产气荚膜梭菌病诊断技术征求意见稿

3产气荚膜梭菌病诊断技术本文件适用于产气荚膜梭菌病的临床诊断、实4缩略语DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacPCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）PBS：磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsalinSPF：无特定病原体(specificpathoTaq：水生栖热菌（thermusaqua5.1流行病学不同品种、性别、年龄的马、牛、羊、兔等家畜均易感，仔猪较5.2.1.2通常临床表现为发病迅速、死亡快速、死亡率高。发病牛突然不安5.2.1.3全身肌肉震颤、抽搐，行走不稳口流白沫，最后倒地而死亡；同时也出现腹泻，粪便含有大5.2.2羊5.2.2.2临床表现为急性发作，病羊磨牙流涎，排带黏液粪便，有的为黏液性黑色混血稀粪。死后不5.2.3猪5.2.3.2临床表现为病程短，死亡快，死亡率高，一旦流行会导致大批仔猪死亡。病猪腹泻、粪便呈5.2.4兔5.2.4.1主要由A型产气荚膜梭菌感染引起。5.2.4.2临床表现为急性死亡，排黑色水样或带血胶冻样粪便，肛门周围、后肢及尾部被毛被稀粪污5.3病理变化5.3.2羊烂)，稍加触压即溃烂，水冲洗后，肾表面5.3.3猪5.3.4兔5.4结果判定易感动物出现上述临床症状并且符合以上病理变化，可初步判定为疑似C.perfringe6.2.1器械:解剖刀、剪刀、镊子、注射6.2.4采样记录用品:采样单、记号笔、6.2.5其他:无菌棉拭子、医用棉签、医用纱布、封口膜、应选新鲜粪便至少10g，使用带螺帽容器或灭菌7.1.6冰箱（2℃~8℃、-20℃、-70℃)。将分离培养后带有溶血环的灰色磨面粗糙菌落依次进行卵磷脂酶试验、牛乳发酵试验和革兰氏染挑取单个菌落接种至甘露醇卵黄琼脂培养基中，37℃培养12h～24h，典型菌落在卵黄产生大量气体使凝固的牛乳呈蜂窝状，并置于培养基挑取单个菌落涂片，革兰氏染色镜检。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗大的短杆菌，两端钝圆，7R8.2.51.5%琼脂糖凝胶，配制方法按B.2。8.2.7细菌DNA提取试剂，配制方法按B.3。8.2.8C.perfringens阳性对照，灭活的含C.perfringens材料。8.2.9C.perfringens阴性对照，无核酸酶水。段ACG8.4.2将液体吸入吸附柱中，100008.4.5弃去收集管中液体，10000r/min离心2min，以除去残留的洗涤液。r/min离心30s，无菌离心管中9b）出现325bp、196bp和584bpd）扩增结果出现325bp和584e）扩增结果出现325bp和443bp二条结果与目的基因序列一致（参见附录C2-C5），则判9.1主要仪器和设备9.2主要试剂和材料9.2.2商品化2×实时荧光定量PCR预混液（2×PCRmastermix）。9.2.3C.perfringens对照样品：阳性对照同8.2.8；阴性对照同8.29.6判定方法9.6.1试验成立条件：阳性对照有特异性扩增曲线且Ct值<30，阴性对照无Ct值或阴性对照Ct值>409.6.3被检样品无Ct值或Ct值>40，且无特异性扩增曲线，判定为C.perfringen9.6.4被检样品有特异性扩增C.perfringens核酸阴性。采用夹心ELISA方法检测血清或血浆样品中C.perfringens抗体：预包被高纯度重组C.perfringens的α蛋白抗原，待检血清中的抗C.perfringens抗体与包被抗原反应，再与酶标C.pe10.2.1C.perfringens细菌重组α毒素蛋白抗原，见附录E。10.3.1包被：使用包被缓冲液将C.perfringen10.3.3封闭：每孔加入250μL封闭液，置于2℃~8℃封闭16h。10.3.5干燥：置于37℃干燥3h～5h。装入铝箔袋，加干燥剂，抽真空，置于2℃~8℃保存备涤后应弃去孔内的液体。最后一次洗涤液弃去后，在吸水纸上S/P=(OD450-S—OD450-NC)/(OD450-PC—OD450-NC)…………（1）OD450-S——待检血清样品在450OD450-PC——阳性对照血清在450nm波长处的平均OD450-NC——阴性对照血清在450nm波长处的平均OD值。OD450-PC值≥0.8；且OD450-NC值＜0.3，试验结果有效；否则，应重新进行试验。11.1符合第5.4条和第7条中任一项可判为C.perfringe定为相应型的C.perfringens确诊病A.2平衡盐溶液A.2.3配制平衡盐溶液用前，用无菌7%碳酸氢钠溶液调平衡盐溶液pH值至7.2～7.6。取43.2g磷酸氢二钠、62.4g磷酸二氢钾，灭菌去离子水B.5实时荧光PCR检测方法实时荧光PCR反应体系如表B.2。1155C.1C.perfringensPCR鉴定判定标准如表C.1表C.1各型C.perfringensPCRC.perfringens菌种bp）+---+++-++--+-+-+--+注：“+”表示阳性，有扩增产物，“-”表示阴性，无C.2C.perfringensα毒素基因PCR扩增片段序列GCTAATGTTACTGCCGTTGATAGCGCAGGACATGTTWAGTTTGAGACTTTTGCAAGAACAGTATAAAATAAACACAGCAGGTTGCAAAACTAATGAGGATTTTTATGCTGATATAAAAACAAAGATTTTAATGCATGGTCAAAAGAATATGCAAGAGGTTTTGCTAAAACAGGCAATATACTATAGTCATGCTAGCATGAGTCATAGTTGGGATGATTGGGATTATGCAGCAAAGGTAACTCTAGCTAACTCTCAAAAAGGAACAGCGGKATATATTTATAGATTCTTACACGATGTC.3C.perfringensβ毒素基因PCR扩增片段序列GCGAATATGCTGAATCATCTACAATAGAATATGTCCAACCTGATTTTTCTACTATCATTCAACCTCTAAAGCTTCATGGGATACAAAATTTACAGAAACTACTCGTGGTAAAATCAAACAACCCTGTATATGGAAATGAAATGTTTATGTACGGAAGATATACTAATCAGTATCTAATGAAATGTCCAAAAAAGCTTCTTATGATAATGTAGATACATTAATTGAGAAGATATAATACAAAATATAATTACTTAAAGAGAATGGAAAAATATTATCCTAATGCTTTTGATAAGGTTACTATAAATCCACAAGGAAATGATTTTTATATTAATAATCCTAAAGAGATGGAGAACCATCAATGAATTATCTTGAAGATGTTTATGTTGGAAAAGCTCTCTTAACTAATGATACTCAACAAGAACAAAAATTAAAATCACAATCATTCACTTGTAAAAATACTGATACAGGCAACTACTACTCCGACTGTGGGAACTTCGATACAAGCAACTGCTAAGTTTACTGTTCGAAACAGGAGTATCATTAACTACTAGTTATAGTTTTGCAAATACAAATACAAATACTAAGAAATTACTCATAATGTCCCTTCACAAGATATACTAGTACCAGCTAATACTACTGTAGTAGCATATTTAAAAAAAGTTAATGTTAAAGGAAATGTAAAGTTAGTAGGACACTACTCTCAGACAAGACAGTATTTTTACGACTATCAAATAGAATCAAATCCTAGAGAAAAATACAAAAATCTTAGAAATGCCATATCAAAAAATAAGATAGATAAACCTATAAATGTTTTGAGTCTCCAGAGAAATTTGCGTTTAATAAAGAAATAAGAACAGAAAATCAAAATGAAATTTAGAGAAATTTAATGAGTTGAAAGAAACTATTCAAGATAAATTGTTTAAACAAGATGGATTTAAGGATGTTTCTTTATATGAACCAGGTAATGGCGATGAAAAGCCTACACCACTACTTATAAATTACCAAAAAATACTGGTATGTTACCATATATAAATTCTAATGATGTAAAAACATTAACAAGACTATAGCATAAAGATAGACAAAATTGTTCGTATAGTAATAGAAGC.perfringens菌种+---+++-++--+-+-+--+注：“+”表示阳性，有扩增曲线，“-”表示阴性，无E.1C.perfringens重组α毒素基因的扩增和质粒构建根据C.perfringens毒株MN010568.1株的序列，利用软件Primer5.0设计一对含有限制性酶切位次；72℃延伸10min。将扩增的α毒素基因将含有pET-32a-(α)重组质粒的生产用菌种种子pET-32a-(α)-BL21(DE3)按1:100比例转接含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基，置37将生产用菌液加入IPTG至终浓度为0.75mmoL/L，16℃将诱导后的菌液，在2℃~8℃条件下、以8000r/min离心10min，弃上清，收集菌体沉淀，用pH值7.4）重悬菌体沉淀，在150W功率的超声波的作用下冰浴裂解，有效时间为10min，工作时间为5秒，间隔5秒。将超声裂解物在2℃~8℃、以12000r/min离心15min，保留上清。缓冲液、40moL/L咪唑缓冲液、60mmoL/L咪唑缓冲液、80mmoL/L咪唑缓冲液、100产生的滤液通过Superdex200凝胶柱分子筛进行进一步精细纯化，最后将纯化后的蛋白吸出加到透析袋中（8kd）浸泡在2L的透析液中，过夜透析，-7F.1.2制备血清：室温（15℃~25℃)待血液凝固后，37℃静置2h后，然后2℃~8℃静置1F.1.3血清的分装及保存：将制备的血清混合均匀后，0.22μm滤F.2.1免疫与采血：用C.perfringens疫苗于每只C.perfringens抗体阴性羊尾根部皮内注射，2mL/