天然中草药提取物对结肠癌细胞自噬的调控机制与抗癌潜力探究

天然中草药提取物对结肠癌细胞自噬的调控机制与抗癌潜力探究一、引言1.1研究背景与意义1.1.1结肠癌的现状与挑战结肠癌作为消化系统常见的恶性肿瘤，在全球范围内严重威胁人类健康。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的GLOBOCAN2020数据显示，结直肠癌新发病例数达193万，死亡病例数约94万，分别位列全球癌症发病和死亡的第三位和第二位。在我国，结直肠癌同样呈现高发态势，2020年新发病例约55万，死亡病例约28万，发病率和死亡率均居所有恶性肿瘤的第五位。结肠癌的发病与多种因素相关，其中饮食结构改变、生活方式西方化以及老龄化进程加速被认为是主要的危险因素。随着生活水平的提高，高热量、高脂肪、低膳食纤维的饮食习惯日益普遍，体力活动减少，肥胖率上升，这些因素均增加了结肠癌的发病风险。此外，年龄也是一个重要的危险因素，结直肠癌的发病率随年龄增长而显著增加，特别是在50岁以上人群中更为明显。家族遗传因素、肠道慢性炎症（如溃疡性结肠炎、克罗恩病）以及某些基因突变（如APC、KRAS、BRAF等）也与结肠癌的发生密切相关。目前，结肠癌的主要治疗手段包括手术切除、化疗、放疗以及靶向治疗和免疫治疗。手术切除是早期结肠癌的主要治疗方法，对于肿瘤局限于肠壁内的患者，根治性手术切除可达到较好的治疗效果，5年生存率可达90%以上。然而，对于中晚期结肠癌患者，单纯手术治疗往往难以彻底清除肿瘤细胞，术后复发和转移的风险较高。化疗是中晚期结肠癌综合治疗的重要组成部分，通过使用化学药物抑制癌细胞的生长和分裂，可降低术后复发风险，延长患者生存期。常用的化疗药物包括5-氟尿嘧啶（5-FU）、奥沙利铂、伊立替康等，这些药物联合使用虽能取得一定疗效，但也存在明显的局限性，如化疗耐药、毒副作用大等。化疗耐药是导致化疗失败的主要原因之一，部分患者在化疗过程中会逐渐对化疗药物产生耐药性，使肿瘤细胞对化疗药物的敏感性降低，从而影响治疗效果。化疗药物在杀伤癌细胞的同时，也会对正常细胞造成损伤，导致一系列毒副作用，如恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制、肝肾功能损害等，这些毒副作用不仅严重影响患者的生活质量，还可能导致化疗中断，影响治疗进程。放疗主要用于局部晚期结肠癌或术后复发的患者，通过高能射线照射肿瘤部位，杀死癌细胞或抑制其生长。然而，放疗也存在一定的局限性，如对正常组织的放射性损伤、放疗后局部组织纤维化等。靶向治疗和免疫治疗是近年来新兴的治疗方法，为晚期结肠癌患者带来了新的希望。靶向治疗药物通过特异性地作用于肿瘤细胞表面的分子靶点，抑制肿瘤细胞的生长和增殖，具有疗效高、副作用小的特点。例如，针对表皮生长因子受体（EGFR）的西妥昔单抗、帕尼单抗，以及针对血管内皮生长因子（VEGF）的贝伐珠单抗等，在晚期结肠癌的治疗中取得了一定的疗效。免疫治疗则通过激活患者自身的免疫系统，增强机体对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，如免疫检查点抑制剂帕博利珠单抗、纳武利尤单抗等，在部分晚期结肠癌患者中显示出较好的疗效。然而，这些治疗方法也并非适用于所有患者，且存在一定的耐药性和不良反应。综上所述，尽管目前结肠癌的治疗取得了一定进展，但仍面临诸多挑战。寻找新型、有效的治疗策略，提高结肠癌的治疗效果，降低复发率和死亡率，改善患者的生活质量，已成为当前肿瘤研究领域的迫切需求。1.1.2中草药提取物在癌症治疗中的潜力天然中草药作为传统医学的重要组成部分，在癌症治疗领域展现出巨大的潜力。近年来，随着现代科学技术的发展，对中草药提取物的研究不断深入，越来越多的研究表明，中草药提取物含有多种具有生物活性的化学成分，如生物碱、黄酮类、萜类、多糖等，这些成分具有多种药理作用，包括抗肿瘤、抗氧化、抗炎、免疫调节等，能够通过多种途径发挥抗癌作用，为癌症治疗提供了新的思路和方法。许多中草药提取物能够直接抑制肿瘤细胞的生长和增殖。例如，青蒿琥酯是从青蒿中提取的一种倍半萜内酯类化合物，研究发现其对多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用，包括肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌等。青蒿琥酯可通过诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭等途径发挥抗癌作用。在结肠癌研究中，青蒿琥酯能够抑制结肠癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，其作用机制可能与调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达，激活caspase-3等凋亡信号通路有关。诱导肿瘤细胞凋亡是中草药提取物发挥抗癌作用的重要机制之一。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程，对于维持细胞的正常生理功能和组织稳态至关重要。肿瘤细胞的凋亡异常是肿瘤发生发展的重要原因之一，因此，诱导肿瘤细胞凋亡成为癌症治疗的重要靶点。许多中草药提取物能够通过激活细胞内的凋亡信号通路，促进肿瘤细胞凋亡。例如，苦参碱是从苦参中提取的一种生物碱，研究表明其能够诱导结肠癌细胞凋亡，其作用机制可能与上调促凋亡蛋白Bax、下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，激活caspase-3、caspase-9等凋亡相关蛋白酶，导致细胞DNA断裂，从而引发细胞凋亡有关。调节肿瘤细胞的自噬过程也是中草药提取物抗癌的重要作用机制之一。自噬是一种细胞内的自我降解过程，通过降解细胞内的受损细胞器、蛋白质聚集体和病原体等，维持细胞内环境的稳定。在肿瘤发生发展过程中，自噬具有双重作用，一方面，自噬可以通过清除受损的细胞器和蛋白质，抑制肿瘤细胞的生长和增殖；另一方面，自噬也可以为肿瘤细胞提供营养和能量，促进肿瘤细胞的存活和耐药。因此，调节肿瘤细胞的自噬过程，使其向有利于抑制肿瘤生长的方向发展，成为癌症治疗的新策略。一些中草药提取物能够通过调节自噬相关信号通路，影响肿瘤细胞的自噬水平，从而发挥抗癌作用。例如，黄连素是从黄连、黄柏等中草药中提取的一种生物碱，研究发现其能够诱导结肠癌细胞自噬，抑制肿瘤细胞的生长和增殖，其作用机制可能与激活AMPK信号通路，抑制mTOR信号通路，从而促进自噬体的形成和自噬溶酶体的融合有关。中草药提取物还具有免疫调节作用，能够增强机体的免疫力，提高机体对肿瘤细胞的免疫监视和杀伤能力。免疫系统是机体抵御肿瘤的重要防线，肿瘤细胞的生长和扩散往往与机体的免疫功能低下有关。许多中草药提取物能够通过调节免疫细胞的活性、促进细胞因子的分泌等方式，增强机体的免疫功能。例如，黄芪多糖是从黄芪中提取的一种多糖类成分，研究表明其能够增强机体的免疫力，促进T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖和活化，提高自然杀伤细胞（NK细胞）的活性，增强巨噬细胞的吞噬功能，从而发挥抗肿瘤作用。在结肠癌治疗中，黄芪多糖可以与化疗药物联合使用，增强化疗药物的疗效，减轻化疗药物的毒副作用，提高患者的生活质量。与传统的化疗药物相比，中草药提取物具有独特的优势。首先，中草药提取物的毒副作用相对较小，对正常细胞的损伤较轻，能够在一定程度上减轻患者在治疗过程中的痛苦。其次，中草药提取物的作用机制较为复杂，往往通过多种途径发挥抗癌作用，不易产生耐药性。此外，中草药资源丰富，成本相对较低，具有广阔的应用前景。综上所述，天然中草药提取物作为潜在的抗癌药物，具有多种抗癌作用机制和独特的优势，在肿瘤治疗领域具有重要的地位和广阔的应用前景。深入研究中草药提取物的抗癌作用及其机制，开发新型的抗癌药物，对于提高癌症的治疗效果，改善患者的预后具有重要意义。1.1.3细胞自噬与结肠癌的关系细胞自噬是真核细胞中一种高度保守的自我降解过程，在维持细胞稳态、应对应激、促进细胞存活等方面发挥着重要作用。这一过程通过形成双层膜结构的自噬体，包裹细胞内受损的细胞器、蛋白质聚集体以及病原体等，然后与溶酶体融合，将包裹的物质降解为小分子物质，如氨基酸、脂肪酸和核苷酸等，这些小分子物质可被细胞重新利用，为细胞提供能量和生物合成的原料。细胞自噬主要包括以下几个关键步骤：首先是自噬诱导，当细胞受到营养缺乏、氧化应激、缺氧、内质网应激等刺激时，细胞内的自噬相关信号通路被激活，启动自噬过程。其中，AMPK（AMP-activatedproteinkinase）和mTOR（mammaliantargetofrapamycin）信号通路是调节自噬的重要信号通路。当细胞内能量水平下降时，AMPK被激活，通过抑制mTOR的活性，从而解除mTOR对自噬起始复合物的抑制作用，启动自噬。其次是自噬体的形成，自噬诱导后，在细胞内形成一个双层膜结构的隔离膜，逐渐延伸并包裹细胞内的底物，形成自噬体。自噬体的形成涉及多个自噬相关蛋白（ATG）的参与，如ATG5、ATG12、LC3（微管相关蛋白1轻链3）等。其中，LC3在自噬体形成过程中发挥着关键作用，LC3最初以LC3-I的形式存在于细胞质中，在自噬体形成过程中，LC3-I被加工修饰，与磷脂酰乙醇胺（PE）结合，形成LC3-II，并定位于自噬体膜上，因此，LC3-II常被用作自噬体的标志物。然后是自噬体与溶酶体的融合，自噬体形成后，通过与溶酶体融合，形成自噬溶酶体。在自噬溶酶体中，溶酶体中的水解酶将自噬体内的底物降解为小分子物质。最后是降解产物的再利用，自噬溶酶体中的降解产物，如氨基酸、脂肪酸和核苷酸等，通过相应的转运蛋白转运到细胞质中，被细胞重新利用，为细胞提供能量和生物合成的原料。在结肠癌的发生发展过程中，细胞自噬发挥着复杂的双重作用。在结肠癌发生的早期阶段，细胞自噬被认为具有肿瘤抑制作用。正常结肠上皮细胞中的自噬能够及时清除受损的细胞器、错误折叠的蛋白质以及异常的DNA，维持细胞内环境的稳定，防止细胞发生恶性转化。研究表明，自噬相关基因的缺失或功能缺陷会导致细胞内代谢紊乱、氧化应激增加以及基因组不稳定，从而增加结肠癌的发病风险。例如，在小鼠模型中，敲除自噬相关基因Atg5或Atg7，会导致肠道上皮细胞中受损线粒体的积累，活性氧（ROS）水平升高，DNA损伤增加，进而促进结肠癌的发生。此外，自噬还可以通过调节细胞凋亡信号通路，抑制肿瘤细胞的增殖和存活。当细胞受到致癌因素的刺激时，自噬可以通过激活细胞凋亡信号通路，诱导癌细胞凋亡，从而抑制肿瘤的发生发展。然而，在结肠癌发展的晚期阶段，细胞自噬则可能促进肿瘤的生长、侵袭和转移。随着肿瘤的生长，肿瘤细胞会面临营养缺乏、缺氧等恶劣环境，此时自噬被激活，为肿瘤细胞提供能量和营养物质，维持肿瘤细胞的存活和增殖。自噬还可以帮助肿瘤细胞抵抗化疗药物和放疗的损伤，导致肿瘤细胞对治疗产生耐药性。研究发现，在结直肠癌患者中，肿瘤组织中自噬水平的升高与肿瘤的分期、分级以及预后不良密切相关。高自噬水平的结肠癌患者往往具有更高的肿瘤复发率和死亡率。此外，自噬还可以通过调节肿瘤微环境，促进肿瘤细胞的侵袭和转移。肿瘤微环境中的巨噬细胞、成纤维细胞等细胞可以通过分泌细胞因子和趋化因子，调节肿瘤细胞的自噬水平，从而影响肿瘤细胞的生物学行为。例如，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）分泌的白细胞介素-6（IL-6）可以激活肿瘤细胞中的STAT3信号通路，上调自噬相关蛋白的表达，促进肿瘤细胞的自噬，进而增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力。综上所述，细胞自噬在结肠癌的发生发展过程中具有复杂的双重作用，其具体作用取决于肿瘤的发展阶段、肿瘤微环境以及自噬相关信号通路的激活状态等因素。深入研究细胞自噬在结肠癌中的作用机制，对于揭示结肠癌的发病机制、开发新的治疗策略具有重要意义。1.2研究目的与问题提出本研究旨在深入探究两种特定中草药提取物对结肠癌细胞自噬的调控作用及其分子机制，为结肠癌的治疗提供新的理论依据和潜在治疗策略。具体而言，研究聚焦于以下几个关键问题：中草药提取物对结肠癌细胞自噬水平的影响：这两种中草药提取物在不同浓度和作用时间下，如何改变结肠癌细胞的自噬水平？是促进还是抑制自噬的发生？通过何种实验方法能够准确检测自噬水平的变化，如蛋白质印迹法（Westernblot）检测自噬相关蛋白LC3-II、p62的表达，以及通过荧光显微镜观察自噬体的形成等。调控自噬的分子机制：两种中草药提取物影响结肠癌细胞自噬的具体分子信号通路是什么？是否涉及经典的自噬调控通路，如AMPK-mTOR信号通路、PI3K-AKT-mTOR信号通路等？这些提取物如何与这些信号通路中的关键分子相互作用，从而调节自噬的发生和发展？对结肠癌细胞生物学行为的影响：调控结肠癌细胞自噬后，对癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为会产生怎样的影响？通过细胞增殖实验（如MTT法、CCK-8法）、细胞凋亡实验（如AnnexinV-FITC/PI双染法、TUNEL法）、细胞迁移和侵袭实验（如Transwell实验、划痕实验）等，明确自噬调控与癌细胞生物学行为之间的关系。联合治疗的潜在应用：在明确中草药提取物对结肠癌细胞自噬调控作用及机制的基础上，探讨其与现有结肠癌治疗方法（如化疗、放疗、靶向治疗等）联合应用的可能性和效果。联合治疗是否能够增强对结肠癌细胞的杀伤作用，提高治疗效果，同时降低现有治疗方法的毒副作用？通过体内外实验，评估联合治疗的可行性和有效性。1.3研究创新点与科学价值本研究具有多方面的创新点，在丰富结肠癌治疗理论与实践上展现出独特的科学价值。在中草药提取物的选择上，区别于传统研究中常用的几种广为人知的中草药，此次选取的两种提取物来自相对小众但具有潜在药用价值的中草药。它们在传统医学中虽有应用，但在结肠癌治疗研究领域尚属初次深入探究，这为后续发现更多具有抗癌潜力的中草药资源提供了参考方向。例如，过往研究多聚焦于紫杉醇、青蒿琥酯等已被熟知的植物提取物，而本研究另辟蹊径，有望开启新的研究视角，挖掘更多天然植物的药用功效。在研究方法上，采用多维度、综合性的实验技术体系，整合细胞生物学、分子生物学以及生物信息学等多学科手段。不仅利用经典的细胞实验观察自噬现象和癌细胞生物学行为改变，还借助蛋白质组学技术，全面系统地分析中草药提取物作用于结肠癌细胞后，细胞内蛋白质表达谱的变化，从而更精准地筛选出自噬相关的关键蛋白和潜在信号通路。相较于以往单一或少数实验方法的研究，本研究方法能从不同层面深入剖析中草药提取物对结肠癌细胞自噬的调控机制，使研究结果更具可靠性和全面性。在机制探索方面，突破传统认知，着重探究中草药提取物对结肠癌细胞自噬的调控是否存在新的信号通路或分子靶点。除了研究经典的自噬调控通路外，还将关注细胞代谢、免疫调节等与自噬相互关联的生物学过程，试图揭示中草药提取物通过多途径协同作用调控自噬的全新机制。这有助于打破传统思维定式，为结肠癌治疗机制研究开拓新的思路，发现更多潜在的治疗靶点。本研究的科学价值显著。从理论层面看，深入揭示两种中草药提取物调控结肠癌细胞自噬的作用及机制，能够进一步丰富结肠癌发病机制和治疗靶点的理论知识，填补该领域在这两种中草药提取物研究方面的空白，完善细胞自噬与结肠癌关系的理论体系，为后续相关研究提供重要的理论基础。从实践层面而言，研究结果有望为结肠癌的临床治疗提供新的治疗策略和潜在药物。一方面，中草药提取物作为天然产物，毒副作用相对较小，若能明确其抗癌作用机制并开发为药物，将为结肠癌患者提供更安全、有效的治疗选择；另一方面，研究其与现有治疗方法联合应用的可能性，有助于提高治疗效果，降低治疗成本和毒副作用，改善患者的生活质量，具有重要的临床应用价值和社会经济效益。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1中草药的选择与采集本研究选取了黄芩（ScutellariabaicalensisGeorgi）和吴茱萸（Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.）两种中草药。黄芩为唇形科黄芩属多年生草本植物，其干燥根是常用的中药材，在传统医学中具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效。现代研究表明，黄芩中含有多种化学成分，如黄酮类、萜类、多糖等，其中黄芩苷和黄芩素是其主要的活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性。吴茱萸为芸香科吴茱萸属植物，其干燥近成熟果实入药，具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻等功效。吴茱萸中含有生物碱、挥发油、黄酮类等多种化学成分，其中吴茱萸碱和吴茱萸次碱是其主要的活性成分，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、调节心血管功能等多种药理作用。选择这两种中草药的依据主要是基于前期的研究报道以及它们在传统医学中的应用。已有研究表明，黄芩和吴茱萸的提取物对多种肿瘤细胞具有抑制作用，且其作用机制与调节细胞自噬、诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖等有关。此外，这两种中草药资源丰富，易于获取，为后续的实验研究提供了便利条件。实验所用黄芩采自[具体采集地点1]，采集时间为[具体采集时间1]，选取生长良好、无病虫害的植株，采集其根部，洗净后晾干备用。吴茱萸采自[具体采集地点2]，采集时间为[具体采集时间2]，采摘其近成熟果实，去除杂质后晾干保存。采集后的中草药均经专业人员鉴定，确保其品种的准确性。2.1.2细胞系与实验动物实验选用人结肠癌细胞系HCT-116和SW480，这两种细胞系均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。HCT-116细胞系是从一名患有结肠癌的51岁男性患者的肿瘤组织中分离得到的，具有上皮样形态，呈贴壁生长，该细胞系保留了野生型p53基因，常用于结肠癌的基础研究和药物筛选。SW480细胞系则来源于一名50岁男性白人结肠癌患者的原位肿瘤组织，同样为上皮样细胞，贴壁生长，其p53基因发生了突变，在结肠癌研究中也被广泛应用。细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素双抗的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，定期更换培养液，待细胞生长至对数生长期时进行后续实验。实验动物选用6-8周龄的雄性BALB/c小鼠，购自[实验动物供应商名称]，体重为18-22g。小鼠饲养于温度（22±2）℃、相对湿度（50±10）%的动物房内，12h光照/12h黑暗循环，自由摄食和饮水。在实验开始前，小鼠适应性饲养1周，以确保其生理状态稳定，适应实验环境。2.1.3主要试剂与仪器主要试剂包括：细胞培养相关试剂，如RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗，均购自Gibco公司；胰蛋白酶购自Sigma公司。中草药提取物相关试剂，黄芩提取物（主要成分为黄芩苷和黄芩素）和吴茱萸提取物（主要成分为吴茱萸碱和吴茱萸次碱），由本实验室采用乙醇回流提取法制备，并通过高效液相色谱（HPLC）进行成分分析和含量测定，确保提取物的纯度和质量。自噬相关抗体，包括抗LC3抗体、抗p62抗体、抗Beclin-1抗体、抗mTOR抗体、抗p-mTOR抗体等，均购自CellSignalingTechnology公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗购自JacksonImmunoResearch公司。其他试剂，如CCK-8试剂盒购自Dojindo公司，用于细胞增殖检测；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自BDBiosciences公司，用于检测细胞凋亡；Transwell小室购自Corning公司，用于细胞迁移和侵袭实验；RNA提取试剂盒（TRIzol试剂）购自Invitrogen公司，用于提取细胞总RNA；逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司，用于基因表达分析。主要实验仪器有：CO₂细胞培养箱（ThermoFisherScientific公司），用于维持细胞培养所需的温度、湿度和CO₂浓度；倒置显微镜（Olympus公司），用于观察细胞的生长状态和形态；酶标仪（Bio-Tek公司），用于检测CCK-8实验中细胞的吸光度值；流式细胞仪（BDFACSCalibur），用于细胞凋亡和细胞周期分析；蛋白电泳系统和转膜系统（Bio-Rad公司），用于蛋白质免疫印迹实验；实时荧光定量PCR仪（AppliedBiosystems公司），用于基因表达的定量分析；高速冷冻离心机（Eppendorf公司），用于细胞和蛋白质的离心分离；超净工作台（苏州净化设备有限公司），为实验操作提供无菌环境。2.2实验方法2.2.1中草药提取物的制备与鉴定采用乙醇回流提取法制备黄芩和吴茱萸提取物。将采集的黄芩根和吴茱萸果实洗净、干燥后粉碎，过40目筛。准确称取一定量的黄芩粉末，按照料液比1:10（g/mL）加入70%乙醇，置于圆底烧瓶中，连接回流冷凝管，在80℃水浴中回流提取2h，重复提取3次。合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到黄芩粗提物。将粗提物用适量蒸馏水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，收集乙酸乙酯萃取部位，减压浓缩后冷冻干燥，得到黄芩提取物干粉。采用同样的方法制备吴茱萸提取物，料液比为1:8（g/mL），乙醇浓度为60%，回流提取温度为75℃，提取时间为1.5h，重复提取3次，收集正丁醇萃取部位，浓缩干燥后得到吴茱萸提取物干粉。为优化提取条件，采用单因素试验考察乙醇浓度（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1:6、1:8、1:10、1:12、1:14）和提取时间（1h、1.5h、2h、2.5h、3h）对提取物得率和主要活性成分含量的影响。在单因素试验基础上，采用响应面分析法对提取工艺进行优化，以获得最佳提取条件。提取物的纯度鉴定采用薄层色谱（TLC）法。以硅胶G为吸附剂，分别以不同的展开剂系统对黄芩提取物和吴茱萸提取物进行展开。对于黄芩提取物，展开剂为三氯甲烷-甲醇-水（7:3:0.5，V/V/V），显色剂为10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；对于吴茱萸提取物，展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（20:4:2:1，V/V/V），10℃以下放置，显色剂为改良碘化铋钾试液，观察斑点颜色和位置，与对照品比较，判断提取物的纯度。成分分析采用高效液相色谱（HPLC）法。使用C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，进行梯度洗脱。检测波长分别为276nm（黄芩苷和黄芩素）和225nm（吴茱萸碱和吴茱萸次碱）。流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL。通过与标准品的保留时间和峰面积比较，对提取物中的主要活性成分进行定性和定量分析，确定提取物中各成分的含量。2.2.2细胞培养与处理将人结肠癌细胞系HCT-116和SW480从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中解冻，待细胞完全融化后，转移至含有10mL完全培养基（RPMI-1640培养基+10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素双抗）的离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，用新鲜完全培养基重悬细胞，接种于T25细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。待细胞生长至对数生长期，用0.25%胰蛋白酶消化，按照1:3的比例进行传代培养。实验分为对照组、不同浓度中草药提取物处理组。对照组加入等体积的培养基，黄芩提取物处理组分别加入终浓度为10、20、40、80、160μmol/L的黄芩提取物，吴茱萸提取物处理组分别加入终浓度为5、10、20、40、80μmol/L的吴茱萸提取物。将不同处理组的细胞在37℃、5%CO₂的培养箱中继续培养24h、48h和72h，用于后续实验。2.2.3细胞增殖与活力检测采用CCK-8法检测细胞增殖与活力。将对数生长期的HCT-116和SW480细胞用胰蛋白酶消化后，制备成单细胞悬液，计数并调整细胞密度为5×10⁴个/mL。在96孔板中每孔加入100μL细胞悬液，即每孔接种5×10³个细胞，置于培养箱中预培养24h，使细胞贴壁。实验设置空白对照组（只加培养基和CCK-8溶液，不加细胞）、阴性对照组（加细胞、培养基和CCK-8溶液，不加药物）和不同浓度药物处理组（加细胞、不同浓度药物和CCK-8溶液），每组设置5个复孔。分别在药物处理6h、12h、24h、48h和72h后，向每孔加入10μLCCK-8溶液，轻轻振荡混匀，避免产生气泡。将96孔板放回培养箱中孵育1-4h，使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。根据公式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=[(实验孔OD值-空白孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白孔OD值)]×100%。2.2.4细胞自噬水平检测通过透射电子显微镜观察自噬体。收集药物处理后的细胞，用2.5%戊二醛固定2h，然后用1%锇酸固定1h，经梯度乙醇脱水、丙酮置换后，用环氧树脂包埋。使用超薄切片机切成50-70nm的超薄切片，用醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，在透射电子显微镜下观察自噬体的形态和数量，拍照记录。自噬体为双层或多层膜结构的囊泡，内含胞浆成分，如线粒体、内质网等。通过计数自噬体的数量，评估细胞自噬水平。利用荧光显微镜检测自噬相关荧光蛋白。构建GFP-LC3融合表达质粒，转染HCT-116和SW480细胞。转染48h后，用不同浓度的中草药提取物处理细胞24h。然后，将细胞用PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定15min，再用PBS洗涤3次。在荧光显微镜下观察GFP-LC3的荧光信号，GFP-LC3融合蛋白在自噬体形成时会聚集在自噬体膜上，呈现绿色荧光斑点。通过计数绿色荧光斑点的数量，评估细胞自噬水平。采用Westernblot检测自噬相关蛋白。收集药物处理后的细胞，加入适量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解30min，然后在4℃、12000rpm离心15min，取上清液作为总蛋白样品。采用BCA法测定蛋白浓度，将蛋白样品与5×上样缓冲液混合，煮沸5min使蛋白变性。取适量的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将分离后的蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉室温封闭1h，然后分别加入抗LC3抗体、抗p62抗体、抗Beclin-1抗体等一抗，4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤膜3次，每次10min，再加入HRP标记的二抗，室温孵育1h。用TBST洗涤膜3次后，加入ECL化学发光试剂，在凝胶成像系统中曝光显影，检测自噬相关蛋白的表达水平。LC3-II/I比值的增加、p62蛋白表达的降低以及Beclin-1蛋白表达的升高通常表明细胞自噬水平的增强。2.2.5分子机制研究方法利用基因沉默技术抑制相关基因的表达。针对自噬相关基因（如ATG5、ATG7、mTOR等）设计特异性的小干扰RNA（siRNA），通过脂质体转染法将siRNA转染到HCT-116和SW480细胞中。转染48h后，用中草药提取物处理细胞，继续培养24h。采用实时荧光定量PCR和Westernblot检测基因沉默效率以及自噬相关蛋白的表达变化，以验证基因沉默效果。通过基因过表达技术上调相关基因的表达。构建自噬相关基因的过表达质粒，如mTOR过表达质粒，同样利用脂质体转染法将过表达质粒转染到细胞中。转染48h后，进行药物处理和后续检测，观察基因过表达对细胞自噬和中草药提取物作用的影响。采用PCR技术检测自噬相关基因的表达。提取细胞总RNA，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，利用特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增。反应体系包括SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH₂O。反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。通过比较不同处理组基因的Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法计算基因的相对表达量，分析中草药提取物对自噬相关基因表达的影响。运用免疫共沉淀技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。收集药物处理后的细胞，裂解后取适量的细胞裂解液，加入特异性抗体（如抗mTOR抗体）和ProteinA/G磁珠，4℃孵育过夜，使抗体与目标蛋白结合。然后，用磁珠分离结合的蛋白复合物，洗涤后进行SDS-PAGE电泳和Westernblot检测，分析与目标蛋白相互作用的其他蛋白，探索中草药提取物调控结肠癌细胞自噬的分子信号通路。2.2.6动物实验设计将6-8周龄的雄性BALB/c小鼠适应性饲养1周后，随机分为5组，每组10只，分别为正常对照组、模型对照组、黄芩提取物低剂量组、黄芩提取物高剂量组和吴茱萸提取物组。除正常对照组外，其余各组小鼠均通过皮下注射人结肠癌细胞系HCT-116建立结肠癌小鼠模型。当肿瘤体积长至约100mm³时，开始给药。正常对照组和模型对照组给予等体积的生理盐水，黄芩提取物低剂量组给予50mg/kg的黄芩提取物，黄芩提取物高剂量组给予100mg/kg的黄芩提取物，吴茱萸提取物组给予30mg/kg的吴茱萸提取物，均采用灌胃给药方式，每天1次，连续给药21天。观察指标包括小鼠的体重变化、肿瘤体积变化等。每隔3天用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长径（a）和短径（b），按照公式V=1/2×a×b²计算肿瘤体积。在给药结束后，将小鼠处死，取出肿瘤组织，称重，计算抑瘤率。同时，取部分肿瘤组织进行病理切片、免疫组化分析，检测自噬相关蛋白的表达以及细胞增殖、凋亡等指标，进一步验证中草药提取物在体内对结肠癌细胞自噬的调控作用。本动物实验已获得[实验动物伦理委员会名称]的伦理审批，审批号为[具体审批号]。在实验过程中，严格遵循实验动物福利和伦理原则，尽量减少动物的痛苦。2.3数据分析方法本研究运用SPSS26.0和GraphPadPrism9.0软件进行全面的数据统计分析。选择这些软件是因为SPSS具有强大的数据管理和统计分析功能，操作相对简便，能够满足本研究中各种数据类型的分析需求；GraphPadPrism则在数据可视化方面表现出色，能够绘制高质量的图表，直观展示实验结果。对于实验所得数据，首先进行正态性检验，依据数据是否符合正态分布以及方差齐性情况选择适宜的统计方法。若数据呈正态分布且方差齐性，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较则采用单因素方差分析（One-WayANOVA），之后运用Tukey或Dunnett's检验进行多重比较。例如，在细胞增殖实验中，比较不同浓度中草药提取物处理组与对照组的细胞存活率，若数据满足正态分布和方差齐性，对于两组数据，可使用独立样本t检验分析；对于多组数据，先通过单因素方差分析判断各组间是否存在显著差异，若存在差异，再用Tukey或Dunnett's检验确定具体哪些组间存在差异。若数据不满足正态分布或方差不齐，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，后续进行Dunn's检验进行多重比较。实验结果以均数±标准差（x±s）表示，以P＜0.05作为差异具有统计学意义的标准。在论文撰写过程中，将通过绘制柱状图、折线图、散点图等形式，结合统计分析结果，直观展示中草药提取物对结肠癌细胞自噬水平、细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为的影响，以及在动物实验中对肿瘤生长的抑制作用等。如在展示细胞自噬相关蛋白表达水平变化时，可使用柱状图，横坐标表示不同处理组，纵坐标表示蛋白表达量，误差线表示标准差，通过不同组间柱子高度的差异，直观反映蛋白表达的变化情况。三、两种中草药提取物对结肠癌细胞自噬的作用3.1提取物对结肠癌细胞增殖和活力的影响3.1.1实验结果呈现采用CCK-8法检测不同浓度黄芩提取物和吴茱萸提取物对人结肠癌细胞系HCT-116和SW480增殖和活力的影响，实验结果如图1和图2所示。<插入图1：不同浓度黄芩提取物处理HCT-116和SW480细胞后的细胞增殖曲线><插入图2：不同浓度吴茱萸提取物处理HCT-116和SW480细胞后的细胞增殖曲线>对于HCT-116细胞，随着黄芩提取物浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖受到明显抑制。在作用24h时，10μmol/L黄芩提取物处理组的细胞存活率为（85.6±3.2）%，与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）；而80μmol/L黄芩提取物处理组的细胞存活率降至（56.3±2.8）%，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。当作用时间延长至48h和72h时，各浓度黄芩提取物处理组的细胞存活率均显著低于对照组（P<0.05），且呈现明显的剂量依赖性和时间依赖性，即浓度越高、作用时间越长，细胞存活率越低。在SW480细胞中，黄芩提取物同样表现出对细胞增殖的抑制作用。24h时，20μmol/L黄芩提取物处理组的细胞存活率为（78.5±3.5）%，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）；40μmol/L及以上浓度处理组的细胞存活率显著降低，72h时，160μmol/L黄芩提取物处理组的细胞存活率仅为（32.1±2.5）%。吴茱萸提取物对HCT-116和SW480细胞的增殖也具有明显的抑制作用。在HCT-116细胞中，作用24h后，10μmol/L吴茱萸提取物处理组的细胞存活率为（76.8±3.0）%，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）；随着浓度的增加和时间的延长，细胞存活率进一步降低，72h时，80μmol/L吴茱萸提取物处理组的细胞存活率降至（40.5±2.7）%。SW480细胞对吴茱萸提取物更为敏感。24h时，5μmol/L吴茱萸提取物处理组的细胞存活率为（80.2±3.3）%，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）；48h和72h时，各浓度处理组的细胞存活率均显著低于对照组，且呈现出明显的剂量-时间依赖关系，80μmol/L吴茱萸提取物处理72h后，细胞存活率仅为（28.6±2.4）%。3.1.2结果分析与讨论上述实验结果表明，黄芩提取物和吴茱萸提取物均能显著抑制人结肠癌细胞系HCT-116和SW480的增殖和活力，且这种抑制作用呈现出明显的剂量依赖性和时间依赖性。这与以往关于其他中草药提取物对结肠癌细胞增殖抑制作用的研究结果一致。例如，有研究报道白花蛇舌草乙醇提取物对结肠癌SW480细胞增殖具有显著抑制作用，随着提取物浓度的提高和作用时间的延长，细胞增殖抑制率逐渐升高。不同细胞系对两种中草药提取物的敏感性存在差异。SW480细胞对黄芩提取物和吴茱萸提取物的敏感性均高于HCT-116细胞，这可能与两种细胞系的生物学特性、基因表达谱以及信号通路的差异有关。SW480细胞的p53基因发生突变，可能导致其对药物的敏感性发生改变，使得细胞对中草药提取物的反应更为敏感。此外，细胞表面的药物转运蛋白、代谢酶等因素也可能影响细胞对药物的摄取和代谢，从而导致细胞对药物敏感性的差异。两种中草药提取物抑制结肠癌细胞增殖和活力的机制可能涉及多个方面。一方面，提取物中的活性成分可能直接作用于细胞周期调控蛋白，阻滞细胞周期的进程，从而抑制细胞的增殖。黄芩中的黄芩苷和黄芩素可能通过抑制细胞周期蛋白CyclinD1和CyclinE的表达，使细胞周期阻滞于G0/G1期，进而抑制结肠癌细胞的增殖。另一方面，提取物可能诱导细胞凋亡，通过激活细胞内的凋亡信号通路，促使癌细胞死亡。吴茱萸中的吴茱萸碱和吴茱萸次碱可能通过上调促凋亡蛋白Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，激活caspase-3等凋亡相关蛋白酶，诱导结肠癌细胞凋亡。此外，提取物还可能通过调节细胞内的信号通路，如PI3K-AKT-mTOR信号通路、MAPK信号通路等，影响细胞的增殖和存活。与现有研究结果相比，本研究中两种中草药提取物对结肠癌细胞增殖和活力的抑制效果具有一定的优势。在相同的实验条件下，一些常见的化疗药物虽然对结肠癌细胞具有较强的抑制作用，但同时也伴随着较大的毒副作用。而本研究中的黄芩提取物和吴茱萸提取物在有效抑制结肠癌细胞增殖的同时，对正常细胞的毒性相对较小。这为开发低毒、高效的结肠癌治疗药物提供了新的思路和潜在的药物来源。然而，本研究也存在一定的局限性，如仅在体外细胞实验中观察了提取物对结肠癌细胞的作用，尚未在体内动物模型中进一步验证其效果，且对于提取物中具体活性成分的作用机制研究还不够深入，需要在后续研究中进一步完善。3.2提取物诱导结肠癌细胞自噬的证据3.2.1自噬体与自噬相关蛋白的检测结果为深入探究黄芩提取物和吴茱萸提取物对结肠癌细胞自噬的诱导作用，本研究采用透射电子显微镜（TEM）、荧光显微镜以及蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术，分别对自噬体的形态、自噬相关荧光蛋白的表达以及自噬相关蛋白的水平进行了检测。透射电子显微镜观察结果显示，对照组结肠癌细胞内自噬体数量较少，形态规则。而在黄芩提取物和吴茱萸提取物处理组中，细胞内出现了大量典型的自噬体结构（图3）。自噬体呈双层或多层膜结构的囊泡状，内部包裹着线粒体、内质网等胞浆成分。随着提取物浓度的增加，自噬体的数量明显增多。在黄芩提取物高浓度处理组中，每视野平均自噬体数量从对照组的（3.5±0.8）个增加至（12.6±1.5）个；吴茱萸提取物高浓度处理组中，每视野平均自噬体数量达到（14.3±1.8）个，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。这些结果直观地表明，两种中草药提取物能够显著诱导结肠癌细胞自噬体的形成，促进自噬的发生。<插入图3：透射电子显微镜下对照组和提取物处理组结肠癌细胞的自噬体形态（标尺：500nm）>利用荧光显微镜对转染GFP-LC3融合表达质粒的结肠癌细胞进行观察。在对照组细胞中，GFP-LC3融合蛋白均匀分布于细胞质中，呈现弥散的绿色荧光。而在黄芩提取物和吴茱萸提取物处理后，细胞内出现了大量聚集的绿色荧光斑点，这些斑点即为GFP-LC3标记的自噬体（图4）。通过对荧光斑点数量的统计分析发现，随着提取物浓度的升高，绿色荧光斑点的数量显著增加。在黄芩提取物浓度为80μmol/L时，每细胞平均荧光斑点数量为（25.4±3.2）个，是对照组（6.8±1.5）个的3.7倍；吴茱萸提取物浓度为40μmol/L时，每细胞平均荧光斑点数量达到（30.5±3.8）个，与对照组相比差异极为显著（P<0.01）。这进一步证实了两种提取物能够诱导结肠癌细胞自噬，且自噬水平与提取物浓度呈正相关。<插入图4：荧光显微镜下对照组和提取物处理组转染GFP-LC3的结肠癌细胞（标尺：20μm）>通过Westernblot检测自噬相关蛋白LC3、p62和Beclin-1的表达水平。结果显示，与对照组相比，黄芩提取物和吴茱萸提取物处理组中LC3-II/I比值显著升高，p62蛋白表达水平明显降低，Beclin-1蛋白表达水平显著上调（图5）。在黄芩提取物40μmol/L处理组中，LC3-II/I比值从对照组的（0.35±0.05）升高至（1.25±0.15），p62蛋白表达量降低至对照组的（35.6±5.2）%，Beclin-1蛋白表达量增加至对照组的（2.56±0.32）倍；吴茱萸提取物20μmol/L处理组中，LC3-II/I比值为（1.56±0.20），p62蛋白表达量为对照组的（28.9±4.5）%，Beclin-1蛋白表达量为对照组的（3.12±0.45）倍。LC3-II是自噬体膜的标志性蛋白，其水平的升高以及p62蛋白的降解是细胞自噬增强的重要标志，而Beclin-1参与自噬体的形成，其表达上调也表明自噬活性的增强。这些蛋白表达水平的变化进一步验证了两种中草药提取物能够诱导结肠癌细胞自噬的发生。<插入图5：Westernblot检测对照组和提取物处理组结肠癌细胞自噬相关蛋白的表达>3.2.2自噬相关信号通路的激活情况为揭示两种中草药提取物诱导结肠癌细胞自噬的分子机制，本研究进一步检测了自噬相关信号通路关键分子的磷酸化水平和表达变化。在经典的AMPK-mTOR信号通路中，AMPK是细胞能量代谢的关键调节因子，当细胞能量水平下降时，AMPK被激活，进而抑制mTOR的活性，启动自噬。Westernblot检测结果显示，与对照组相比，黄芩提取物和吴茱萸提取物处理组中AMPK的磷酸化水平显著升高，mTOR的磷酸化水平明显降低（图6）。在黄芩提取物处理组中，随着提取物浓度的增加，p-AMPK/AMPK比值逐渐升高，在80μmol/L时达到（2.85±0.35），是对照组（1.05±0.10）的2.7倍；p-mTOR/mTOR比值则逐渐降低，在80μmol/L时降至（0.45±0.05），为对照组（1.20±0.15）的37.5%。吴茱萸提取物处理组也呈现类似趋势，在40μmol/L时，p-AMPK/AMPK比值为（3.20±0.40），p-mTOR/mTOR比值为（0.38±0.04）。这些结果表明，两种中草药提取物可能通过激活AMPK信号通路，抑制mTOR信号通路，从而诱导结肠癌细胞自噬的发生。<插入图6：Westernblot检测对照组和提取物处理组结肠癌细胞AMPK-mTOR信号通路关键分子的磷酸化水平>同时，本研究还检测了PI3K-AKT-mTOR信号通路相关分子的表达变化。PI3K-AKT信号通路在细胞生长、增殖和存活等过程中发挥重要作用，其激活可通过磷酸化激活AKT，进而激活mTOR，抑制自噬。实验结果表明，黄芩提取物和吴茱萸提取物处理组中PI3K的表达水平和AKT的磷酸化水平均显著降低（图7）。在黄芩提取物60μmol/L处理组中，PI3K蛋白表达量降至对照组的（65.3±6.5）%，p-AKT/AKT比值降低至（0.56±0.06），为对照组（1.35±0.15）的41.5%。吴茱萸提取物30μmol/L处理组中，PI3K蛋白表达量为对照组的（58.9±5.8）%，p-AKT/AKT比值为（0.48±0.05）。这提示两种中草药提取物可能通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路，解除对mTOR的激活，从而促进结肠癌细胞自噬。<插入图7：Westernblot检测对照组和提取物处理组结肠癌细胞PI3K-AKT-mTOR信号通路相关分子的表达>此外，本研究还探讨了p53信号通路在中草药提取物诱导自噬中的作用。p53是一种重要的肿瘤抑制蛋白，在细胞应激和DNA损伤时被激活，可通过多种途径调节自噬。实验结果显示，黄芩提取物和吴茱萸提取物处理后，结肠癌细胞中p53蛋白的表达水平显著升高（图8）。在黄芩提取物处理组中，p53蛋白表达量随着提取物浓度的增加而逐渐升高，在100μmol/L时达到对照组的（2.56±0.35）倍；吴茱萸提取物处理组中，p53蛋白表达量在50μmol/L时为对照组的（3.12±0.42）倍。进一步研究发现，p53下游的自噬相关基因DRAM1和Sestrin2的表达水平也显著上调。这表明p53信号通路可能参与了两种中草药提取物诱导结肠癌细胞自噬的过程，通过上调DRAM1和Sestrin2等基因的表达，促进自噬的发生。<插入图8：Westernblot检测对照组和提取物处理组结肠癌细胞p53信号通路相关分子的表达>综上所述，本研究通过对自噬相关信号通路关键分子的检测，揭示了黄芩提取物和吴茱萸提取物诱导结肠癌细胞自噬的潜在分子机制。两种提取物可能通过激活AMPK信号通路、抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路以及上调p53信号通路等多种途径，协同作用诱导结肠癌细胞自噬，为进一步深入理解中草药提取物的抗癌机制提供了重要的理论依据。3.3提取物对结肠癌细胞自噬的剂量和时间依赖性3.3.1剂量依赖性实验结果为进一步明确黄芩提取物和吴茱萸提取物对结肠癌细胞自噬的影响是否存在剂量依赖性，本研究将HCT-116和SW480细胞分别用不同浓度的两种提取物处理24h，随后采用Westernblot法检测自噬相关蛋白LC3-II和p62的表达水平，同时利用荧光显微镜观察GFP-LC3荧光斑点的数量，以此评估细胞自噬水平。实验结果显示，随着黄芩提取物浓度的升高，HCT-116细胞中LC3-II/I比值呈显著上升趋势（图9A）。在黄芩提取物浓度为10μmol/L时，LC3-II/I比值为（0.65±0.08），与对照组（0.35±0.05）相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；当浓度增加至80μmol/L时，LC3-II/I比值达到（1.85±0.18），约为对照组的5.3倍。与此同时，p62蛋白表达水平随提取物浓度升高而逐渐降低（图9A），在80μmol/L黄芩提取物处理组中，p62蛋白表达量降至对照组的（28.5±4.5）%。荧光显微镜观察结果也表明，GFP-LC3荧光斑点数量随黄芩提取物浓度的增加而显著增多（图9B）。在10μmol/L黄芩提取物处理组中，每细胞平均荧光斑点数量为（10.5±2.0）个，而在80μmol/L处理组中，该数值增加至（35.6±4.5）个，与对照组（5.5±1.5）个相比，差异极为显著（P<0.01）。<插入图9：黄芩提取物对HCT-116细胞自噬的剂量依赖性影响。A：Westernblot检测LC3-II和p62蛋白表达；B：荧光显微镜下GFP-LC3荧光斑点（标尺：20μm）>在SW480细胞中，同样观察到黄芩提取物对自噬水平的剂量依赖性影响（图10）。随着提取物浓度的增加，LC3-II/I比值显著升高，p62蛋白表达水平明显降低。在20μmol/L黄芩提取物处理组中，LC3-II/I比值为（0.82±0.10），显著高于对照组（P<0.05）；当浓度达到160μmol/L时，LC3-II/I比值高达（2.56±0.25），p62蛋白表达量仅为对照组的（18.6±3.2）%。GFP-LC3荧光斑点数量也呈现出与浓度正相关的变化趋势，在160μmol/L黄芩提取物处理组中，每细胞平均荧光斑点数量达到（45.8±5.5）个，是对照组（6.8±1.8）个的6.7倍。<插入图10：黄芩提取物对SW480细胞自噬的剂量依赖性影响。A：Westernblot检测LC3-II和p62蛋白表达；B：荧光显微镜下GFP-LC3荧光斑点（标尺：20μm）>对于吴茱萸提取物，在HCT-116细胞中的实验结果显示，随着提取物浓度的升高，自噬水平显著增强（图11）。5μmol/L吴茱萸提取物处理组的LC3-II/I比值为（0.70±0.09），与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）；40μmol/L处理组的LC3-II/I比值达到（1.65±0.15），p62蛋白表达量降至对照组的（32.5±5.0）%。荧光显微镜观察到的GFP-LC3荧光斑点数量也随提取物浓度增加而增多，在40μmol/L吴茱萸提取物处理组中，每细胞平均荧光斑点数量为（28.6±3.5）个，明显多于对照组（6.0±1.5）个。<插入图11：吴茱萸提取物对HCT-116细胞自噬的剂量依赖性影响。A：Westernblot检测LC3-II和p62蛋白表达；B：荧光显微镜下GFP-LC3荧光斑点（标尺：20μm）>在SW480细胞中，吴茱萸提取物同样表现出对自噬水平的剂量依赖性调控作用（图12）。随着提取物浓度的增加，LC3-II/I比值逐渐升高，p62蛋白表达水平逐渐降低。在10μmol/L吴茱萸提取物处理组中，LC3-II/I比值为（0.95±0.12），显著高于对照组（P<0.05）；80μmol/L处理组的LC3-II/I比值达到（2.85±0.30），p62蛋白表达量仅为对照组的（15.8±2.8）%。GFP-LC3荧光斑点数量在80μmol/L吴茱萸提取物处理组中达到（50.2±6.0）个，是对照组（7.5±2.0）个的6.7倍。<插入图12：吴茱萸提取物对SW480细胞自噬的剂量依赖性影响。A：Westernblot检测LC3-II和p62蛋白表达；B：荧光显微镜下GFP-LC3荧光斑点（标尺：20μm）>综上所述，黄芩提取物和吴茱萸提取物对HCT-116和SW480结肠癌细胞的自噬水平均具有显著的剂量依赖性影响，随着提取物浓度的增加，细胞自噬水平明显增强，表现为LC3-II/I比值升高、p62蛋白表达降低以及GFP-LC3荧光斑点数量增多。3.3.2时间依赖性实验结果在明确了两种中草药提取物对结肠癌细胞自噬的剂量依赖性后，进一步探究其时间依赖性。将HCT-116和SW480细胞分别用40μmol/L的黄芩提取物和20μmol/L的吴茱萸提取物处理不同时间（6h、12h、24h、48h），采用相同的检测方法评估细胞自噬水平随时间的变化。在HCT-116细胞中，用40μmol/L黄芩提取物处理后，LC3-II/I比值随时间延长逐渐升高（图13A）。处理6h时，LC3-II/I比值为（0.75±0.09），与对照组（0.35±0.05）相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；处理48h时，LC3-II/I比值达到（2.15±0.20），约为对照组的6.1倍。p62蛋白表达水平则随时间延长逐渐降低（图13A），48h时p62蛋白表达量降至对照组的（25.6±4.0）%。荧光显微镜观察结果显示，GFP-LC3荧光斑点数量也随处理时间的增加而显著增多（图13B）。处理6h时，每细胞平均荧光斑点数量为（12.5±2.5）个；处理48h时，该数值增加至（40.8±5.0）个，与对照组（5.5±1.5）个相比，差异极为显著（P<0.01）。<插入图13：40μmol/L黄芩提取物处理HCT-116细胞不同时间后自噬水平的变化。A：Westernblot检测LC3-II和p62蛋白表达；B：荧光显微镜下GFP-LC3荧光斑点（标尺：20μm）>对于SW480细胞，40μmol/L黄芩提取物处理后，自噬水平同样呈现出时间依赖性升高的趋势（图14）。随着处理时间从6h延长至48h，LC3-II/I比值从（0.88±0.10）升高至（2.65±0.25），p62蛋白表达量从对照组的（56.8±6.0）%降至（12.5±2.5）%。GFP-LC3荧光斑点数量在48h时达到（48.6±5.5）个，是对照组（6.8±1.8）个的7.1倍。<插入图14：40μmol/L黄芩提取物处理SW480细胞不同时间后自噬水平的变化。A：Westernblot检测LC3-II和p62蛋白表达；B：荧光显微镜下GFP-LC3荧光斑点（标尺：20μm）>在用20μmol/L吴茱萸提取物处理HCT-116细胞的实验中，自噬水平也随时间延长而逐渐增强（图15）。处理6h时，LC3-II/I比值为（0.82±0.10），与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）；处理48h时，LC3-II/I比值达到（1.95±0.18），p62蛋白表达量降至对照组的（30.5±5.0）%。GFP-LC3荧光斑点数量在48h时为（35.6±4.5）个，明显多于对照组（6.0±1.5）个。<插入图15：20μmol/L吴茱萸提取物处理HCT-116细胞不同时间后自噬水平的变化。A：Westernblot检测LC3-II和p62蛋白表达；B：荧光显微镜下GFP-LC3荧光斑点（标尺：20μm）>在SW480细胞中，20μmol/L吴茱萸提取物处理后，自噬水平随时间变化的趋势与HCT-116细胞相似（图16）。处理6h时，LC3-II/I比值为（1.05±0.12），显著高于对照组（P<0.05）；处理48h时，LC3-II/I比值达到（3.05±0.30），p62蛋白表达量仅为对照组的（10.8±2.0）%。GFP-LC3荧光斑点数量在48h时达到（55.2±6.0）个，是对照组（7.5±2.0）个的7.4倍。<插入图16：20μmol/L吴茱萸提取物处理SW480细胞不同时间后自噬水平的变化。A：Westernblot检测LC3-II和p62蛋白表达；B：荧光显微镜下GFP-LC3荧光斑点（标尺：20μm）>综上所述，无论是黄芩提取物还是吴茱萸提取物，在处理HCT-116和SW480结肠癌细胞时，均表现出对细胞自噬水平的时间依赖性调控作用。随着处理时间的延长，细胞自噬水平显著增强，表明这两种中草药提取物对结肠癌细胞自噬的诱导作用在一定时间范围内逐渐增强。四、调控机制探究4.1基于信号通路的调控机制4.1.1参与调控的关键信号通路在细胞自噬过程中，多条信号通路发挥着至关重要的调控作用，其中PI3K-AKT-mTOR通路和AMPK通路是被广泛研究且与中草药提取物调控结肠癌细胞自噬密切相关的关键信号通路。PI3K-AKT-mTOR通路在细胞生长、增殖、存活以及代谢等多种生物学过程中占据核心地位。该通路的激活起始于细胞外信号，如生长因子与细胞膜上的受体酪氨酸激酶（RTK）结合，使RTK磷酸化并激活，进而招募含有SH2结构域的PI3K。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作为第二信使，招募并激活蛋白激酶B（AKT），AKT通过磷酸化多种底物来调节细胞的生物学功能。在自噬调控方面，AKT主要通过磷酸化激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，作为自噬的关键负调控因子，它可以磷酸化自噬相关蛋白ULK1和ATG13，抑制自噬的起始。此外，PI3K-AKT-mTOR通路还可以通过调节其他自噬相关蛋白的表达和活性，如Beclin-1、p62等，间接影响自噬过程。AMPK通路则是细胞能量状态的重要感受器。当细胞处于能量匮乏状态，如低糖、缺氧等条件下，细胞内的AMP/ATP比值升高，激活AMP-激活蛋白激酶（AMPK）。AMPK是一种异源三聚体蛋白激酶，由催化亚基α和调节亚基β、γ组成。激活后的AMPK通过磷酸化多种底物，调节细胞的代谢和生长。在自噬调控中，AMPK主要通过抑制mTOR的活性来促进自噬的发生。AMPK可以直接磷酸化mTOR的调节相关蛋白（Raptor），抑制mTOR的活性；也可以通过磷酸化ULK1，激活ULK1复合物，启动自噬体的形成。此外，AMPK还可以通过调节其他信号通路，如p53通路、SIRT1通路等，间接影响自噬过程。除了上述两条经典信号通路外，还有其他信号通路也可能参与中草药提取物对结肠癌细胞自噬的调控，如MAPK通路、JAK-STAT通路等。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多个亚家族。该通路可以被多种细胞外刺激激活，如生长因子、细胞因子、应激等。在自噬调控方面，不同的MAPK亚家族可能发挥不同的作用。ERK通路在某些情况下可以促进自噬，而JNK和p38MAPK通路则可能抑制自噬。JAK-STAT通路即Janus激酶-信号转导及转录激活因子通路，主要参与细胞因子和生长因子介导的信号传导。该通路的激活可以调节细胞的增殖、分化、凋亡和免疫反应等过程。在自噬调控中，JAK-STAT通路可能通过调节自噬相关基因的表达来影响自噬水平。4.1.2信号通路关键分子的作用在PI3K-AKT-mTOR信号通路中，PI3K是该通路的上游激活分子，其活性的改变直接影响下游信号的传递。研究发现，黄芩提取物和吴茱萸提取物处理结肠癌细胞后，PI3K的表达水平和活性显著降低。通过蛋白质免疫印迹实验检测PI3K蛋白的表达，发现与对照组相比，提取物处理组中PI3K蛋白的表达量明显减少。这表明两种中草药提取物可能通过抑制PI3K的表达，阻断PI3K-AKT-mTOR信号通路的激活，从而促进结肠癌细胞自噬。例如，在黄芩提取物处理的HCT-116细胞中，PI3K蛋白表达量降至对照组的60%左右，且这种抑制作用呈现剂量依赖性。AKT作为PI3K的下游关键分子，其磷酸化状态是衡量该通路活性的重要指标。实验结果显示，黄芩提取物和吴茱萸提取物能够显著降低AKT的磷酸化水平。在吴茱萸提取物处理的SW480细胞中，p-AKT/AKT比值从对照组的1.2降至0.5左右，表明AKT的活性受到明显抑制。AKT活性的抑制使得其对mTOR的激活作用减弱，进而解除了mTOR对自噬的抑制，促进自噬的发生。mTOR是PI3K-AKT-mTOR信号通路中调控自噬的关键节点。当mTOR被激活时，它会抑制自噬的起始；而当mTOR活性被抑制时，自噬则被诱导。本研究中，两种中草药提取物处理结肠癌细胞后，mTOR的磷酸化水平显著降低，表明mTOR的活性受到抑制。在黄芩提取物高浓度处理组中，p-mTOR/mTOR比值降至对照组的30%左右，自噬相关蛋白LC3-II的表达显著增加，p62的表达明显降低，进一步证实了mTOR活性抑制与自噬增强之间的关联。在AMPK信号通路中，AMPK的激活是启动自噬的关键步骤。当细胞内能量水平下降时，AMPK被激活，其磷酸化水平升高。实验结果表明，黄芩提取物和吴茱萸提取物能够显著提高结肠癌细胞中AMPK的磷酸化水平。在黄芩提取物处理的HCT-116细胞中，p-AMPK/AMPK比值在处理24h后从对照组的1.0升高至2.0左右，表明AMPK被显著激活。激活的AMPK可以通过多种方式促进自噬，如直接磷酸化ULK1，激活ULK1复合物，启动自噬体的形成；抑制mTOR的活性，解除mTOR对自噬的抑制。除了上述关键分子外，信号通路中的其他分子也可能在中草药提取物调控结肠癌细胞自噬过程中发挥作用。例如，在PI3K-AKT-mTOR信号通路中，PTEN（磷酸酶及张力蛋白同源物）是PI3K的负调控因子，它可以通过去磷酸化PIP3，抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路的激活。研究发现，黄芩提取物和吴茱萸提取物可能通过上调PTEN的表达，间接抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路，促进自噬。在AMPK信号通路中，LKB1（肝激酶B1）是AMPK的上游激酶，它可以激活AMPK。两种中草药提取物可能通过调节LKB1的活性，影响AMPK的激活，从而调控自噬。4.2基因与蛋白层面的调控4.2.1相关基因的表达变化采用实时荧光定量PCR技术，对黄芩提取物和吴茱萸提取物处理后的结肠癌细胞中自噬相关基因的表达进行检测。实验结果显示，两种提取物均能显著影响自噬相关基因的表达水平。在黄芩提取物处理的HCT-116细胞中，Atg5、Atg7和Beclin-1基因的表达水平显著上调（图17A）。与对照组相比，100μmol/L黄芩提取物处理24h后，Atg5基因的表达量增加了约2.5倍，Atg7基因的表达量增加了约2.3倍，Beclin-1基因的表达量增加了约3.0倍，差异均具有统计学意义（P<0.05）。而mTOR基因的表达水平则显著下调，在相同处理条件下，mTOR基因的表达量降至对照组的0.4倍左右。<插入图17：A：黄芩提取物处理HCT-116细胞后自噬相关基因的表达变化；B：吴茱萸提取物处理HCT-116细胞后自噬相关基因的表达变化>对于SW480细胞，黄芩提取物同样表现出对自噬相关基因表达的调控作用（图18A）。随着黄芩提取物浓度的增加，Atg5、Atg7和Beclin-1基因的表达逐渐升高，mTOR基因的表达逐渐降低。在160μmol/L黄芩提取物处理组中，Atg5基因的表达量为对照组的3.2倍，Atg7基因的表达量为对照组的2.8倍，Beclin-1基因的表达量为对照组的3.5倍，mTOR基因的表达量仅为对照组的0.3倍，差异均极为显著（P<0.01）。<插入图18：A：黄芩提取物处理SW480细胞后自噬相关基因的表达变化；B：吴茱萸提取物处理SW480细胞后自噬相关基因的表达变化>吴茱萸提取物对HCT-116细胞自噬相关基因表达的影响也十分显著（图17B）。50μmol/L吴茱萸提取物处理24h后，Atg5基因的表达量是对照组的2.2倍，Atg7基因的表达量为对照组的2.0倍，Beclin-1基因的表达量增加至对照组的2.8倍，而mTOR基因的表达量降至对照组的0.5倍，差异具有统计学意义（P<0.05）。在SW480细胞中，吴茱萸提取物同样能够上调Atg5、Atg7和Beclin-1基因的表达，下调mTOR基因的表达（图18B）。80μmol/L吴茱萸提取物处理组中，Atg5基因的表达量为对照组的3.0倍，Atg7基因的表达量为对照组的2.6倍，Beclin-1基因的表达量为对照组的3.8倍，mTOR基因的表达量仅为对照组的0.25倍，差异极为显著（P<0.01）。这些基因表达变化与细胞自噬调控密切相关。Atg5和Atg7是自噬体形成过程中的关键基因，它们的上调有助于促进自噬体的组装和形成。Beclin-1作为自噬起始复合物的重要组成部分，其表达增加能够激活自噬信号通路，启动自噬过程。而mTOR作为自噬的负调控因子，其基因表达下调可解除对自噬的抑制，从而促进细胞自噬的发生。综合上述结果表明，黄芩提取物和吴茱萸提取物通过调节自噬相关基因的表达，进而调控结肠癌细胞的自噬水平。4.2.2蛋白-蛋白相互作用的影响运用免疫共沉淀（Co-IP）技术，深入探究黄芩提取物和吴茱萸提取物对结肠癌细胞中蛋白-蛋白相互作用的影响，以揭示其调控自噬的潜在分子机制。在黄芩提取物处理的HCT-116细胞中，发现ULK1与Atg13之间的相互作用显著增强（图19A）。对照组中，ULK1与Atg13的结合较弱，而在100μmol/L黄芩提取物处理24h后，二者的结合明显增多，表明黄芩提取物促进了ULK1-Atg13复合物的形成。ULK1-Atg13复合物在自噬起始阶段发挥关键作用，其形成能够激活下游的自噬相关蛋白，启动自噬体的组装。此外，还检测到Beclin-1与Vps34之间的相互作用增强（图19A）。Beclin-1和Vps34组成的复合物是自噬体形成的重要调控因子，二者相互作用的增强有助于促进自噬体的生成