酒酒球菌酸胁迫抗性突变菌株UVa32、UVas35特性分析

PAGEPAGEI酒酒球菌酸胁迫抗性突变菌株UVa32、UVas35特性分析摘要酒酒球菌是革兰氏阳性细菌，属于酒球菌属，是引起并完成苹果酸-乳酸发酵的主要微生物，在酿酒方面起着重要的作用，而苹果酸-乳酸发酵能够提高葡萄酒品质，有降低酸度、修饰风味、增加生物稳定性。但是酒精发酵结束后的葡萄酒生存环境是极其恶劣和复杂的，低pH值、高酒精浓度和高SO2等均会对酒酒球菌的生长和代谢造成影响[1]，因此酒酒球菌既需要具有良好的发酵能力，又应当具有良好的抗胁迫能力[2]。本实验以酒酒球菌SD-2a、酸胁迫抗性突变菌株UVa32、UVas35为研究对象，将其培养在pH值不同的培养基中，通过检测菌株SD-2a、UVa32和UVas35的生长情况、苹果酸乳酸发酵速率，氨基酸代谢情况和β-葡萄糖苷酶活力变化，分析菌株SD-2a、UVa32和UVas35的特性并比较菌株间的特性差异。关键词：酒酒球菌苹果酸-乳酸发酵酸胁迫

Characteristicsofacidstressresistantmutantsuva32anduvas35ofOenococcusoeniAbstractAsagram-positivebacteriumbelongingtothegenusdioscococcus,Oenococcusoeniplaysanimportantroleinwinemakingandisthemainmicroorganismthatcausesandcompletesmalolacticfermentation，Andmalolacticfermentationcanimprovethequalityofthewine,hasaloweracidity,modifyflavor,increasethestabilityofthebiologicaleffects.Thelivingenvironmentofwineafteralcoholfermentationisextremelyharshandcomplex,andlowpHvalue,highalcoholconcentrationandhighSO2willaffectthegrowthandmetabolismofOenococcusoeni.ThisexperimentbyOenococcusoeniSD-2a,acidstressresistancemutationstrainsUVa32,UVas35astheresearchobject,itscultivationinthepHofthemedium,bydetectingstrainSD-2a,UVa32andUVas35growthsituation,malolacticfermentationrateandaminoacidmetabolismandβ-glycosidaseenzymeactivitychange,analysisofstrainSD-2a,UVa32andUVas35characteristicsandcomparethecharacteristicsofthedifferencesbetweenstrains.Keywords:Oenococcusoeni；Malolacticfermentation；Acidstress目录文献综述 11.1苹果酸-乳酸发酵 11.2酒酒球菌 2第二章材料与方法 32.1实验材料与仪器 32.1.1实验材料 3 2.1.2仪器与设备 32.2试验方法 32.2.1生长曲线的测定 32.2.2β-葡萄糖苷酶活力测定 42.2.3苹果酸测定 42.2.4氨基酸测定 4第三章结果与分析 53.1实验结果及分析 53.1.1菌株生长曲线 53.1.2苹果酸乳酸含量曲线 83.1.3β-葡萄糖苷酶活力 93.1.4氨基酸含量 93.2结论 103.3展望 11参考文献 12谢辞 13第一章文献综述1.1苹果酸-乳酸发酵苹果酸-乳酸发酵，又被叫做MLF（MalolacticFermentation），是葡萄酒酿造过程中不可缺少的环节，当酒精发酵结束后，L-苹果酸在苹果酸乳酸酶的催化作用下直接转变为L-乳酸，并且释放出CO2，这个过程主要是由酒类酒球菌引起[3]。大多数红葡萄酒、白葡萄酒和一些汽酒最终的质量与苹果酸-乳酸发酵紧密相连。在葡萄酒的酿造过程中，生葡萄酒的酸涩和粗糙感可以通过\t"/item/%E8%8B%B9%E6%9E%9C%E9%85%B8-%E4%B9%B3%E9%85%B8%E5%8F%91%E9%85%B5/_blank"苹果酸-乳酸发酵降低，使葡萄酒的口感变得柔和、圆润，并增加了葡萄酒的感官质量和生物稳定性，因此苹果酸乳酸发酵成为许多优质红葡萄酒甚至一些佐餐红葡萄酒不可或缺的环节。因为地域气候不同，不同地区的葡萄酒酿造过程也存在差异。在寒冷干燥的北方地区生长的水果酸度较高，酿造出的果酒口感较酸涩，因此需要进行苹果酸乳酸发酵来改善其风味。而在温和湿润的南方地区生长的水果酸度较低，则不用进行苹果酸乳酸发酵。pH、乙醇、氧和二氧化碳、温度、SO2等是影响苹果酸-乳酸发酵的因素，其中主要的因素是pH，它提供了质子梯度，对哪些种类的乳酸菌出现也起到了决定作用，对微生物生长的速率也造成了一定的影响，当pH降低至一定程度时，就会抑制微生物的生长[4]。另外微生物的代谢也会被pH值的大小影响，当pH值处于3.2以下时苹果酸被许多乳酸菌分解，当pH值为3.5时则开始糖的分解。当pH值为3.8时，苹果酸-乳酸发酵的速率则高于pH3.8以下时的速率，当pH值为3.2时比当pH值为3.8时慢10倍。有些菌株耐酸性较强，在pH3.5以下的葡萄酒中，酒类酒球菌可以较好的生存和生长，而在较高的pH环境下片球菌和乳杆菌才可以生存和生长。苹果酸-乳酸发酵对葡萄酒的品质也有着很重要的作用，例如葡萄酒的酸度降低、微生物的稳定性提高，以及葡萄酒的口感、色泽、香气等发生改变都与苹果酸-乳酸发酵有着巨大的关系。葡萄酒中的乳酸菌，尤其是酒酒球菌代谢产生的β-葡萄糖苷酶对葡萄酒香气品质的提升效果尤为显著[5]。葡萄酒中经苹果酸-乳酸发酵后，含有氨基酸、益生菌、有机酸、多酚类物质、高级醇和脂类等活性成分。1.2酒酒球菌一般将从葡萄酒中分离出来并自然存在的苹果酸-乳酸菌分为四个属，这四个属分别为片球菌属、明串珠菌属、酒球菌属和乳杆菌属[6]，约包括40种菌。在葡萄酒中处于主导地位的是酒球菌属，一般片球菌和乳杆菌的生长在低于pH3.5的环境中受到威胁，目前用于接种的乳酸菌几乎均为酒球菌属细菌。酒酒球菌属是一种具有成对或成链排布的球型或者椭圆型细胞，革兰氏阳性、兼性厌氧的化能有机营养型细菌，20℃～30℃是其最适生长温度，可以在乙醇浓度为10%（v/v）的培养基中生长。酒酒球菌喜好偏酸性环境，pH值为4.8~5.5时为生长最适pH值[7]，经过研究发现，酒酒球菌的细胞膜结构和成分会在低pH值环境下发生改变，进而抑制了菌株的生长[8-9]，但酒酒球菌一般在pH3.5～3.8葡萄汁和果酒中生长，其在起始pH4.8的条件下生长更好。葡萄酒中pH值一般低于3.5，因此对于酒酒球菌来说，葡萄酒是一个酸胁迫环境,pH值的高低限制了苹果酸-乳酸发酵能否顺利进行。酒酒球菌是导致并完成苹果酸-乳酸发酵的重要菌种，但酒精发酵结束后的葡萄酒生存环境是具有威胁性的,酒酒球菌的生长和代谢会被低pH值、高酒精浓度和高SO2等所影响[1]。因此，酒酒球菌在葡萄酒生存环境中的抗胁迫能力及糖苷酶的活性，对苹果酸-乳酸发酵的引发、终止以及葡萄酒的感官品质产生很大影响，由此我们得出良好的发酵能力,以及具有良好的抗胁迫能力是优良的酒酒球菌应具有的特性。筛选得到良好抗胁迫能力的菌株对于葡萄酒的发展具有重要意义。滨州学院本科毕业设计（论文）PAGE3第二章材料与方法2.1实验材料与仪器2.1.1实验材料菌种：酒酒球菌SD-2a，酸胁迫抗性突变菌株UVa32、UVas35FMATB培养基:主要用于菌株的配养，成分如下（1L）：FMATB培养基成分成分含量酵母浸粉5g蛋白胨10g葡萄糖2g果糖3gL-苹果酸5gMnSO4·4H2O0.05gMgSO4·7H2O0.2g盐酸半胱氨酸0.5g番茄汁250mL蒸馏水750mL番茄汁的制备：将番茄放入沸水中进行蒸煮，蒸煮一段时间后，将番茄捞出，把番茄的皮去除，用纱布挤汁过滤，过滤后放入离心管中，进行离心，离心结束后倒入丝口瓶中于高压蒸汽锅中灭菌（121℃，20min）后以备使用。2.1.2仪器与设备电子天平、超净工作台、培养箱、离心机、酶标仪、96孔板、pH计、高压蒸汽灭菌锅、高效液相色谱仪、恒温水浴锅、超声波细胞粉碎仪、酒精灯、移液枪、冰箱等2.2实验方法2.2.1生长曲线的测定器材准备：取三角瓶和试管，进行清洗，灭菌，以备使用。按照相应配比关系制备FMATB液体培养基，向培养基中加入盐酸溶液，将pH调至2.8，分装到三角瓶和试管中，每只三角瓶中装入150mL，每支试管中装入10mL；将剩下的培养基液体，加入NaOH溶液将pH调至3.0，分装到三角瓶和试管中，每只三角瓶中装入150mL，每支试管中装入10mL；然后再将剩下的培养基液体，利用NaOH溶液分别调至3.2、4.8，再进行上述同样操作。将装有液体培养基的三角瓶和试管放入高压蒸汽灭菌锅中，于121℃下灭菌20min，灭菌后将其放凉。将斜面保存菌种接种活化于三角瓶和试管中,放入培养箱中于28℃下培养4d。将试管取出，在每支试管中吸取200μL菌液放入96孔板中，利用酶标仪在600nm下测量吸光度，连续测量7天左右，另取100μL菌液放入离心管中，保藏于冰箱中，待测量苹果酸含量时使用。取出菌液后，将试管放回培养箱中继续培养，记录吸光度值，以菌株培养时间为横坐标，菌悬液的光密度（OD600nm）值绘制生长曲线图。2.2.2β-葡萄糖苷酶活力测定取1mL菌体放入离心管中进行离心，然后用1mL0.85%NaCl洗涤沉淀两次，最后使菌体及破碎残体分别悬浮于0.5mL的0.85%NaCl溶液中，再加入0.5mL的2×柠檬酸磷酸缓冲液/对硝基苯-β-葡萄糖苷，将其放入恒温水浴锅中在37℃条件下处理1h，待其反应停止后立即加入二倍体积的1.0MNa2CO3溶液使反应停止。在8000rpm，4℃，15min的条件下进行离心，离心结束后各吸取上清液200μL于96孔板上，在400nm下测定吸光度。根据公式Abs(600nm)=OD600nm/2.6168计算得到菌体干重。酶活定义：在上述反应条件下，每克细菌（干重）每分钟生成pNP的量。酶活力单位：对硝基苯酚μmol/（g·min）。2.2.3苹果酸测定取出存放于冰箱中装有100μL菌液的离心管，将其放入离心机中进行离心，待离心结束后，取10μL上清液放入另一支离心管中，向其加入90μL清水进行十倍稀释，利用高效液相色谱仪测量苹果酸含量。2.2.4氨基酸测定将三角瓶中的菌液进行离心，利用1mL清水进行洗涤沉淀将沉淀转移到另一只离心管中，再加入4mL清水，利用超声波细胞粉碎仪粉碎细胞，细胞粉碎完成后，将菌液混匀，吸取10μL菌液于小离心管中，加入90μL清水进行十倍稀释，利用高效液相色谱仪测量氨基酸含量，将相应数据记录下来，利用SPSS分析软件处理相应数据。第三章结果与分析3.1实验结果与分析3.1.1菌株生长曲线将每天利用酶标仪测量的酒酒球菌SD-2a、UVa32和UVas35的OD600nm值记录和整理，并将其绘制成菌株生长曲线。生长曲线如下图：图1：酒酒球菌SD-2a、UVas35、UVa32处于pH2.8时的生长曲线图2：酒酒球菌SD-2a、UVas35、UVa32处于pH3.0时的生长曲线图3：酒酒球菌SD-2a、UVas35、UVa32处于pH3.2时的生长曲线图4：酒酒球菌SD-2a、UVas35、UVa32处于pH4.8时的生长曲线图5：酒酒球菌SD-2a、UVas35、UVa32在模拟酒环境中生长曲线图1中，菌株SD-2a、UVas35随着培养时间的增长，菌株浓度并无明显的增加，而菌株UVa32在第五天时，其生长浓度有了明显增加；图2中，菌株UVa32在第三天时浓度开始增加，在第七天时生长浓度基本达到最高峰，菌株SD-2a在第六天时浓度快速增加，在第八天时基本达到最高峰，菌株UVas35浓度无明显变化；图3中，菌株UVa32在第二天后菌株浓度快速增长，菌株SD-2a随着培养时间增长，其浓度也随之增长，UVas35菌株浓度无明显变化；图4中，菌株SD-2a，UVa32、UVas35在第二天后，其浓度迅速增长，且在第三天后基本达到最高峰；图5中，菌株UVa32浓度增加迅速，UVas35第五天后明显增长，而菌株SD-2a其增长并不明显。对比表1、表2、表3和表4中的生长曲线，随着pH值的减小，菌株UVa32的生长浓度逐渐减小，但其生长浓度仍比在模拟酒中大且其浓度仍大于菌株SD-2a；菌株UVas35生长基本停滞，其浓度比在模拟酒中小；菌株SD-2a生长浓度逐渐减小。3.1.2苹果酸乳酸含量曲线以利用高效液相色谱仪测得的苹果酸浓度为纵坐标，菌株生长时间为横坐标绘制苹果酸含量消耗曲线（下列图6）；另外以测得的乳酸浓度为纵坐标，菌株生长时间为横坐标绘制乳酸生长曲线（下列图7）,观察各菌株的苹果酸-乳酸发酵情况。图6：酒酒球菌SD-2a、UVas35、UVa32苹果酸消耗图7：酒酒球菌SD-2a、UVas35、UVa32乳酸生成根据图6可以看出，苹果酸浓度从大到小依次为，菌株UVa32、菌株UVas35、酒酒球菌SD-2a，且菌株SD-2a苹果酸浓度随培养时间增长其变化并不明显；根据图7可以看出，菌株UVa32中乳酸浓度逐步增加，但在第六天以后乳酸浓度开始下降；菌株UVas35乳酸浓度逐渐增大，第六天后，其乳酸浓度高于菌株UVa32；菌株SD-2a乳酸浓度有不明显变化。3.1.3β-葡萄糖苷酶活力菌株编号酶活力μmol/（g·min）模拟酒pH3.0pH4.8Uva320.996024161.0857761780.245408359Uvas352.0444321451.5972171850.337029249SD-2a2.6784754212.3782699670.272452058表8：酒酒球菌SD-2a、UVas35、UVa32酶活力变化根据上表可以看出，菌株UVa32、UVas35和SD-2a在pH3.0时的酶活力均要大于pH4.8时的酶活力，但菌株UVas35、SD-2a在pH3.0时的酶活力小于在模拟酒中的酶活力，菌株UVa32在pH3.0时的酶活力要大于在模拟酒中的酶活力。3.1.4氨基酸含量以下两个图表表示pH3.0、pH4.8时酒酒球菌中各种氨基酸浓度：同菌株小写字母不同表示差异显著（P＜0.05），下同。图9：pH3.0时，菌株SD-2a、UVas35、UVa32氨基酸含量图10：pH4.8时，菌株SD-2a、UVas35、UVa32氨基酸含量根据图9和图10，菌株中含量较多的氨基酸有谷氨酸甘氨酸，精氨酸，丙氨酸，氯化铵，随着pH值改变，各氨基酸的浓度都发生了一定的改变。3.2讨论为了研究菌株UVa32、UVas35的特性，该实验检测了不同pH值下菌株的生长浓度，β-葡萄糖苷酶活力和菌株中苹果酸乳酸、氨基酸浓度，得出了以下结论：（1）根据上述5个生长曲线图，可以看出在低pH值时，菌株UVa32具有更好的酸耐受性；菌株UVas35在pH值小于3.0时，其生长受到了抑制作用，酸耐受性较差；菌株SD-2a在pH值处于2.8时，其生长受到了抑制作用，而当pH值大于2.8时，其生长略小于菌株UVa32，菌株SD-2a的酸耐受性较差于菌株UVa32。根据上述苹果酸消耗和乳酸生成图，可以看出苹果酸-乳酸发酵能力强度大小从大到小依次为菌株UVa32、菌株UVas35、菌株SD-2a，菌株UVa32具有很好的酸耐受性。在pH3.0时，菌株SD-2a、UVas35的酶活力与在模拟酒中的酶活力相比较弱，说明其酶的活性受到了抑制，而菌株UVa32的酶活力与在模拟酒中的酶活力相比强一点，说明菌株UVa32的酸耐受性要强于菌株UVas35和菌株SD-2a；在pH4.8时，三种菌株酶活力均降低，说明此时酶的活性均受到抑制。综上所述，可得到菌株UVa32具有良好的酸耐受性，而菌株UVas35则对酸具有一定的敏感性，但菌株UVas35在酸性环境下形成酶活性强一些，对葡萄酒香味的形成具有一定意义。3.3展望葡萄酒的品质与苹果酸-乳酸发酵有着密切的联系，降低葡萄酒的酸度、提高微生物的稳定性，以及改变葡萄酒的口感、色泽、香气都是苹果酸-乳酸发酵的。是引起并完成苹果酸-乳酸发酵的重要菌种是酒酒球菌，但葡萄酒中的环境威胁着酒酒球菌的生长和生存，因此具有良好抗胁迫能力的酒酒球菌对葡萄酒产业有很大影响。本实验中的酸胁迫抗性突变菌株UVa32具有较好的酸耐受性，将其投入到葡萄酒生产中，对葡萄酒产业的发展具有重要意义。参考文献[1]谢昉书,文向圆,刘树文.酒酒球菌(Oenococcusoeni)耐酸突变株苹果酸-乳酸发酵能力分析[J].食品科学,2019,40(02):93-101.谢昉书.诱变酒酒球菌菌株苹果酸—乳酸发酵及其对葡萄酒香气的影响[D].西北农林科技大学,2018.任晓宁,张宇,陈其玲,刘树文.不同发酵条件对模拟葡萄酒中酒酒球菌柠檬酸代谢的影响[J].食品工业科技,2017,38(04):180-185+190.刘晓娇.不同因素对酒酒球菌苹果酸—乳酸发酵的影响[D].西北农林科技大学,2011.杨世玲.酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性及其对葡萄酒香气的影响研究[D].西北农林科技大学,2015.孙炜宁,张巧格,李兴兴,韩烨.葡萄酒酿造过程中微生物多样性的研究现状[J].食品研究与开发,2014,35(18):365-368.赵红玉,李华,刘龙祥,彭帅,王华.酒酒球菌胁迫适应性机制的研究进展[J].中国食品学报,2019,19(07):292-299.BetteridgeAlice,GrbinPaul,JiranekVladimir.ImprovingOenococcusoenitoovercomechallengesofwinemalolacticfermentation.[J].Pubmed,2015,33(9).SumbyKristaM,GrbinPaulR,JiranekVladimir.Implicationsofnewresearchandt