实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePolymeraseChainReacTaq：水生栖热菌（Thermusaquati45.1.2平衡盐溶液，配制方法按照A5.2采样工具5.2.1器械:解剖刀、剪刀、镊子、注射器及针头。5.2.5其他:无菌棉拭子、医用棉签、医用纱布、封口膜、冰袋等。5.3样品采集与处理5.3.1疑似炭疽患病动物病料样本采集5.3.2疑似炭疽死亡动物病料样本采集5.3.3血清样品5.4样品运输与保存对于采集样本24h内可送达实验室的，可放在4℃左右的容器中冷藏保存运输；对于不能在24h运6.2.51.5%琼脂糖凝胶，配制方法按B.2。6.2.7细菌DNA提取试剂，配制方法按B.3。6.2.8炭疽芽孢杆菌阳性对照，含有Pag（炭疽芽孢杆菌保护性抗原）基7.4.2将液体吸入吸附柱中，107.4.5弃去收集管中液体，10000r/min离心2min，以除去残留的洗涤液。r/min离心30s，无菌离心管中9.1主要仪器和设备9.2主要试剂和材料79.2.2商品化2×实时荧光定量PCR预混液（2×PCRmastermix）。小Pag-R9.6判定方法9.6.1试验成立条件：阳性对照有特异性扩增曲线且Ct值<30，阴性对照无Ct值或阴性对照Ct值>409.6.3被检样品无Ct值或10.1.2微量酶标反应板。10.1.7微量板振荡器。湿盒内放37℃培养箱中工作60min，再放置4℃冰箱内过夜。910.3.3封闭：每孔加入封闭液100μL封板后置室温孵育30min～90min。），10.3.6盖上微量板，置室温孵育30min～90min。10.3.9盖上微量板，置室温（23℃±5℃)孵育30min～90min。（ODpos/ODneg）的比值大于3。计算待测血清以及阳性和阴性对照血清的平均吸光值[待检血清平均OD值(ODs)、阳性血清平均OD值(ODpos)和阴性血清平均OD值(ODneg)]。按式(1)计算每份血清的S/P(%)。当S/P<30%，判为抗体阴性；当S/P在30%～40%之间，判为可疑，对于可疑血清，需要重新检验，如重新检验结果仍为30%～40%之间，则判定为抗体阳性；当S/P>40%，判为抗体阳性。对于市售商品化试剂盒，可根据试剂盒说明书判定。11.1炭疽芽孢杆菌疑似感染的牛羊物，且经第8条和第9条中任一方法判为核酸阳性的，可判定为A.2平衡盐溶液A.2.3配制平衡盐溶液用前，用无菌7%碳酸氢钠溶液调平衡盐溶液pH值至7.2～7.6。B.3.2裂解液B.3.3洗涤液B.3.4洗脱液取43.2g磷酸氢二钠、62.4g磷酸二氢钾，灭菌去离子水实时荧光PCR反应体系如表B.2。1155tcctaacactaacgaagtcgttggtaacacgttgtagattggagccgtcccagtatttacatatctaatattggcatttaatcttgctgtatcagcggtatttaaacccagtttcagcccaagttctttcccctgctagagatagtgaatgatcaattgcgaccgtacttgaattcgaattactaaatcctgcagatacactcccaccaatatcaaagaacgacgcatgcacttctgcatttccatgtacttcactagtatgtgtcctacttgtagaagtatttttacttattgttctcgtttcactatcagtattctgtgtggattgatcattttttgagagaataatattctccatatctacatgtacaatcggataagctgccacaagggggtgtcttgcctctggtgatacattcttatcaatccgtcctgtaaccttcgaaatcactgtacggatcagaagccgtgctccatttttcaggagatgatttatatttggttaatcctttcttttcatgaatattagaaatccatggtgaaagaaaagttcttttatttttgacatcaaccgtatatccttctaccE.1炭疽芽孢杆菌重组Pag保护性抗原基因的扩增和质粒根据炭疽芽孢杆菌毒株MN010568.1株的序列，利用软件Primer5.0设计一对含有限制性酶切位点GAGGTAGAAGGATATACGGT-3基因基因克隆至pET-32a载体中，构建pET-32a-(炭疽芽孢杆菌Pag保护性抗原基将含有pET-32a-(α)重组质粒的生产用菌种种子pET-32a-(α)-BL21(DE3)按1:100比例转接含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基，置3将生产用菌液加入IPTG至终浓度为0.75mmoL/L，16℃将诱导后的菌液，在2℃~8℃条件下、以8000r/min离心10min，弃上清，收集菌体沉淀，用pH值7.4）重悬菌体沉淀，在150W功率的超声波的作用下冰浴裂解，有效时间为10min，工作时间为5秒，间隔5秒。将超声裂解物在2℃~8℃、以12000r/min离心15min，保留上清。缓冲液、40moL/L咪唑缓冲液、60mmoL/L咪唑缓冲液、80mmoL/L咪唑缓冲液、100产生的滤液通过Superdex200凝胶柱分子筛进行进一步精细纯化，最后将纯化后的蛋白吸出加到透析袋中（8kd）浸泡在2L的透析液中，过夜透析，-7F.1阴性对照的制备F.1.2制备血清：室温（15℃~25℃)待血液凝固后，37℃静置2h后，然后2℃~8℃静置1F.1.3血清的分装及保存：将制备的血清混合均匀后，0.22μm滤F.2.1免疫与采血：用炭疽芽孢杆菌疫苗于F.2.2分装、冻干及保存：将制备的血清混匀后，经1离子水25倍稀释。示例：40mL252称取柠檬酸5.76