卷旋孢科部分真菌形态描述

1前言水生真菌（Aquaticfungi）是指整个生活史或生活史的部分阶段依赖于水环境的真菌，具有丰富的多样性[1]。水生真菌类群包括担子菌门、子囊菌门、接合菌门、壶菌门等几乎所有真菌门类。水生真菌在生态系统中扮演着很重要角色[2]。水体环境中的动物可以将水生真菌的菌丝或孢子作为食物，真菌进入生态系统的食物链和食物网中。这样，真菌就参与了生态系统的物质循环和能量循环。在生态系统的物质循环中，水生真菌作为分解者能分解有机物从而引起营养物质和含碳物质的释放，清洁水环境。水生真菌在自然界中能分解动植物遗骸，分解出的碎屑能帮助原生动物吸收利用营养物质、促进碳循环。水生真菌能在多种基质上生长，有的生长在植物体或动物体上能引起水生植物和动物患病[3-5]。另外有些水生真菌还是水生植物的内生菌，与植物共生或寄生[6]。已有研究表明水生真菌还是一个强大的抗生素生产集团[7]。卷旋孢科(Tubeufiaceae)隶属于子囊菌门(Ascomycota)，座囊菌纲(Dothideomycetes)，卷旋孢目(Tubeufiales)，截止目前，卷旋孢科共包含42属[10]，对卷旋孢科真菌的报道最先始于陆生木质基质上的腐生真菌，有研究者发现还可以从水生环境中采集得到卷旋孢科真菌。由此陆续展开了对水生环境中卷旋孢科的资源调查。然而，对滇西北地区卷旋孢科真菌未见系统研究。Boonmee在2014年建立了Tubufiales目。基于分子系统发育研究，Suetrong等人将Tubufiaceae科纳入该目[11]。Tubeufiaceae科是由Barr在1979年建立的[12]。之后，Boomenee、Rajeshkumar、Sharma等发表了许多对该类群的研究[13]。随着对水生真菌研究的逐渐深入，卷旋型真菌成为分类学的一个研究对象，Helicomyces，Helicosporium以及Helicoma是最早建立的三个卷旋型真菌属[14]。1985年Goos系统研究了这三个属，并提出了他们的区别：Helicoma的孢子为非吸湿性的，分生孢子较粗，而Helicomyces和Helicosporium的孢子遇水卷旋松散，并且分生孢子较细[15]，Helicosporium属的分生孢子梗发育良好，而Helicomyces的分生孢子梗发育较差或缺少等特性[16]。2017年卢永仲、罗宗龙、刘建魁等人对该科进行详细的形态学与系统学研究。云南地区罗宗龙介绍了Tubeufiaceae科的一个新属，四个新种。在对该科的长期研究过程中，逐渐形成了一些形态学描述的专业词汇，Helicospore:卷旋孢，该术语的释义为“孢子有或无隔膜，沿中心轴（通常孢子延伸的方向）弯曲至少180度”，或者在二维或者三维空间进行一至多次螺旋[17]。Goos曾对卷旋孢的卷旋形状做出描述，共有8种卷旋类型：分别为半漩涡状，漩涡状，平面卷旋，螺旋状，扭曲螺旋，桶状卷旋，网格状卷旋，叉状卷旋；吸湿性：分生孢子形态较为伸展，无卷旋或在水中呈轻微卷旋的[18]。非吸湿性的：分生孢子呈卷旋状态，在水中并不延伸，不解开螺旋。二维螺旋：分生孢子在同一个平面内卷旋两次/圈（或以上）从而形成一个扁平状分生孢子，产这种类型分生孢子的属包括Helicomyces，Helicosporium和helicoma[19]。本研究以前期从滇西北地区河流和湖泊中采集到的沉水腐木上的卷旋孢科(Tubeufiaceae)菌株为基础，同时采用随机取样的方法继续采集沉水腐木样品，保湿培养一周后镜检，拍摄其菌落外形及微观形态（分生孢子梗，产孢细胞，分生孢子）采用单孢分离的方法对卷旋型孢子水生真菌进行分离，获得纯培养。进而提取所获得的卷旋型丝孢菌DNA，以ITS，LSU，RPB2及TEF为引物进行PCR并测序[20]。最终结合形态学特征及分子序列比对联合分析的方法对所获菌株进行准确鉴定并做形态学描述与系统学分析，确定菌株在自然生态系统中的属种地位及其各物种之间的关系。2材料与方法2.1样品处理标本编号，将随机采的采取到的沉水腐木带回实验室按采集地点、时间、采集人进行编号。将处理好的样品放入75%酒精消毒后的封闭塑料盒中，在塑料盒底铺上已经灭过菌的吸水纸，并且在吸水纸上铺3根已经进行过灭菌处理的吸管，放入吸管的目的是隔离样品和吸水纸，最后倒入适量无菌水（将铺好的吸水纸全润湿，没有多余水滴滴漏出来），最后在室温下进行一周保湿培养后，开始观察样品上的菌株生长及多样性情况。2.2样品观察和拍摄进行一周保湿培养后，首先将样品置于GL-99B1连续变倍体视镜下进行观察，查看菌落的生长情况，种数。然后对所观察到的真菌进行制片，将观察到的菌株挑取到滴有无菌水的载玻片上制成水玻片后在生物显微镜下观察，初步确定所挑取的菌株为水生真菌后，在OLYMPUSBX51显微镜下进行拍照、后期拼图时进行梗及孢子长度的测量。每个菌株在拍摄时至少拍摄50个分生孢子及5–10个完整的产孢梗。2.3培养基及其制备WA培养基的配方：琼脂条9g，蒸馏水500ml；PDA培养基的配方：去皮马铃薯100g，葡萄糖10g，琼脂条8.5g，蒸馏水加至500ml；MEA培养基的配方：麦芽浸粉7.5g，琼脂条8.5g，蒸馏水100ml；经高压蒸汽灭菌(121℃，30min)后冷却至50℃时加入终浓度为0.5mg/ml阿莫西林混匀后，倒入平板备用。2.4菌株描述进行拼图描述时，要选取该菌株典型的各部分结构图片，如产孢的生长方式、产孢结构、分生孢子梗、要有典型有代表性的孢子形状（孢子形状要拍齐全，各类孢子形状都要有）、孢子的大小、孢子的颜色、隔膜要尽量拍清晰、孢子纹饰、色泽等图片。将拍好的图片整理好后用Photoshop软件进行拼图。拼好的每一副图片都要包含该菌株的基本特征如：在基质上的菌落形态图、完整的孢子与梗的形态图、产孢结构、在培养基上的菌落特征、不同形态与大小的孢子、孢子分隔情况、孢子梗颜色形状与大小等可作为分类依据及其特征及其它特殊特征进行描述。2.5形态学鉴定2.5.1需要记录的形态学特征有：菌落的形态特征，散生生长或者聚生生长，颜色的有无，稀疏或密集。2.5.2分生孢子：需要观察和记录的特征包括，分生孢子大小、颜色情况，表面光滑或粗糙程度，有无纹饰，有无隔膜，是否有附属物、附属丝。根据孢子的形状大小可以分为圆球形、卵圆形、椭圆形、圆柱形、纺锤形、长方形、倒棍棒形、倒梨形、镰刀型等。2.5.3分生孢子梗单生或聚生，分隔或者不分隔，分支与否，分隔数，形状，颜色等。2.5.4产孢细胞：形状、延伸方式、颜色等。2.5.5分生孢子丝是否平行地从二个方向或三个方向卷旋，分生孢子是否具有吸湿性，是否有颜色，成熟的分生孢子是否有突刺状突起，原始的分生孢子的种类等形态特征是分类的重要标准[21]。2.5.6水生真菌的栖息环境有，湖泊、池塘、溪流、淡水或陆地环境，另外在底泥，泡沫，废弃垃圾中、水体落叶、沉水腐木、水生动植物中都有分布，生活方式可以是腐生或寄生。2.5.7分生孢子丝的宽度及隔膜的多少，内含物的有无及清晰程度。2.5.8分生孢子的颜色：分生孢子颜色色彩丰富多样，有红色的子囊果，有褐色孢子和梗、灰色、黑色、淡黄色、黄色；也有无色透明的孢子与梗。2.5.9卷旋型丝孢菌的分生孢子卷旋方向：分生孢子有顺时针或逆时针的；鉴定时可以依据分生孢子丝的卷曲程度的松紧来区分（也就是孢子的吸湿性与非吸湿性）[22]；分生孢子丝的螺旋卷旋周数是鉴定时的一大重要特征，在测量时用卷旋孢子的成熟孢子作为最终的尺寸大小；培养特征：培养出的纯培养可以作为有性型-无性型的联系的参考依据（如有性型的纯培养可能会生长出无性型菌株，这样就可以将有性型-无性型相联系起来）。2.6数据分析本研究最终的多样性分析采用香农–威纳指数（H´）[23]来进行，香农–威纳指数（H´）的计算公式为：Pi为该采样点中某种水生真菌的数目比上该采样点中所有水生真菌的数目，S是所有真菌的种数。水生真菌物种检出率（％）=（某个物种检出次数/样本总数）×100％。卷旋孢科物种检出率（%）=（某种卷旋孢科真菌检出次数/总的卷旋孢菌株数）×100％2.7前期基础数据整理整理并找出已进行外形拍摄的卷旋孢属的菌株图片及其纯培养。2.8分子生物学鉴定2.8.1DNA提取PCR扩增和测序基因组DNA提取自25-27℃下用PDA培养基培养出来的新鲜菌丝。采用真菌DNA提取试剂盒“EZgeneTMfungalgDNAKit(GD2416)”提取DNA，按说明书提取。采用PCR扩增ITS、LSU、SSU、RPB2、TEF基因对应的引物为ITS5/ITS4、LROR/LR7、NS4、fRPB2-7cR、983F/2218R。PCR扩增热循环反应参考苏老师文章进行设置，用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物结果。最后将提取出的PCR产物送到北京擎科生物技术有限公司昆明分公司进行基因组DNA测序。2.8.2分子系统发育分析及物种鉴定将测序结果序列在NCBI网站数据库BLAST程序中进行序列相似性比对。将测序出来的菌株分子序列用/nuccore网站和/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome网站进行相似性比对。3结果3.1物种形态学鉴定与分子序列比对结果根据形态学特征及部分DNA序列比对，共分离纯化得到152株螺旋菌株，经过初步分离、纯化、分类、整理，共鉴定得到121株6属22种卷旋孢科丝孢菌，分别为蜗孢属Helicoma、卷丝孢属Helicomyces、卷旋孢属Helicosporium、Neohelicomyces、Neohelicosporium、和Tubeufia。其中有31株未鉴定到属种。通过形态学鉴定及其分子序列比对对分离鉴定得到的6属进行形态描述分析，确定种属的分类地位，最后提供6属卷旋孢的最新描述和图版。3.2卷旋孢科部分真菌形态描述3.2.1Helicomapalmigenum(Penz.&Sacc.)Linder,Ann.Mo.bot.Gdn16:306(1929)在自然基质上菌落平展，淡褐色，毛发状。菌丝体部分表生，部分埋深，基质部分有分枝、具隔、淡褐色至深褐色，壁光滑的菌丝体组成。分生孢子梗粗大，单线型，单生，不分枝，直立，壁光滑，具有5–11个隔膜，褐色至深褐色，顶部颜色渐淡，长103–214μm，(=148μm)，宽6–14μm，(=9μm)。产孢细胞多芽生，合生，端生，圆柱形。分生孢子单生，干燥，顶生，螺旋形卷旋较紧，卷曲在1.75–2周，顶端钝圆，基部细胞U形，基部具有明显黑色斑痕，褐色，光滑，孢子长35–54μm（=43μm），宽26–39μm（=32μm），孢子隔膜在9–12个，未成熟的孢子呈白色透明，成熟的褐色至深褐色。标本号：4XPH4–2–1；采集时间：2018年3月；采集地点：苍山西坡；采集人：沈洪伟图1Helicomapalmigenum.a–c.分生孢子梗及分生孢子结构.d–e.产孢结构.f–i.分生孢子.j.萌发的分生孢子.k–i.纯培养.标尺：a=70μm,b=60μm,c=70μm,d-e=30μm,f-i=20μm,g=40μm.讨论：在形态学鉴定时Helicomapalmigenum在形态上与Helicomadennisii较为相似，二者的区别在于Helicomapalmigenum的产孢结构更明显，颜色泛白，分生孢子与梗接触部位钝圆,呈U型[23]；而Helicomadennisii产孢细胞为多细胞，有多个小突起，分生孢子与梗接触部位较细小，分生孢子直径在20-26μm，是同一属的不同种[24]。另外将其ITS及LSU序列在NCBI网站数据库BLAST程序中进行序列相似性比对，比对结果显示出与形态学鉴定相一致，属于Helicoma属Helicomapalmigenum种，相似性达到92.33%。3.2.2Helicomasp.菌落在自然基质上白色到浅黄色，透明到半透明，未成熟时为白色，成熟浅黄色；菌丝体部分埋生，部分表生，分生孢子梗从匍匐菌丝长出，直立或弯曲，不具分枝，圆柱状，有隔膜，光滑，颜色呈白色至淡黄色，长29–280μm（=105μm），宽4–16μm（=10μm）；分生孢子螺旋形，白色至浅黄色，螺旋在2.5–3周，非吸湿性，螺旋紧密无空隙，不松散，壁光滑，成熟分生孢子分隔，隔线深褐色，较明显，孢子顶生，单生，截形基部渐宽，钝圆，分生孢子长81–156μm（=103μm），分生孢子丝直径12–24μm（=19μm）；产孢细胞不具小齿，分生孢子分离后在端部平截。标本号：2NH4–29–1；采集时间：2018年11月；采集地点：怒江；采集人：阮清雄图2Helicomasp.a.自然基质上的菌落.c.产孢结构.b,d-f.分生孢子梗和分生孢子.g-l.分生孢子.m.萌发的分生孢子.n-o.纯培养.标尺：b=30μm;c=15μm;d=30μm;e-f=25μm;g-I=15μm;j=20μm;k-m=15μm.讨论：通过形态学鉴定，该属的分生孢子与Tubeufiamachaerinae较为相似，螺旋紧密有隔膜，隔膜数22-28个，产孢结构也相似，但不同的是Helicoma属有发育良好的分生孢子梗，梗较明显，而Tubeufiamachaerinae缺乏这一特性，因此不属于Tubeufia属[11]。将其LSU，ITS序列在NCBI网站数据库BLAST程序中进行序列相似性比对，比对结果显示出与形态学鉴定相一致，相似性达到99.52%。因此结合形态学与分子序列比对可初步确定该菌株为Helicoma属。3.2.3Helicosporiumaureum(Corda)Linder,Ann.Mo.bot.Gdn16:279(1929)在自然基质上菌落聚集生长，灰白色，毛发状。菌丝体大多埋生，有部分表生，有分枝，具隔膜，分枝，光滑，透明。分生孢子梗较粗长，顶部较细。大多直立单线型，少数具有一定弧度的弯曲，壁具有单生小齿状产孢，具有6–10个隔膜，顶部隔膜分化不明显，梗呈褐色，长332–399μm（=372μm），宽10–15μm（=12μm）；产孢细胞多芽生，小齿突起，呈对称分布，分生孢子断裂部分缩窄。分生孢子长46–102μm（=84μm），宽46–88μm（=70μm），分生孢子丝10μm–5μm（=8μm）螺旋状，颜色白色，多隔膜，分生孢子梗裂解式脱落，与产孢基底部平截，分生孢子卷旋较松，有的卷旋遇水松开。标本号：2JZSH2–8–2；采集时间：2017年4月；采集地点：大理，鸡足山；采集人：周其山图3Helicosporiumaureum.a.自然基质上的菌落.b-c.分生孢子梗及分生孢子.f.产孢结构.d-h.分生孢子.i.萌发的分生孢子.j-k.纯培养.标尺：b=150μm,c=70μm,d=55μm,e=35μm,f=100μm,g=20μm,h=30μm,I=40μm.讨论：Helicosporiumaureum.在形态上与Helicosporiummurinum相似，分生孢子梗均直立，刚毛状，产孢细胞多个，但H.aureum由小突起刺突状产生分生孢子，而H.murinum由产孢细胞直接产生分生孢子，分生孢子易落。将其LSU序列在NCBI网站数据库BLAST程序中进行序列相似性比对，比对结果显示出与形态学鉴定相一致，相似性达到100%。因此结合形态学与分子序列比对可初步确定该菌株为Helicosporium属Helicosporiumaureum种。3.2.4HelicomycesroseusMag.Gesell.naturf.Freunde,Berlin3(1-2):21(1809)菌落在自然基质上平铺，颜色灰色或褐色成片生长。菌丝体表生，部分埋生。分生孢子梗从匍匐菌丝侧面长出，直立或弯曲，具有分枝，有隔膜，颜色呈淡黄色至褐色，顶部接近产孢结构颜色变透明，梗圆柱状，长111–232µm（=146µm），宽8–12µm（=8µm）。产孢细胞单生或多生，芽状或棒状突起，分生孢子从梗侧壁或顶部的小突起处产生孢子。分生孢子未成熟时白色成熟时浅黄色，透明至半透明，孢子具有吸湿性遇水卷旋松散，卷曲在1-3周，分生孢子有的不在一个平面，呈圆盘状，长54–219µm（=115µm），分生孢子丝直径7–15µm（=11μm）。标本号：3JGSH1–4–1；采集时间：2017年7月；采集地点：大理，宝台山；采集人：沈洪伟图4Helicomycesroseus.a.自然基质上的菌落.b-d.分生孢子梗及分生孢子.e.产孢细胞.f-k.分生孢子.l.萌发的分生孢子.m-n.纯培养.标尺：b=80µm,c=30µm,d=40µm,e-k=15µm,l=25µm讨论：Helicomycesroseus是Helicomyces属的模式种[12]。在自然界比较常见，在世界上分布比较广泛，分生孢子较大，具有吸湿性，卷旋打开后形态不规则，松散程度不一。测量的螺旋孢子直径长短不一，标尺数据波动幅度较大，因此分生孢子的直径很难精确测定。分生孢子大小不能作为鉴定依据和标准。将其LSU序列在NCBI网站数据库BLAST程序中进行序列相似性比对，比对结果显示出与形态学鉴定相一致，相似性达到100%。因此结合形态学与分子序列比对可初步确定该菌株为Helicomycesroseus。3.2.5HelicomycesrosesMag.Gesell.naturf.Freunde,Berlin3(1-2):21(1809)菌落在自然基质上聚集生长，颜色雪白色，散乱毛发状。菌丝体埋生或表生，有分枝，具有隔膜，浅褐色或无色。分生孢子梗部分从匍匐菌丝侧面长出，直立或弯曲，梗粗细不一，具有皱缩，膨大，具有分枝，有隔膜，颜色呈褐色，顶部接近产孢结构颜色白色透明，长19–270µm（=77µm），宽3–13µm（=6µm）。产孢多生，有刺突起，分生孢子从梗侧壁或顶部的小突起处产生孢子，有多个小突起聚集一起，多点产孢。分生孢子大多白色，少数成熟的变褐色，孢子卷旋松散，卷曲在1.5–3周，分生孢子散开交叉，螺旋形，长25–261µm（=111µm），分生孢子丝直径4–7µm（=5μm）。标本号：2JZSH2-6-3；采集时间：2017年4月；采集地点：大理，鸡足山；采集人：阮清雄图5Helicomycesroses.a.基质上的菌落形态.b,d.分生孢子梗和分生孢子.c.产孢细胞结构特征，多点产孢.e-k.分生孢子形态.l.萌发的分生孢子.标尺：b=50µm;c=40µm;d=70µm;e=40µm;f=50µm;g=40µm;h-I=35µm;j=70µm;k=45µm;l=35µm.3.2.6Tubeufiacylindrothecia(Seaver)Höhn.,Sber.Akad.Wiss.Wien,Math.-naturw.Kl.,Abt.1128(7-8):562(1919)菌落在自然基质上稀疏，白色，发亮毛发状，群生或单生。菌丝体绝大多数埋生，分生孢子梗从匍匐的菌丝产生，螺旋状。分生孢子梗单线型，直立，弯曲，圆柱形，分枝或不分枝，有隔膜，浅棕色到棕色，平滑壁，长61–254µm，（=156µm）宽8–17µm（=17µm）。分生孢子浅棕色，单线型，似大型线虫，卷曲巨大，顶端圆形，有的卷曲交差不规则，卷曲松散，卷旋次数为2–3次，在水中变得松散,多隔，透明，平滑壁，发亮的分生孢子，长152–308µm（=206µm），分生孢子丝直径7–16µm（=12µm）。产孢细胞，合生，顶生，圆柱形，具小齿，或在分生孢子分离后在先端截形，透明到浅棕色，平滑壁。标本号：HL10–9–1；采集时间：2015年4月；采集地点：云南，澜沧江；采集人：沈洪伟图6Tubeufiacylindrothecia.a.自然基质上的菌落.b-d.分生孢子梗及分生孢子.e-f.产孢细胞结构.g-j.分生孢子.k.萌发的分生孢子.l-m.纯培养标尺：b-d=70µm;e-f=15µm;g=70µm;h=55µm;i-j=65µm;k=70µm.讨论：根据形态学的研究Tubeufiacylindrothecia与Helicomycesroses形态相似，并将二者联系起来[10]。然而系统发育不支持这一观点[22]。因此将形态学与分子系统学相结合的分析方法，最终将其从Helicomycesroses中分离出来，建立并确定为Tubeufia属Tubeufiacylindrothecia属[25]。本文也从该菌株的ITS及LSU序列在NCBI网站数据库BLAST程序中进行序列相似性比对，比对结果显示出与形态学鉴定相一致，因此可初步确定为Tubeufia属Tubeufiacylindrothecia种，相似性达到100%。3.2.7TubeufiaaquaticZ.L.Luo,Bhat&K.D.Hyde,inLuo,Bhat,Jeewon,Boonmee,Bao,Zhao,Chai,Su,Su&Hyde,Cryptog.Mycol.38(1):44(2017)菌落在自然基质上稀疏白色，毛发状，菌丝体部分埋生，部分表生，透明到浅棕色，有隔膜，疏松的菌丝体组成，长有大量密集的分生孢子。分生孢子梗粗大，圆柱形，有分枝，棕色到深棕色，有隔膜，顶部梗白色透明细丝状，长11–278µm（=111µm）;宽5–16µm（=12µm）；分生孢子螺旋状，螺旋较紧密，分生孢子丝卷曲2–2.5次，顶端圆形，基部较狭窄，透明至浅棕色，光滑，多隔膜，沟突，光滑壁，长59–82µm（=72µm），分生孢子丝直径6–14µm（=9µm）。产孢细胞顶生，合生，平滑没刺突。标本号：3LH6–28–1;采集时间：2018年7月；采集地点：澜沧江；采集人：沈洪伟图7Tubeufiaaquatic.a.自然基质上的菌落.b.分生孢子梗和分生孢子.c-d.产孢细胞.e-h.分生孢子.i.萌发的分生孢子.j-k.纯培养.标尺：b=35;c-d=25µm;e-I=10µm.讨论：Tubeufiaaquatic和Tubeufiacylindrothecia.是Tubeufia属的不同种，两者的区别在于，都是大线虫型，颜色棕色至浅棕色，但T.aquatic的梗有分枝，长分枝或短分枝，分生孢子较紧致，不分散，非吸湿性。系统发育分析也表明二者在Tubeufia属中具有不同的分支[25]。本文也从该菌株的ITS序列在NCBI网站数据库BLAST程序中进行序列相似性比对，比对结果显示出与形态学鉴定相一致，因此可初步确定为Tubeufia属Tubeufiaaquatic种，相似性达到99.89%。3.2.8NeohelicomycessubmersusZ.L.Luo,HongY.Su&K.D.Hyde2017菌落在自然基质上白色，毛发状；菌丝体部分埋生，部分表生，疏松分枝的菌丝体组成，有许多发亮，拥挤的分生孢子；分生孢子梗直立，有隔，分枝，浅褐色到褐色，光滑壁，着生于基质上，长133–258µm（=197µm），宽3–7µm（=4µm）。产孢细胞多生，壁具产孢小齿，齿短，分生孢子螺旋形，白色到灰白色，透明到半透明，螺旋周次在2.5–3.5次，螺旋长17–37µm（=27µm），分生孢子丝直径1–4µm（=2µm），螺旋紧密卷曲，顶端圆形，浅灰色，无光泽，光滑，孢子基部有部分膨大。标本号：4XPH9–4–2螺旋；采集时间：2018年3月；采集地点：苍山西坡；采集人：周其山图8Neohelicomycessubmerses.a.自然基质上的菌落;b.分生孢子梗及分生孢子.c.产孢细胞.d.分生孢子梗.e-i.分生孢子.j.萌发的分生孢子.标尺：b=90µm;c=15µm;d=40µm;e-j=10µm.讨论：经形态学鉴定，在形态上N.submersus与Neohelicomycesaquaticus较相似，不同点在于本属卷旋周数较多2.5–3.5次，分生孢子丝较N.aquaticus细；N.aquaticus分生孢子周数在2–2.5次，分生孢子丝较粗2–4µm；（x̄=3µm），分生孢子直径较短，螺旋松散。系统发育分析表明该属是一个新的分类单元，有别于N.aquaticus和Tubeufia属[26]。因此，经形态学鉴定和查阅书籍资料可初步确定该菌株为Neohelicomycessubmersus。3.2.9Helicosporiumsp.菌落在自然基质上白色，平展，棉絮状。菌丝体大部分表生，部分埋生，有隔膜，灰褐色，匍匐状，光滑宽直径约为4–7µm（=5µm）。分生孢子梗较长，具有分枝，直立或匍匐，直线或弯曲，有隔膜，通过融合的分生孢子梗或匍匐菌丝形成网状或环状结构，长193–297µm（=240µm）。产孢细胞单生或多生，端生或中生，具有小齿；小齿囊状，分生孢子具有吸湿性，周次2–2.5周，无色，孢子直径34–53µm（=39µm），分生孢子丝直径2–5µm（=3µm），隔膜分化不明显。标本号：N1–7–1；采集时间：2017年8月;采集地点： 怒江；采集人：阮清雄图9Helicosporiumsp.a.自然基质上的菌落.B.产孢细胞结构.c-d.分生孢子梗及分生孢子.e-i.分生孢子.j.萌发的分生孢子.标尺：b=15µm;c-d=80µm;e=10µm;f=15µm;g-I=10µm;g=15µm.讨论：Helicosporiumvegetum是该属的模式种。主要特征为分生孢子梗大，长，分化完全，分生孢子具有吸湿性，1817年，基于H.vegetum的研究，nees建立Helicosporium属，1929年Linder重新对Helicomyces,Helicosporium和Helicoma进行重新分类，根据分生孢子的厚壁、不吸湿性，将Helicomyces,Helicosporium从Helicoma中分离出来，1989年Goos对该属进行系统性的分类和描述[14]。3.2.10不同卷旋分生孢子形态图10标尺a=20µm;b=15µm;c=10µm;d=15µm;e=20µm;f=10µm;g=25µm;h=10µm;i-j=15µm;k=10µm;l=20µm;m-n=15µm;o=10µm;p=15µm.3.2.11不同分生孢子及分生孢子梗形态及结构图11a=50µm;b-c=25µm;d=30µm;e-f=10µm;g=25µm;h=35µm;I=20µm;j=30µm;k=20µm;l=25µm;m=25µm;n=30µm;o=60µm;p=20µm;q=50µm;r=30µm;s=50µm.4多样性分析结果Helicoma属中共鉴定得5种，分别为Helicomaaquaticum、Helicomaperelegans、Helicomadennisii、Helicomapalmigenum、Helicomadenticulatus。有2个未鉴定到种。共10株菌株。Helicomyces属中鉴定出3种,Helicomycesdenticulatus、Helicomyceshyderabadensis、Helicomycesroseus、Helicomycessp.共47株菌株。Helicosporium属共6种，分别为Helicosporiumdentophorum、Helicosporiumaureum、Helicosporiumguianense、Helicosporiumlumbicopsis、Helicosporiummurinum、Helicosporiumsp.，共23株菌株。Neohelicomyces属鉴定出4种，分别为Neohelicomycesaquaticus、Neohelicomycesgrandisporus、和Neohelicomycesliliputeus、Neohelicomycessubmersus、Neohelicomycessp.共14株菌株。Neohelicosporium属有2种，Neohelicosporiumellipsoideum、Neohelicosporiumirregulare和Neohelicosporiumsp.三个种，共4株菌株。Tubeufia属有Tubeufiacylindrothecia、Tubeufiabrunnea和Tubeufiasp.共23株菌株。在处理样品的过程中，分离纯化共整理出152株菌株，经鉴定共有6属22种，蜗孢属Helicoma、卷丝孢属Helicomyces、卷旋孢属Helicosporium、Neohelicomyces、Neohelicosporium、和Tubeufia。其中有31株未鉴定到属种，部分菌株可能是新纪录种，需要对其形态及分子做进一步的分析，以确定其分类地位。蜗孢属Helicoma的检出率达到8.26%、卷丝孢属Helicomyces的检出率达到38.84%、卷旋孢属Helicosporium达到19.01%、Neohelicomyces检出率达到11.57%、Neohelicosporium达到3.31%、和Tubeufia达到19.01%。检出率最高的种为Helicomycesroseus4.96%、Neohelicomycesaquaticus4.96%、Tubeufiacylindrothecia4.13%在本次研究中出现频率较高为高频种。表一.鉴定出的卷旋孢科(Tubeufiaceae)属种名及检出率序号属拉丁名样品编号菌株数检出率（%）1HelicomaHelicomaaquaticum2JZSH2-8-210.83%2H.dennisii4XPH4-10-1同4XPH4-2-132.48%3H.perelegansXZH32-18-110.83%4H.denticulatusXPH1-6-1螺旋21.65%5H.palmigenum4XPH4-2-110.83%6Helicomasp.2NH4-29-121.65%7HelicomycesHelicomycesdenticulatus2JZSH2-17-721.65%2JZSH3-17-18H.hyderabadensis2NH2-61-121.65%4JZSH4-1-19H.roseus2JZSH2-6-364.96%3JGSH1-4-13LH9-8-1HD1-10-82NH4-39-1HL24-4-210Helicomycessp.2JZSH2-18-13730.58%11HelicosporiumHelicosporiumaureum2JZSH2-8-232.48%2JZSH2-12-1JZSH2-11-112H.dentophorum2NH4-5-121.65%13H.guianenseN1-210.83%14Helicosporiumsp.1512.40%15H.lumbricopsis3JZSH2-17-2116H.murinum2LH6-11-110.83%17NeohelicomycesNeohelicomycesaquaticus2GH3-10-264.96%182LH6-1-119N.grandisporus2DH1-28-143.31%2JZSH2-14-24XPH1-8-220N.liliputeus3GH4-8-2螺旋同3GH4-5-210.83%21Neohelicomycesp32.48%22NeohelicosporiumNeohelicosporiumellipsoideum3LH6-28-110.83%23N.irregulare3LH6-5-110.83%24Neohelicosporiumsp21.65%25TubeufiaTubeufiasp.4J