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文档简介

《凝血因子VⅢ抑制物定量检测专家共

识(2025版)》解读前言◆

凝血因子VⅢ(factor

VIⅢ,FVⅢ)

抑制物作为获得性血友病A(acquiredhemophilia

A,AHA)

的诊断指标,同时也是接受外源性FVⅢ输注后

血友病A((hemophilia

A,HA)

患者是否产生抑制物的关键监测指

标。由此可见,

FVⅢ抑制物的定量检测在这些疾病的鉴别诊断、治疗

方案选择及治疗效果监测等环节中均起着至关重要的作用。2018年,

中华医学会血液学分会血栓与止血学组及中国血友病协作组联合制定了《凝血因子VⅢ/I区X

抑制物诊断与治疗中国指南(2018年版)》,

详细介绍了凝血因子抑制物产生的危险因素及治疗方案,但在实验室检测方面仅简单提及了FVⅢ抑制物的检测方法,并未明确标准化操

作及报告流程。前言◆

此后,多个指南及专家共识亦未能在此方面给出相对专业的意见或

建议。然而,当前FVⅢ抑制物定量检测存在着检测过程中影响因素相

对较多、自动化程度相对较低等问题,同时检验医师及技师对检测

结果计算的相关概念较为模糊,加之新型非因子治疗药物的使用,使得FVⅢ抑制物定量检测的标准化面临着巨大的挑战。为了解各实验

室FVⅢ抑制物定量检测现状及存在的问题,中华医学会检验医学分会

临床血液体液学组联合中国血友病青年协作组设计并发布了调研问卷,最终共收到159家实验室的反馈。前言◆

调研问卷结果显示在FVⅢ抑制物定量检测的相关概念、检测步骤和结

果计算及解释等方面亟待规范化和标准化。结合调研问卷结果,学

组与协作组查阅国内外相关文献,整理并总结国内血栓与止血领域

专家的临床实践经验,共同编写了本共识。◆

本共识主要从相关概念、启动检测的时机、检测方法、检测步骤、结果计算及解释和注意事项等方面进行介绍,以期推进我国FVⅢ抑

物定量检测的标准化,进而推广至各凝血因子抑制物定量检测的标

准化,同时亦希望能给血栓与止血领域的临床医师、检验医师及技

师在临床工作中带来指导和帮助。一、FVⅢ抑制物的相关概念(一)基本概念◆

将不同稀释度的患者血浆与等量的正常混合血浆(normal

pooledplasma,NPP)

混合后,置于37℃孵育2h后测定混合样本的剩余FVⅢ

活性

(factor

VⅢactivity,FVⅢ:C)。能使NPP的FVⅢ:C

减少50%的FVⅢ抑制物含量称为1个Bethesda单位

(Bethesda

unit,BU),此时患

者血浆稀释度的倒数即为FVⅢ抑制物滴度,报告单位为BU/ml

。同一

患者在一周至四周内连续两次检出≥0.6BU/ml的FVⅢ抑制物,则为FVⅢ抑制物阳性。一、FVⅢ抑制物的相关概念(二)分类◆

FVⅢ抑制物可分为HA患者的抗FVⅢ同种抑制物及AHA患者的抗FVⅢ自

身抑制物。前者多为1型抑制物,而后者多为2型抑制物,两者呈现

出截然不同的动力学特征。此外,根据FVⅢ抑制物滴度,可将其分为

低滴度抑制物(即抑制物滴度<5.0BU/ml)

和高滴度抑制物(即抑制物滴度≥5.0BU/ml。二、启动FVⅢ抑制物定量检测的时机(一)HA◆对于首次拟确诊的HA患者(尤其是轻型和中间型患者),为与AHA进行鉴别诊断,在接受替代治疗前需进行FVⅢ抑制物定量检测。◆

对于已确诊的HA患者,除预防治疗时需定期监测FVⅢ抑制物外,若

有以下情况,应及时进行FVⅢ抑制物定量检测:>(1)FVⅢ替代治疗效果较既往欠佳;(2)在规范预防治疗下,出血频率增加或者仍有靶关节出血;>

(3)高强度输注FVⅢ后;二、启动FVⅢ抑制物定量检测的时机(一)HA>(

4

)

;>(5)手术后FVⅢ替代治疗疗效欠佳;>(6)轻型和中间型HA患者出血表现加重。具体情况可参考《血友病合并抑制物诊断与治疗中国指南(2023年版)》。◆

对于抑制物持续阳性的重型HA患者,应立即接受免疫耐受诱导治疗

(immunetoleranceinduction,ITI)。FVII抑制物定量检测对于ITI

的疗效预测、剂量选择及疗效评估等均有重要的临床意义。具体内容可参考《血友病合并抑制物诊断与治疗中国指南(2023年版)》。二、启动FVⅢ抑制物定量检测的时机(二)HA◆对于拟确诊AHA

的患者,应进行FVⅢ抑制物定量检测以明确诊断。◆

对于已确诊的AHA

患者,在治疗前6周,门诊患者应每周进行1次FVⅢ抑制物定量检测,住院患者应每周进行2次FVⅢ抑制物定量检测。

完全缓解(即FVⅢ抑制物滴度<0.6BU/ml,FVⅢ:C≥50%,免疫抑制

剂停用或恢复至发病前剂量)后可根据临床需求进行FVⅢ抑制物定量

。三、FVⅢ抑制物定量检测方法(一)按检测原理区分◆

FVⅢ抑制物定量检测本质上是剩余FVⅢ:C

检测,从检测原理上可分

为一期凝固法和发色底物法。◆

1、一期凝固法:◆一期凝固法主要是基于检测待测样本对乏FVⅢ基质血浆活化部分凝血

活酶时间

(activated

partial

thromboplastin

time,APTT)的纠正能力,

通过检测混合后血浆的APTT

可计算得到样本的FVⅢ:C

结果。

一期凝固法目前是国内乃至全世界应用最广泛的FVⅢ:C检测方法。但该

方法可能受其他凝血因子抑制物、狼疮抗凝物质和肝素等干扰APTT

纠正能力的物质影响。此外,随着HA新型非因子治疗药物(如艾美

赛珠单抗)的使用,

一期凝固法亦不能用于该人群的FVⅢ抑制物定量

。三、FVⅢ抑制物定量检测方法(一)按检测原理区分◆2、发色底物法:◆

发色底物法的原理是基于检测FVⅢ作为辅因子与活化的凝血因子区形

成的复合物活化凝血因子X

的能力,通过检测生成的活化凝血因子X

的量来计算样本的FVⅢ:C

结果。该方法抗干扰能力较一期凝固法强,

可应用于FVⅢ抑制物与其他凝血因子抑制物或狼疮抗凝物质的鉴别诊

断。另外,牛源性发色底物法(即试剂为牛源性试剂)可应用于使用艾美赛珠单抗预防治疗的HA患者的FVⅢ抑制物定量检测。三、FVⅢ抑制物定量检测方法(二)按检测体系区分◆Lawrence

和Johnson于1941年首次报道了一例产生FVⅢ抑制物的HA

例。此后又有多例FVⅢ抑制物阳性的病例先后被报道,但报道中的FVⅢ抑制物定量检测方法却大相径庭。直至1975年,

Kasper等提出了

一种标准化程度较高的检测方法,即Bethesda

法。1995年Verbruggen等在Bethesda

法的检测体系上进行改良,进而提出了Nijmegen

法。相比Bethesda法,Nijmegen法提高了FVⅢ抑制物定量检测的特异性。此后,Nijmegen

法被国际血栓与止血学会推荐为FVⅢ抑制物定量检测

的参考方法。两种方法的区别主要在检测体系的不同,具体内容将在本共识后续部分进行详细介绍。三、FVⅢ抑制物定量检测方法(三)按正常混合血浆的来源区分◆国际上,猪重组凝血因子VⅢ(recombinant

porcine

factor

VⅢ,rpFVⅢ)

已被用于成人AHA

患者按需治疗和出血事件的控制。对于该人群而

言,需额外检测抗rpFVⅢ抑制物。根据NPP

的来源,可将FVⅢ抑制物

定量检测分为抗人FVⅢ抑制物定量检测和抗rpFVⅢ抑制物定量检测。四、FVⅢ抑制物定量检测步骤(一)样本采集及制备◆应使用含0.109mol/L(3.2%)

枸橼酸三钠抗凝剂(1:9抗凝)抗凝

管进行样本采集。若患者的红细胞比容≥55%,应按要求进行抗凝剂

或采血量的调整。样本采集后应确认无血凝块存在,宜在常温条件

下1h内送检,采用规定的离心速度和离心时间[室温(18~24℃)、1500×g

、不少于15min]离心,以得到乏血小板血浆(血小板计数

<10×10⁹/L),

建议当天内完成检测。◆若不能及时检测,应尽快将离心分离后的血浆置于-20℃冰箱(最多

可保存2周)或-70℃冰箱(最多可保存6个月)保存。检测前应将样本置于37℃水浴快速复融至少4~5min并充分混匀。四、FVⅢ抑制物定量检测步骤(二)样本灭活◆

在FVⅢ抑制物定量检测前,应将样本置于56℃孵育30min以灭活样本

中残留的FVⅢ,减少残留的FVⅢ对FVⅢ抑制物定量检测结果的干扰。灭活后,需采用一定的离心速度和离心时间(如4000×g

、2min或

1500×g

、不少于15min等)离心,取上清液进行后续的样本稀释。◆

共识1所有待测乏血小板血浆均应经过56℃孵育30min灭活。灭活

后采用一定的离心速度和离心时间离心,取上清液进行后续的样本

稀释。推荐强度:推荐,同意率:81.25%(13/16)四、FVⅢ抑制物定量检测步骤(三)正常混合血浆的准备◆当检测抗人FVⅢ抑制物时,可使用商品化的NPP,

商品化NPP的使用

和保存应按照制造商说明书进行操作。若无法获得商品化NPP,实验室亦可自制NPP。自

制NPP时需注意:>(1)应选择至少20份(男女比例1:1)常规凝血试验结果均正常的血浆混合制得;>(2)避免选择感染、肿瘤、创伤、术后、妊娠、新生儿、肝脏疾病、自身免疫性疾病及进行抗凝治疗等人群的样本;(3)避免选择性状存在溶血、凝块、黄疽和脂血等情况的样本;四、FVⅢ抑制物定量检测步骤(三)正常混合血浆的准备(4)从每份样本中采集足够的血浆以获得足够的NPP;(

5

)自

制NPP的FVⅢ:C

结果应在95%~105%之间。◆

混合制得NPP后需采用一定的离心速度和离心时间(如1500×g、15min等)再次离心。可在每次FI抑制物定量检测前制备新鲜的NPP,

抑或使用冻存的NPP。◆

冻存及复融的要求可参考《活化部分凝血活酶时间延长混合血浆纠

正试验操作流程及结果解读中国专家共识》。复融后应重新检测NPP的FVⅢ:C,

结果需在95%~105%之间才可继续使用。四、FVⅢ抑制物定量检测步骤(三)正常混合血浆的准备◆

当检测抗rpFVⅢ抑制物时,可使用商品化的rpFVⅢ作为NPP,

商品化rpFVⅢ的使用和保存应按照制造商说明书进行操作。使用商品化的乏

FVⅢ血浆稀释rpFVⅢ,使rpFVⅢ活性接近100%。◆

共识2实验室自制NPP的FVⅢ:C结果应在95%~105%之间。推荐强

度:强推荐,同意率:93.75%(15/16)四、FVⅢ抑制物定量检测步骤(四)样本稀释及处理◆

1、Bethesda法:◆

使用pH=7.4的0.1mol/L咪唑缓冲液将样本稀释至各稀释度(如1/2、1/4、1/8、1/16等),最大稀释度可根据实际情况调整。向0.1mol/L

咪唑缓冲液(后称“标准管”)和原倍及各稀释度的样本(后称“检测管”)中加入等量的NPP,

混匀后闭盖置于37℃孵育2h。原倍检测管的稀释度为1,1/2稀释的检测管的稀释度为2,以此类推。具体操作步骤见图1。四、FVⅢ抑制物定量检测步骤(四)样本稀释及处理混匀后闭盖置于37

℃孵育2

h图1

FVⅢ抑制物定量检测样本的稀释及处理过程正常混合血浆0.1

mol/L咪唑缓冲液

灭活后的样本检测管

检测管

检测管

检测管标准管

检测管

原倍标准管

检测管

原倍加入等量的正常混合血浆检测管四、FVⅢ抑制物定量检测步骤(四)样本稀释及处理◆

2

、Nijmegen

法:◆

Nijmegen

法与Bethesda法检测体系的不同点在于:>(1)使用乏FVⅢ血浆作为样本稀释液;>(2)使用0.

1mol/L的咪唑缓冲液将NPP的pH调整至7.4。四、FVⅢ抑制物定量检测步骤(五)剩余FVⅢ:C检测◆

可通过“标准管与检测管分别检测FVⅢ:C”或“使用标准管制定标

准曲线”两种方法中任意一种进行剩余FVⅢ:C检测。◆

1、标准管与检测管分别检测FVⅢ:C:◆

分别检测标准管与检测管的FVIⅢ:C,

根据公式(1)计算检测管的

剩余FVⅢ:C(%)。剩余FVⅢ:

公式(1)四、FVⅢ抑制物定量检测步骤(五)剩余FVⅢ:C检测◆

2、使用标准管制定标准曲线:◆

FVⅢ抑制物定量检测的标准曲线制定可参考FVⅢ:C

检测。将标准管

作为参考血浆(靶值定义为100%)制作标准曲线。FVⅢ抑制物定量

检测的标准曲线中FVⅢ:C应至少覆盖25%~75%。标准曲线的线性回

归方程的r值应在0.998~1.000,斜率应在0.9~1.1。若使用商品化的NPP,在试剂批号更换、NPP批号更换或仪器设备调整等情况下需

重新制定标准曲线。使用冻存的实验室自制NPP前,除需确认是否

有试剂批号更换或仪器设备调整等情况外,还需在复融NPP后重新

检测FVⅢ:C。四、FVⅢ抑制物定量检测步骤(五)剩余FVⅢ:C检测◆若结果在95%~105%之间,可省略标准曲线制定这一步骤。使用新

鲜的实验室自制NPP时,需重新制定标准曲线。在制定新的标准曲

线或确认历史标准曲线适用之后,开始检测管剩余FVⅢ:C的检测。◆

3、起始检测管:◆

起始检测管的选择可结合患者病史决定。若为首次进行FVⅢ抑制物定

量检测或无FVⅢ抑制物阳性史的患者,应将原倍检测管作为起始检测

管。若为有FVⅢ抑制物阳性史的患者,可参考历史检测结果选择合适

的检测管作为起始检测管。四、FVⅢ抑制物定量检测步骤(六)结果判断◆检测管的剩余FVⅢ:C

结果在25%~75%范围内(除原倍检测管的剩余

FVⅢ:C>75%外)视为有效结果。◆若检测管的剩余FVⅢ:C>50%,

则应进一步选择更低稀释度的检测

管(直至原倍检测管)进行剩余FVⅢ:C

检测,直至找到剩余FVⅢ:C≤50%的检测管。若检测管的剩余FVⅢ:C<50%,

则应进一步选择

更高稀释度的检测管进行剩余FVⅢ:C

检测,直至找到剩余FVⅢ:C≥50%的检测管。四、FVⅢ抑制物定量检测步骤(五)剩余FVⅢ:C检测◆若当次制备的最高稀释度的检测管的剩余FVⅢ:C

仍<50%或最低稀

释度的检测管的剩余FVⅢ:C

仍>50%(除原倍检测管的剩余FVⅢ:C>50%

外),需从样本稀释及处理起,调整合适的稀释度后重新进行FVⅢ抑制物定量检测。◆

选择剩余FVⅢ:C

最接近50%的检测管的结果进行结果计算。◆

共识3剩余FVⅢ:C结果应在25%~75%范围内,选择最接近50%的

检测管的结果进行结果计算。推荐强度:强推荐,同意率:100.00%(16/16)◆

FVⅢ抑制物定量检测完整流程示意图见图2。FVⅢ抑制物定量检测样本采集及制备否,冻存及时检测?-20

℃最多保存2周或

-70

℃最多保存6个月样本灭活37

℃4~5min样本离心取上清液样本稀释及处理←NPP样本孵育37

℃孵育2h制定新的标准曲线或确认历史标准曲线适用计算剩余FVI:C

检测剩余FVⅢ:C最高稀释度的检测管的剩余FVⅢ:C<50%或最低稀释度的检测管的剩余FVⅡ:C>50%(除原倍检测管的剩余FVⅢ:C>50%外)结果判断找到剩余FVⅡ:C最接近50%的检测管(剩余FVⅢ:C结果应在25%~75%范围内

或原倍检测管的剩余FVⅢ:C>75%)结果计算注:FⅢ

为凝血因子Ⅲ;NPP

为正常混合血浆;FVⅢ:C

因子Ⅲ活性图

2

FVⅢ抑制物定量检测完整流程图分别检测标准管

与检测管的FVI:C56℃孵育30min剩余FVⅢ:C是五、结果计算及解释(一)结果计算◆

根据公式(2),得到FVⅢ抑制物滴度计算系数。将FVⅢ抑制物滴度

计算系数代人公式(3)中计算样本的FVⅢ抑制物滴度。FVⅢ抑制物滴度(BU/ml)=FVⅢ抑制物滴度计算系数×对应的稀释度公式(3)公式(2)五、结果计算及解释(二)参考范围◆目前,国内外较为公认的具有临床意义的FVⅢ抑制物滴度为“≥0.6

BU/ml”,本共识建议在报告FVⅢ抑制物定量检测结果时可将参考范

围定为“<0.6BU/ml”。◆共识4FVⅢ抑制物定量检测的参考范围为“<0.6BU/ml”。推荐强度:

强推荐,同意率:100.00%(16/16)。五、结果计算及解释(三)检测限◆当样本的原倍管剩余FVⅢ:C>75%

时,通过计算可得其FVⅢ抑制物滴

度<0.42BU/ml。

尽管有学者通过实验得到“FVⅢ抑制物滴度检测限

为0.2BU/ml”的结论,但综合临床实际应用价值与国际血液学标准化

委员会的相关指导文件,本共识建议在报告FVⅢ抑制物定量检测结果

时应将检测限定为“0.4BU/ml”(检测结果保留一位小数),即当样

本的原倍管剩余FVⅢ:C>75%

时,其FVⅢ抑制物滴度应报告为“<0.4BU/ml”

若临床确有更高的需求,实验室需根据实际情况进行检测限的性能验证。◆共识5

FVⅢ抑制物定量检测的检测限为“0.4BU/ml”。推荐强度:推荐,同意率:81.25%(13/16)五、结果计算及解释(四)检测灰区◆

FVⅢ抑制物定量检测(一期凝固法)结果<2.0BU/ml为检测灰区,可

采用回收试验进一步确认FVⅢ抑制物是否存在;同时改用发色底物法

(如条件允许)或重复一期凝固法进行FVIⅢ抑制物定量检测。六、FVⅢ抑制物定量检测注意事项(一)中和性抑制物与非中和性抑制物◆

使用Bethesda法或Nijmegen法可检测到的FVⅢ抑制物是中和性抑制物,

主要是免疫球蛋白G(immunoglobulin,IgG)(以IgG4

亚类为主)。

而非中和性抑制物的功能主要是加速FVⅢ的清除,缩短FVⅢ的半衰期,可以通过酶联免疫吸附法及免疫沉淀法等方法检测非中和性抑制物。六、FVⅢ抑制物定量检测注意事项(二)1型抑制物与2型抑制物◆

HA患者的抗FVⅢ同种抑制物多为1型抑制物,而AHA

患者的抗FVⅢ自

身抑制物多为2型抑制物。1型抑制物的结合位点通常是FVⅢ的A2

或C2结构域,破坏了FVⅢ与凝血因子区复合物的形成。整个反应呈现1

型反应动力学特征,抑制物可完全中和FVⅢ。2型抑制物的结合位点

通常是FVⅢ的C2结构域,干扰了磷脂和血管性血友病因子的结合位点。整个反应呈现2型反应动力学特征,抑制物不可完全中和FVⅢ。在FVⅢ抑制物定量检测过程中,随着检测管稀释度的变化,1型抑制

物的剩余FVⅢ:C

结果与稀释度呈现线性-对数关系,而2型抑制物的

剩余FVⅢ:C

结果与稀释度无线性-对数关系,表现为多个稀释度检测

管的剩余FVⅢ:C

结果相近。六、FVⅢ抑制物定量检测注意事项(二)1型抑制物与2型抑制物◆因此在检测(疑似)AHA

患者的样本或在发现上述现象时,应制备

足够多的检测管进行检测,选择其中剩余FVⅢ:C最接近50%的检测

管的结果进行最终的结果计算。◆

共识6在(疑似)AHA

患者的FVⅢ抑制物定量检测或发现多个稀释

度检测管的剩余FVⅢ:C

结果相近时,应制备足够多的检测管进行检测。推荐强度:强推荐,同意率:100.00%(16/16)六、FVⅢ抑制物定量检测注意事项(三)样本保存◆

本共识中提到的样本保存条件与时长是针对需同时检测凝血因子活

性和凝血因子抑制物的样本而言。根据国外文献报道,仅需检测凝

血因子抑制物时,可将样本置于-70℃冰箱保存15年。六、FVⅢ抑制物定量检测注意事项(四)

Bethesda法与Nijmegen法◆

相较于Bethesda法

,Nijmegen

法的改良主要是使用咪唑缓冲液调整

NPP的pH及使用乏FVⅢ血浆代替Bethesda法中的稀释液。这些改良可

以减少37℃孵育时FVⅢ的非特异性降解,进而提高FVⅢ抑制物定量检

测的特异性(即降低了假阳性)。◆国外多篇文献提出使用4%牛血清白蛋白溶液代替Nijmegen法中的乏FVⅢ血浆并已证明此方法的可行性。而国内开展FVⅢ抑制物定量检测的实验室多使用Bethesda

法,一般使用仪器配套的因子稀释液代替咪唑缓冲液。结合多年临床实践经验,由此带来的差异尚可接受,但仍建议各实验室在开展FVⅢ抑制物定量检测前进行相关的性能验证。六、FVⅢ抑制物定量检测注意事项(五)灭活与否及灭活时长◆之前的多个国内指南及专家共识均提出在未经过足够洗脱期(即48h)

或FVⅢ:C>5%时必须将样本进行灭活。考虑到部分实验室无法获取

患者是否经过足够洗脱期的信息或未同步检测患者的FVⅢ:C,

为推动FVⅢ抑制物定量检测流程的标准化,本共识提出FVⅢ抑制物定

量检测时所有样本均需经过灭活。国内外有文献建议灭活条件为58

℃孵育90min

或58℃孵育30min等。而Boylan

等提出58℃孵育30min可能导致IgG4降低,因此本共识结合国外相关文献及临床实践经验,

推荐灭活条件为56℃孵育30min。六、FVⅢ抑制物定量检测注意事项(六)标准曲线制定◆

本共识中提出的FVⅢ抑制物定量检测的标准曲线的制定旨在推动FVⅢ

抑制物定量检测流程的标准化。◆

需要注意的是,若通过该方法进行剩余FVIⅢ:C检测,需间隔一定时

间进行标准管的处理与检测管的稀释及处理。若同时处理,在使用

标准管进行标准曲线制定时,检测管中的FVⅢ与FVⅢ抑制物会继续反

应。六、FVⅢ抑制物定量检测注意事项(六)标准曲线制定◆

尽管可以在制定标准曲线时,将待检的各稀释度检测管置于4℃冰箱,

以降低FVⅢ与FVⅢ抑制物继续反应的程度,但两者间的反应并不可被

完全终止。◆

就制定标准曲线的必要性,考虑到实验室条件限制,对于尚无能力

完成的实验室,可通过检测标准管和检测管的FVⅢ:C,

步计算

剩余FVⅢ:C的方式来进行FVⅢ抑制物定量检测。六、FVⅢ抑制物定量检测注意事项(

)狼疮抗凝物质或其他凝血因子抑制物的干扰或艾美赛珠单抗的使用◆当样本中存在狼疮抗凝物质或其他凝血因子抑制物时,其FVⅢ抑制物

定量检测(一期凝固法)结果会存在假阳性的可能。在这些情况下,

可使用发色底物法替代一期凝固法进行FVⅢ抑制物定量检测。除此之

外,当样本中存在狼疮抗凝物质时,还可以考虑使用含高浓度磷脂

的APTT试剂的一期凝固法进行FVⅢI抑制物定量检测。六、FVⅢ抑制物定量检测注意事项(

)狼疮抗凝物质或其他凝血因子抑制物的干扰或艾美赛珠单抗的使用◆

当HA患者使用艾美赛珠单抗时,使用一期凝固法无法真实地评估患者体内FVⅢ抑制物滴度,应使用牛源性发色底物法替代一期凝固法进

行FI抑制物定量检测。◆共识

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