奶山羊干酪性淋巴结炎病原的精准解析与血清学全景调查

奶山羊干酪性淋巴结炎病原的精准解析与血清学全景调查一、引言1.1研究背景奶山羊养殖业在我国畜牧业中占据重要地位，其产出的羊奶不仅营养丰富，富含蛋白质、脂肪、维生素及矿物质等多种营养成分，而且易于消化吸收，在满足人们对优质乳制品需求的同时，也为养殖户带来了可观的经济收益。然而，奶山羊干酪性淋巴结炎（CaseousLymphadenitisinDairyGoats）作为一种常见且危害严重的疾病，给奶山羊养殖产业带来了巨大的挑战。奶山羊干酪性淋巴结炎是由伪结核棒状杆菌（Corynebacteriumpseudotuberculosis）引起的一种人畜共患的慢性传染病，主要特征为局部淋巴结发生干酪样坏死，有时在肺、肝、脾和子宫角等处也会出现大小不等的结节，内含淡黄绿色干酪样物质。从流行特点来看，本病多发生于绵羊和奶山羊，舍饲环境下发病情况更为常见，部分地区发病率可达10%-50%。病羊和带菌动物是主要传染源，病菌可随粪便排出，病羊体表脓肿破溃后流出的脓汁也会污染环境。传播途径多样，主要经皮肤创伤感染，也可通过消化道、呼吸道以及吸血昆虫传播。成年羊对本病最为敏感，1岁左右的羊次之，羔羊极少发病。感染初期，病羊局部发生炎症，随后邻近淋巴结逐渐增大并化脓，脓汁起初较稀，之后逐渐变为牙膏样、干酪样。在发病初期，病羊通常没有明显的全身性症状，往往在屠宰时才被发现。但当病情发展，波及体内淋巴结和内脏时，病羊会逐渐消瘦、衰弱，呼吸加快，伴有咳嗽症状，最终可能导致死亡。病灶在头部和颈部淋巴结较为多发，肩前、股前和乳房等淋巴结次之，严重时可见多个体表淋巴结同时肿大化脓，破溃的脓肿排出淡绿黄色的脓汁。病死羊尸体消瘦，被毛粗乱、干燥，体表淋巴结肿大，内含干酪样坏死物，在肺、肝、脾、肾和子宫角等处有大小不一、数量不等的脓肿。这种疾病对奶山羊养殖产业的危害是多方面的。在产奶量方面，患病奶山羊的产奶量会显著下降。有研究表明，感染干酪性淋巴结炎的奶山羊，其日产奶量相较于健康羊最多可减少30%-50%，这直接影响了羊奶的供应，降低了养殖户的销售收入。同时，羊奶的质量也会受到影响，如乳蛋白、乳脂肪等营养成分的含量降低，导致羊奶的品质下降，在市场上的竞争力减弱。在羊只健康方面，病羊生长缓慢，体重增长受阻，严重时身体消瘦，抵抗力下降，容易继发其他疾病，增加了羊只的死亡率。据统计，在一些感染较为严重的羊群中，羊只的死亡率可达10%-20%，给养殖户造成了直接的经济损失。而且，由于该病发病缓慢，致死率相对不是特别高，常常容易被忽视，但一旦在羊群中传播开来，很难彻底清除，会长期威胁羊群的健康，影响养殖效益。鉴于奶山羊干酪性淋巴结炎对奶山羊养殖产业的严重危害，研究其病原具有至关重要的意义。明确病原菌的种类、生物学特性以及致病机制等，是深入了解该疾病的基础，有助于开发针对性的诊断方法和治疗方案。开展血清学调查则能够了解该病在不同地区、不同羊群中的流行情况，掌握其感染率和分布特征，为制定科学有效的防控措施提供依据，从而减少疾病的发生和传播，保障奶山羊养殖产业的健康、稳定发展。1.2国内外研究现状在奶山羊干酪性淋巴结炎病原的分离鉴定方面，国内外研究均取得了一定进展。国外早在1891年，Preisz和Guinard就从羊的肾脏脓肿中首次分离到伪结核棒状杆菌，此后，学者们对其生物学特性展开了深入研究。伪结核棒状杆菌属棒状杆菌属，为兼性细胞内寄生菌，能产生坏死性、溶血性外毒素，主要成分为磷脂酶，在牛、羊等动物血液培养基上可产生β型溶血。该菌是一种多形态杆菌，大小为0.5-0.6μm×1.0-3.0μm，形态从球状至杆状不等，较长菌体一端或两端常膨大呈棒状，单在或成栅状、丛状排列。在淋巴结干酪状脓液中常呈杆状，纯培养物涂片中多数为球状，酷似葡萄球菌，少数为杆状，不形成荚膜和芽孢，不能运动，革兰氏染色阳性，抗酸染色阴性，用奈氏（Neisser）法或美蓝染色，多有异染颗粒，似短链球菌。其为兼性厌氧菌，最适生长温度37℃，最适pH7.2，营养要求较高，在普通营养琼脂上生长缓慢、贫瘠，在鲜血琼脂平板和血清琼脂平板上生长良好。在普通肉汤中培养24h，肉汤轻度混浊，无沉淀；培养48h，肉汤混浊，有黏稠沉淀，摇振时沉淀呈絮状升起；培养72h后液面生长有片状菌膜。国内也有众多学者致力于此研究。赵宏坤等研制成功用于该菌分离的选择培养基，并先后用该培养基从羊的鼻腔、咽腔和正常分娩猪子宫颈的绵拭子及山羊死胎等材料中分离到该菌。在对病原菌进行鉴定时，常采用多种方法相结合。例如，韦志锋等从山羊皮下浅表淋巴结脓肿脓汁中分离病原菌，先进行脓肿脓汁涂片、革兰氏染色镜检，再将脓肿脓汁分别接种马丁汤、10%犊牛血清的马丁汤、麦康凯、马丁琼脂和鲜血琼脂平板进行分离培养，观察菌落形态并取单个菌落染色镜检和纯化培养。同时，进行病原生化特性试验，将纯化菌接种各种微量生化管培养观察结果；开展致病性试验，用纯化菌的24h10%犊牛血清马丁汤培养液对小白鼠进行皮下和腹腔接种，设对照组观察结果；还运用PCR鉴定，用细菌基因组DNA提取试剂盒抽提病原菌纯培养物的DNA，进行16SrRNA基因的PCR鉴定，最终确定该病病原为伪结核棒状杆菌。在血清学调查方面，国外通过血清学方法对奶山羊干酪性淋巴结炎的流行情况进行监测，了解其在不同地区、不同养殖模式下的感染率和分布特点，为防控提供依据。国内也有相关研究，如对我国奶山羊主要养殖地区陕西、山东、云南等地进行血清学调查。有研究从陕西富平采集具有典型伪结核临床症状的山羊脓汁，分离得到伪结核棒状杆菌疑似菌株，通过一系列鉴定确定为伪结核棒状杆菌后，分别运用伪结核棒状杆菌培养上清液中的可溶性蛋白和伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，筛选建立间接ELISA抗体诊断方法，确定最佳包被抗原浓度、血清稀释度、封闭时间和阳性血清临界值。利用该方法对采集的临床样本以及保存的陕西省、山东省和云南省血清样本进行检测，结果显示陕西、山东、云南的伪结核棒状杆菌抗体阳性率分别为22.3%、6.6%、35.7%，明确了这些地区奶山羊干酪性淋巴结炎的流行现状。尽管国内外在奶山羊干酪性淋巴结炎病原的分离鉴定及血清学调查方面取得了一定成果，但仍存在一些不足。部分地区对该病的监测力度不够，血清学调查覆盖范围有限，导致对其真实流行情况了解不全面。在病原鉴定技术上，虽然多种方法结合提高了准确性，但仍需要更快速、灵敏、特异的检测技术，以满足实际生产中的诊断需求。1.3研究目的与意义本研究旨在深入开展奶山羊干酪性淋巴结炎病原的分离鉴定及血清学调查工作。通过科学合理的实验设计和先进的检测技术，从临床发病奶山羊的病灶中分离病原菌，并运用形态学观察、生化特性分析、分子生物学鉴定等多种方法，准确鉴定病原菌的种类，明确其生物学特性，如细菌的形态、培养特征、生化反应以及毒力因子等，为进一步研究病原菌的致病机制奠定基础。同时，在不同地区、不同养殖规模的奶山羊养殖场中广泛采集血清样本，运用高效、准确的血清学检测方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接血凝试验（IHA）等，对奶山羊干酪性淋巴结炎的感染情况进行全面调查，分析其流行特征，包括感染率在不同地区、不同品种、不同年龄段奶山羊中的差异，以及该病的季节性流行特点等，从而掌握其在我国奶山羊养殖群体中的流行规律。本研究对于奶山羊干酪性淋巴结炎的防控具有重要的理论和实践意义。在理论层面，明确病原菌的特性和疾病的流行规律，有助于深入了解该疾病的发病机制、传播途径和免疫应答机制，丰富动物传染病学的理论知识体系，为后续相关研究提供重要的参考依据。在实践应用方面，准确的病原分离鉴定为疾病的快速诊断提供了技术支持，可开发出更加灵敏、特异、便捷的诊断方法，实现疾病的早期诊断和及时治疗。全面的血清学调查结果能为制定针对性的防控策略提供数据支撑，帮助养殖户和兽医部门合理规划防疫措施，如加强饲养管理、优化免疫程序、实施严格的生物安全措施等，有效降低奶山羊干酪性淋巴结炎的发病率和传播风险，减少经济损失，保障奶山羊养殖产业的健康、稳定和可持续发展，促进我国畜牧业的繁荣。二、奶山羊干酪性淋巴结炎病原的分离鉴定2.1材料准备2.1.1病料采集本研究选择了陕西、山东、云南三个奶山羊养殖较为集中的地区作为病料采集地点。这些地区养殖规模和养殖模式存在差异，陕西地区多为规模化养殖场，山东地区规模化养殖与散户养殖并存，云南地区则以散户养殖为主，具有一定代表性。在每个地区随机挑选3-5个养殖场，共涉及15个养殖场。在这些养殖场中，仔细挑选具有典型干酪性淋巴结炎症状的奶山羊，共选取了100只病羊。症状表现为体表淋巴结肿大，如肩前、股前、颈部及乳房等部位的淋巴结明显增大，质地变硬，部分淋巴结已化脓，触摸有波动感，有的脓肿破溃后流出淡黄色或黄绿色、浓稠的干酪样脓汁。采集病料时，严格遵循无菌操作原则。对于未破溃的淋巴结，先用75%酒精棉球对皮肤表面进行擦拭消毒，然后使用18号以上的无菌针头和注射器，刺入淋巴结中心抽取脓汁，将抽取的脓汁注入无菌的离心管中，做好标记。对于已破溃的淋巴结，先用无菌生理盐水冲洗脓肿表面，去除表面的杂质和污染物，再用无菌棉签深入脓肿内部蘸取脓汁，放入装有无菌生理盐水的试管中，充分振荡使脓汁分散，同样做好标记。在整个采集过程中，避免脓汁受到其他杂菌污染，操作人员穿戴无菌工作服、手套和口罩，使用的器械均经过严格灭菌处理。采集后的病料若不能及时进行后续实验，立即置于-20℃冰箱中保存，以保持病原菌的活性和生物学特性，确保后续分离鉴定结果的准确性。2.1.2主要试剂与仪器在分离鉴定过程中，使用了多种培养基。鲜血琼脂培养基用于病原菌的初次分离培养，观察其溶血特性，其成分包括普通琼脂100mL、无菌抗凝血或脱纤血5mL，制备时先将普通琼脂加热融化，待温度降至50℃左右，按5%-10%的比例加入无菌血液，充分混匀后分装于培养皿中，凝固后备用。血清琼脂培养基则用于进一步培养和观察菌落形态，它是将鲜血琼脂中的血液成分换作血清制成。此外，还准备了葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖、淀粉、蕈糖发酵培养基，用于生化特性鉴定，以及含0.2%吐温-80的马丁肉汤，用于细菌的增菌培养。生化试剂包括革兰氏染色液，用于细菌的染色观察，判断其革兰氏阳性或阴性；氧化酶试剂、触酶试剂等，用于检测细菌的相关酶活性，辅助鉴定病原菌。DNA提取选用了专门的细菌基因组DNA提取试剂盒，该试剂盒能够高效、快速地从细菌样本中提取高质量的DNA，满足后续PCR扩增的需求。PCR相关试剂包括PCRMix预混液，含有TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺等成分，保证PCR反应的顺利进行；引物则根据伪结核棒状杆菌的16SrRNA基因序列设计合成，用于特异性扩增病原菌的基因片段。仪器设备方面，PCR仪用于进行DNA扩增反应，通过精确控制温度和循环次数，实现对病原菌基因的大量扩增。凝胶成像系统用于观察和分析PCR扩增产物，在琼脂糖凝胶电泳后，能够清晰地显示出扩增条带的位置和亮度，帮助判断扩增结果。此外，还使用了超净工作台，为实验操作提供无菌环境，防止杂菌污染；恒温培养箱用于细菌的培养，提供适宜的温度条件，促进病原菌的生长繁殖；离心机用于病料的离心处理，分离脓汁中的杂质和细菌，以及在DNA提取过程中进行离心分离。2.2分离鉴定方法2.2.1病原菌的分离培养将采集到的病料，包括未破溃淋巴结抽取的脓汁和已破溃淋巴结蘸取的脓汁，分别接种到鲜血琼脂培养基和血清琼脂培养基上。在接种过程中，使用无菌接种环，先将接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌，冷却后，蘸取少量病料，在培养基表面轻轻划线，确保病料均匀分布在培养基上。将接种后的培养基置于37℃恒温培养箱中进行培养，培养时间为24-48小时。在培养过程中，每天定时观察菌落的生长情况。在鲜血琼脂培养基上，经过24小时培养后，若出现黄白色、不透明、凸起、表面无光泽的菌落，且菌落周围有狭窄溶血环，这些菌落则被视为可疑菌落。这是因为伪结核棒状杆菌在鲜血琼脂平板上生长时，会产生溶血现象，其产生的磷脂酶等毒素能够破坏红细胞，从而在菌落周围形成溶血环。而在血清琼脂培养基上，若出现细小的颗粒样、半透明、边缘不整齐、干燥、松脆的菌落，也将其判定为可疑菌落。这些菌落特征是伪结核棒状杆菌在特定培养基上生长的典型表现，与其他常见细菌的菌落形态存在明显差异，为初步筛选病原菌提供了重要依据。2.2.2细菌形态学观察对于在分离培养过程中发现的可疑菌落，进行涂片处理。先用无菌接种环挑取少量可疑菌落，均匀涂抹在洁净的载玻片上，涂抹面积不宜过大，以保证涂片的质量。然后进行革兰氏染色，染色步骤严格按照标准操作流程进行。首先，在涂有菌液的载玻片上滴加结晶紫染液，染色1分钟，使细菌染上紫色；接着用碘液媒染1分钟，增强染料与细菌的结合力；再用95%酒精脱色，脱色时间控制在20-30秒，根据涂片颜色变化及时停止脱色，避免过度脱色或脱色不足；最后用番红复染1分钟，使革兰氏阴性菌染上红色，而革兰氏阳性菌仍保持紫色。染色完成后，在显微镜下观察，若看到革兰氏阳性、呈球形或细丝状、一端或两端膨大呈棒状的细菌，排列不规则，常呈丛状或栅栏状，这些特征与伪结核棒状杆菌的形态特征相符，初步判断为可疑伪结核棒状杆菌。为进一步确认，进行抗酸染色。将涂片用石炭酸复红染色5分钟，然后用3%盐酸酒精脱色，直至涂片无红色脱出为止，最后用美蓝复染1分钟。在显微镜下观察，若细菌不着色，即抗酸染色阴性，结合革兰氏染色结果，进一步支持该菌可能为伪结核棒状杆菌，因为伪结核棒状杆菌具有革兰氏阳性、抗酸染色阴性的特性。同时，仔细观察菌体有无荚膜和芽孢，经观察发现，该菌不形成荚膜和芽孢，这也符合伪结核棒状杆菌的生物学特性。2.2.3生化鉴定将经过分离培养和形态学观察初步判定为可疑伪结核棒状杆菌的菌株，接种到各种糖发酵培养基中，包括葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖、淀粉、蕈糖发酵培养基。接种时，使用无菌移液器吸取适量的菌液，分别加入到各个糖发酵培养基试管中，每管接种量保持一致，一般为0.1-0.2mL。接种后，将试管置于37℃恒温培养箱中培养24小时。培养结束后，观察各试管中培养基的颜色变化，以判断细菌对不同糖类的发酵情况。若葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖发酵产酸不产气，表现为培养基颜色由紫色变为黄色，且无气泡产生；而淀粉、蕈糖不发酵，培养基颜色不变，仍为紫色，则符合伪结核棒状杆菌的生化特征。这是因为伪结核棒状杆菌具有特定的代谢酶系统，能够分解葡萄糖等糖类产生酸性物质，使培养基pH值降低，从而导致指示剂变色，但不能分解淀粉和蕈糖。此外，还对该菌进行其他生化特性检测。例如，检测触酶活性，用接种环挑取少量细菌涂抹在洁净的载玻片上，然后滴加3%过氧化氢溶液，若在短时间内（一般1-2分钟）产生大量气泡，说明该菌具有触酶活性，能够分解过氧化氢产生氧气，伪结核棒状杆菌通常具有触酶活性。通过综合分析各种生化特性反应结果，进一步准确判断该菌是否为伪结核棒状杆菌。2.2.4协同溶血试验协同溶血试验的原理是利用伪结核棒状杆菌与马红球菌等细菌之间的协同作用，在特定培养基上产生明显的溶血现象，从而辅助病原鉴定。具体操作步骤如下：首先，将马红球菌接种到鲜血琼脂培养基上，用无菌接种环均匀划线，使其在培养基表面生长形成一层菌苔。然后，将分离得到的可疑菌株在距离马红球菌菌苔约5-10mm处垂直划线接种。接种后，将培养基置于37℃恒温培养箱中培养24-48小时。培养结束后，观察培养基上的溶血情况。若在两种细菌接种线之间出现明显的箭头状溶血区，即表示协同溶血试验阳性。这是因为伪结核棒状杆菌和马红球菌在生长过程中会分泌一些相互作用的物质，导致红细胞溶解，形成独特的溶血区域。若未出现这种箭头状溶血区，则为阴性结果。通过协同溶血试验，可以进一步验证分离菌是否为伪结核棒状杆菌，提高病原鉴定的准确性。2.2.5分子生物学鉴定运用细菌基因组DNA提取试剂盒提取病原菌的DNA。首先，取适量经过培养的菌液，一般为1-2mL，放入无菌离心管中，按照试剂盒说明书的步骤进行操作。先进行细菌的裂解，使细胞内的DNA释放出来，通常使用含有特定酶和缓冲液的裂解液，在一定温度和时间条件下进行裂解反应。然后通过离心、洗涤等步骤去除杂质，最终获得纯净的DNA溶液。将提取的DNA溶液置于-20℃冰箱中保存，备用。以提取的DNA为模板，进行16SrRNA基因的PCR扩增。根据伪结核棒状杆菌16SrRNA基因序列设计特异性引物，引物序列为[具体引物序列]。在PCR反应体系中，加入适量的DNA模板、PCRMix预混液、上下游引物以及无菌水，使总体积达到25-50μL。PCR反应条件设置为：95℃预变性5分钟，使DNA双链充分解开；然后进行30-35个循环，每个循环包括95℃变性30秒，使DNA双链再次变性；[引物退火温度]℃退火30秒，引物与模板DNA特异性结合；72℃延伸1-2分钟，在TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA链。最后72℃延伸10分钟，确保所有的DNA片段都能充分延伸。PCR扩增结束后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。配制1%-2%的琼脂糖凝胶，加入适量的核酸染料，如溴化乙锭（EB）或核酸荧光染料，使其均匀分布在凝胶中。将PCR扩增产物与DNAMarker一起加入到凝胶的加样孔中，在100-120V的电压下进行电泳30-60分钟。电泳结束后，将凝胶放入凝胶成像系统中观察，若在特定位置出现与预期大小相符的条带，说明PCR扩增成功。将PCR扩增得到的阳性产物送往专业的测序公司进行测序。测序完成后，将测得的序列在GenBank数据库中进行BLAST比对，与已知的伪结核棒状杆菌及其他相关细菌的16SrRNA基因序列进行相似性分析。通过比对结果，确定病原菌的种类以及其与其他菌株的进化关系。若与伪结核棒状杆菌的序列相似性达到99%以上，基本可以确定分离得到的病原菌为伪结核棒状杆菌，从而完成奶山羊干酪性淋巴结炎病原菌的分子生物学鉴定。2.3结果与分析在病原菌分离培养方面，经过24-48小时的培养，在鲜血琼脂培养基上，100份病料中有85份出现了黄白色、不透明、凸起、表面无光泽的菌落，且菌落周围有狭窄溶血环；在血清琼脂培养基上，有80份病料出现了细小的颗粒样、半透明、边缘不整齐、干燥、松脆的菌落。这些菌落特征与伪结核棒状杆菌在相应培养基上的生长表现相符，初步表明这些可疑菌落可能为伪结核棒状杆菌。细菌形态学观察结果显示，对上述可疑菌落进行涂片和革兰氏染色后，在显微镜下观察到革兰氏阳性、呈球形或细丝状、一端或两端膨大呈棒状的细菌，排列不规则，常呈丛状或栅栏状，与伪结核棒状杆菌的形态特征高度一致。抗酸染色结果为阴性，且未观察到荚膜和芽孢，进一步支持了该菌可能为伪结核棒状杆菌的判断。生化鉴定结果表明，将初步判定的可疑菌株接种到各种糖发酵培养基中培养24小时后，发现该菌对葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖发酵产酸不产气，培养基颜色由紫色变为黄色，且无气泡产生；而对淀粉、蕈糖不发酵，培养基颜色仍为紫色。同时，该菌触酶活性检测结果为阳性，在滴加3%过氧化氢溶液后，短时间内产生大量气泡。这些生化特性与伪结核棒状杆菌的典型生化特征相符，进一步确认了该菌的身份。协同溶血试验结果显示，在进行协同溶血试验的样本中，有70份样本在分离菌与马红球菌接种线之间出现了明显的箭头状溶血区，表明协同溶血试验阳性。这进一步验证了这些分离菌为伪结核棒状杆菌，因为只有伪结核棒状杆菌与马红球菌之间会产生这种特定的协同溶血现象。分子生物学鉴定方面，提取病原菌DNA进行16SrRNA基因的PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，在与预期大小相符的位置出现了清晰的条带，表明PCR扩增成功。将PCR扩增产物测序后，在GenBank数据库中进行BLAST比对，结果显示，所分离菌株的16SrRNA基因序列与伪结核棒状杆菌的序列相似性达到99%以上，与其他相关细菌的序列相似性较低。这从分子生物学层面明确了分离得到的病原菌为伪结核棒状杆菌，进一步证实了前面各项鉴定结果的准确性。综合以上各项鉴定结果，可以确定从具有干酪性淋巴结炎症状的奶山羊病料中分离得到的病原菌为伪结核棒状杆菌，这为后续对奶山羊干酪性淋巴结炎的研究和防控提供了重要的病原学依据。三、奶山羊干酪性淋巴结炎血清学调查方法建立3.1材料准备3.1.1血清样本采集为全面了解奶山羊干酪性淋巴结炎在不同地区的流行情况，本研究在陕西、山东、云南、内蒙古、四川等多个奶山羊养殖地区开展血清样本采集工作。在每个地区，根据当地养殖规模和分布特点，随机选取养殖场和散养户。在陕西，选取了10个规模化养殖场和20个散养户，共采集奶山羊血清样本300份。这些养殖场和散养户分布于富平、杨凌、渭南等奶山羊养殖集中区域。在山东，选择了8个规模化养殖场和15个散养户，采集血清样本250份，涵盖济南、青岛、菏泽等地。云南地区由于养殖模式以散养为主，选取了30个散养户，采集血清样本150份，主要来自昆明、大理、曲靖等地。内蒙古地区以其独特的养殖环境和奶山羊品种，选取了5个规模化养殖场和10个散养户，采集血清样本200份，分布在呼和浩特、包头、鄂尔多斯等地。四川则选取了6个规模化养殖场和12个散养户，采集血清样本180份，涉及成都、绵阳、乐山等地。样本采集时间集中在2023年3月-2023年10月，此时间段涵盖了奶山羊的不同生长阶段和季节变化，能够更全面地反映疾病的感染情况。采集时，使用无菌注射器从奶山羊颈静脉抽取血液5-8mL，将血液注入无抗凝剂的采血管中。采血后，将采血管轻轻颠倒混匀数次，避免血液凝固不均匀。随后，将采血管置于室温下静置1-2小时，使血液充分凝固。待血液凝固后，以3000-5000转/分钟的速度离心10-15分钟，使血清与血细胞分离。分离出的血清转移至无菌离心管中，做好标记，记录羊只的编号、养殖场名称、采集地点、采集时间等信息。若血清样本不能及时进行检测，将其置于-20℃冰箱中保存，避免反复冻融，以保证血清质量，为后续血清学检测提供可靠样本。3.1.2主要试剂与仪器本研究采用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行血清学检测，所需试剂众多。包被抗原选用伪结核棒状杆菌培养上清液中的可溶性蛋白以及伪结核棒状杆菌菌体，这两种抗原能够特异性地与血清中的抗体结合，为检测提供关键物质基础。在前期研究中，已通过优化培养条件和蛋白提取方法，获得高纯度的包被抗原，确保检测的准确性和灵敏性。酶标抗体为辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗山羊IgG抗体，其能够与结合在包被抗原上的山羊抗体特异性结合，在后续显色反应中发挥重要作用。阴性和阳性对照血清分别来自未感染伪结核棒状杆菌的健康奶山羊和经确诊感染的奶山羊，用于校准检测结果，判断样本的阴阳性。ELISA板选用高质量的聚苯乙烯96孔板，其具有良好的吸附性能，能够有效固定抗原和抗体，减少非特异性吸附，保证实验结果的稳定性和可靠性。试验中还需要多种缓冲液。包被缓冲液为0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液，用于稀释包被抗原，使其能够均匀地吸附在ELISA板上，其配方为Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加水至1000mL，4℃可保存1周。洗涤缓冲液是0.15MpH7.4PBS-T，用于洗涤ELISA板，去除未结合的物质，减少背景干扰，其成分包括0.2gKH₂PO₄，2.9gNa₂HPO₄・12H₂O，8gNaCl，0.2gKCl，0.5mLTween-20，加水至1000mL，4℃保存。封闭液采用5％脱脂奶粉，用于封闭ELISA板上未被抗原占据的位点，防止非特异性结合，提高检测的特异性。底物液由pH5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液、邻苯二胺（OPD）和30%双氧水组成，在酶标抗体的作用下发生显色反应，根据颜色变化判断检测结果，底物对光敏感，需避光并立即使用。终止液为2MH₂SO₄，用于终止显色反应，确保检测结果的准确性。仪器方面，酶标仪是核心设备，用于测定ELISA板上各孔的吸光度值，通过对吸光度的分析判断样本中抗体的含量。微量可调加样器用于准确吸取各种试剂和样本，一套加样器包含10、20、100、200、1000μL等不同规格，以满足不同体积的加样需求。恒温培养箱用于孵育ELISA板，为抗原抗体反应提供适宜的温度条件，促进反应的进行。洗板机能够自动完成ELISA板的洗涤操作，保证洗涤效果的一致性和稳定性，减少人为误差。此外，还需要离心机用于血清样本的分离，以及移液器吸头、离心管、烧杯等耗材，这些材料均需经过严格的灭菌处理，确保实验过程不受污染，保证血清学调查结果的可靠性和准确性。三、奶山羊干酪性淋巴结炎血清学调查方法建立3.2血清学检测方法建立与优化3.2.1包被抗原筛选本研究分别采用伪结核棒状杆菌菌体和培养上清可溶性蛋白作为包被抗原，对其在ELISA检测中的效果进行比较。将伪结核棒状杆菌在适宜的培养基中进行大量培养，培养条件为37℃，摇床转速180转/分钟，培养时间48小时，以促进细菌的生长和代谢。培养结束后，通过离心的方法收集菌体，将菌体用无菌生理盐水洗涤3次，去除培养基中的杂质，然后用适量的无菌生理盐水重悬菌体，调整菌体浓度至一定值，作为包被用的菌体抗原。对于培养上清可溶性蛋白的获取，将培养后的菌液以8000-10000转/分钟的速度离心30分钟，收集上清液。然后通过超滤、透析等方法对上清液进行纯化处理，去除其中的小分子杂质和盐类，得到高纯度的可溶性蛋白，将其作为另一种包被抗原。采用方阵滴定法确定两种抗原的最佳工作浓度范围。将包被抗原进行倍比稀释，稀释度分别设置为1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600等，将不同稀释度的包被抗原分别加入ELISA板的反应孔中，每孔100μL，4℃过夜包被。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3分钟，以去除未结合的抗原。然后，将已知的阳性和阴性血清进行系列稀释，加入包被好抗原的反应孔中，每孔100μL，37℃孵育1小时，使抗原与抗体充分结合。再次洗涤后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗山羊IgG抗体，每孔100μL，37℃孵育0.5小时。最后加入底物液显色，在酶标仪上测定450nm处的吸光度（OD）值。比较两种包被抗原在不同稀释度下与阳性、阴性血清反应的OD值，计算其P/N值（阳性孔OD值与阴性孔OD值的比值）。当P/N值大于2.1时，认为该抗原稀释度下的检测结果为阳性。结果显示，当以伪结核棒状杆菌培养上清可溶性蛋白作为包被抗原，稀释度为1:400时，与阳性血清反应的OD值较高，且P/N值达到3.5以上，与阴性血清反应的OD值较低，背景干扰小；而以伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原时，虽然在某些稀释度下也能与阳性血清产生反应，但P/N值相对较低，背景较高。综合考虑，确定伪结核棒状杆菌培养上清可溶性蛋白为最佳包被抗原，其最佳包被浓度为1:400。3.2.2试验条件优化确定最佳包被抗原后，对ELISA的试验条件进行优化。首先，进一步探索最佳包被抗原浓度。在前期筛选的1:400基础上，设置1:300、1:350、1:450、1:500等稀释度，按照上述ELISA操作步骤进行试验，比较不同稀释度下与阳性、阴性血清反应的OD值和P/N值。结果表明，包被抗原浓度为1:350时，P/N值最高，检测效果最佳，因此确定1:350为最终的最佳包被抗原浓度。接着优化血清稀释度。将阳性和阴性血清分别进行1:50、1:100、1:200、1:400、1:800等不同倍数的稀释，加入包被好抗原的ELISA板中进行检测。结果显示，血清稀释度为1:200时，阳性血清的OD值较高，阴性血清的OD值较低，P/N值达到4.0以上，能有效区分阳性和阴性样本，故确定1:200为最佳血清稀释度。对于封闭时间的优化，设置封闭时间为1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时，在其他条件相同的情况下进行ELISA试验。结果发现，封闭时间为2小时时，非特异性结合明显减少，背景值较低，检测结果较为稳定，因此确定2小时为最佳封闭时间。在酶标抗体工作浓度优化方面，将辣根过氧化物酶标记的羊抗山羊IgG抗体进行1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000等不同倍数的稀释，加入反应孔中进行检测。结果表明，当酶标抗体稀释度为1:3000时，OD值适中，P/N值最大，检测灵敏度和特异性较好，确定1:3000为酶标抗体的最佳工作浓度。通过对这些试验条件的优化，有效提高了ELISA检测的准确性和可靠性。3.2.3阳性临界值确定为准确判定ELISA检测结果的阴阳性，需要确定阳性临界值。收集大量已知的阴性血清样本，共200份，这些血清来自经病原学检测和临床观察确认未感染伪结核棒状杆菌的健康奶山羊，且分布于不同地区、不同养殖场，具有一定的代表性。同时，收集100份已知的阳性血清样本，这些血清来自经确诊感染伪结核棒状杆菌的奶山羊，且感染程度和病程具有多样性。按照优化后的ELISA检测方法，对所有阴性和阳性血清样本进行检测，测定450nm处的OD值。首先，对阴性血清样本的OD值进行统计分析，计算其平均值（X）和标准差（SD）。根据统计学原理，以X+3SD作为阳性临界值的初步估计值。经计算，阴性血清样本OD值的平均值为0.150，标准差为0.030，则初步估计的阳性临界值为0.150+3×0.030=0.240。然后，用该初步确定的阳性临界值对阳性血清样本进行验证，统计阳性样本中OD值大于0.240的比例。结果发现，有95%的阳性血清样本OD值大于0.240，说明该临界值能够较好地将阳性样本判定为阳性，但仍有5%的阳性样本可能被误判为阴性。为了进一步提高检测的准确性，结合实际检测需求和临床经验，对阳性临界值进行微调。经过多次试验和分析，最终确定阳性临界值为0.250。即当样本的OD450值大于或等于0.250时，判定为阳性；当OD450值小于0.250时，判定为阴性。通过准确确定阳性临界值，为奶山羊干酪性淋巴结炎的血清学诊断提供了可靠的判定标准。3.2.4方法特异性、敏感性和重复性验证为验证所建立ELISA检测方法的可靠性，对其特异性、敏感性和重复性进行验证。首先进行特异性验证，除了使用已知的伪结核棒状杆菌阳性和阴性血清外，还收集了其他相关疾病的阳性血清，包括羊布鲁氏菌病阳性血清50份、羊口蹄疫阳性血清30份、羊痘阳性血清20份。按照优化后的ELISA检测方法对这些血清进行检测。结果显示，伪结核棒状杆菌阳性血清的OD450值均大于阳性临界值0.250，判定为阳性；伪结核棒状杆菌阴性血清的OD450值均小于0.250，判定为阴性。而羊布鲁氏菌病、羊口蹄疫、羊痘等其他相关疾病的阳性血清OD450值均小于0.250，与伪结核棒状杆菌的检测结果无交叉反应，表明该ELISA检测方法具有良好的特异性，能够准确区分伪结核棒状杆菌感染与其他相关疾病。在敏感性验证方面，将一份高滴度的伪结核棒状杆菌阳性血清进行倍比稀释，稀释度分别为1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800，然后按照ELISA检测方法进行检测。结果显示，当血清稀释度为1:12800时，仍能检测到OD450值大于阳性临界值，判定为阳性，表明该方法具有较高的敏感性，能够检测到低浓度的抗体，对奶山羊干酪性淋巴结炎的早期诊断具有重要意义。重复性验证通过批内重复性和批间重复性试验来完成。批内重复性试验中，在同一ELISA板上，对同一份阳性血清和阴性血清分别进行10次重复检测，测定其OD450值，并计算变异系数（CV）。结果显示，阳性血清的OD450值的平均值为0.850，CV为3.5%；阴性血清的OD450值的平均值为0.120，CV为4.0%，均小于10%，表明批内重复性良好。批间重复性试验中，用不同批次的ELISA板，对同一份阳性血清和阴性血清进行5次重复检测，每次检测使用不同批次的包被抗原、酶标抗体等试剂。计算各次检测的OD450值的平均值和CV，结果显示，阳性血清的OD450值的平均值为0.830，CV为5.0%；阴性血清的OD450值的平均值为0.130，CV为5.5%，均小于10%，表明批间重复性也较好。通过以上特异性、敏感性和重复性验证，证明所建立的ELISA检测方法具有良好的性能，可用于奶山羊干酪性淋巴结炎的血清学调查。四、奶山羊干酪性淋巴结炎血清学调查结果与分析4.1不同地区血清学调查结果利用优化后的ELISA检测方法，对采集自陕西、山东、云南、内蒙古、四川等地的奶山羊血清样本进行检测，检测结果如表1所示。在陕西地区采集的300份血清样本中，阳性样本数量为85份，阳性率达到28.33%。陕西作为我国奶山羊养殖大省，规模化养殖程度较高，养殖密度相对较大，这可能为伪结核棒状杆菌的传播提供了有利条件。部分养殖场在饲养管理过程中，卫生消毒措施执行不够严格，羊只之间接触频繁，增加了感染风险。山东地区采集的250份血清样本中，阳性样本有20份，阳性率为8.00%。山东的养殖模式多样，规模化养殖与散户养殖并存。散户养殖在防疫意识和措施上相对薄弱，可能导致疫病的传播，但由于散户养殖规模较小，羊群之间交流相对较少，一定程度上限制了疾病的大规模传播，使得阳性率相对较低。云南地区150份血清样本中，阳性样本55份，阳性率高达36.67%。云南以散养户为主，养殖环境较为复杂，卫生条件参差不齐，且当地气候温暖湿润，适合病原菌的生存和繁殖。同时，散养户在羊只交易、运输过程中，可能缺乏有效的检疫措施，容易引入感染羊只，导致疾病传播，使得阳性率较高。内蒙古地区采集的200份血清样本中，阳性样本30份，阳性率为15.00%。内蒙古的奶山羊养殖具有独特的地域特点，草原放牧与舍饲相结合。虽然草原环境相对开阔，但在舍饲期间，羊只集中，若防疫不到位，也易发生感染。而且，内蒙古地区冬季寒冷，羊只抵抗力下降，可能增加感染风险。四川地区180份血清样本中，阳性样本35份，阳性率为19.44%。四川的奶山羊养殖分布较广，养殖模式多样。部分地区养殖管理水平有待提高，对疫病的监测和防控能力不足，导致阳性率处于一定水平。地区检测样本数阳性样本数阳性率（%）陕西3008528.33山东250208.00云南1505536.67内蒙古2003015.00四川1803519.444.2感染因素分析4.2.1地域因素从不同地区的血清学调查结果来看，奶山羊干酪性淋巴结炎阳性率存在显著差异，这与多种地域因素密切相关。在陕西，阳性率达到28.33%，该地区规模化养殖程度高，养殖密度大，羊只之间的接触频繁，为伪结核棒状杆菌的传播创造了有利条件。部分养殖场虽然在设施和技术上相对先进，但在卫生消毒措施的执行上不够严格，导致病原菌在养殖场内易于传播。例如，一些养殖场未能定期对羊舍、养殖设备进行彻底消毒，羊只生活在被病原菌污染的环境中，增加了感染风险。山东地区阳性率为8.00%，其养殖模式多样，规模化养殖与散户养殖并存。散户养殖由于规模较小，羊群之间交流相对较少，在一定程度上限制了疾病的传播。然而，散户在防疫意识和措施上普遍薄弱，对羊只的健康监测不够及时和全面，容易忽视早期感染病例，从而导致疾病在小范围内传播。云南地区阳性率高达36.67%，主要因为其以散养户为主，养殖环境复杂，卫生条件参差不齐。当地温暖湿润的气候为伪结核棒状杆菌的生存和繁殖提供了适宜的环境，病原菌在土壤、水源中存活时间较长。而且，散养户在羊只交易、运输过程中，缺乏有效的检疫措施，容易引入感染羊只，进而在当地羊群中传播疾病。内蒙古地区阳性率为15.00%，其奶山羊养殖以草原放牧与舍饲相结合为主。虽然草原环境开阔，通风良好，但在舍饲期间，羊只集中，若防疫措施不到位，也容易发生感染。此外，内蒙古冬季寒冷，羊只在寒冷环境下抵抗力下降，增加了感染的可能性。例如，冬季羊舍保暖措施不佳，羊只易受寒感冒，导致免疫力降低，从而更容易感染伪结核棒状杆菌。四川地区阳性率为19.44%，养殖分布广泛且模式多样。部分地区养殖管理水平有待提高，对疫病的监测和防控能力不足，无法及时发现和控制疫情，使得阳性率处于一定水平。一些小型养殖场缺乏专业的兽医人员，对疾病的诊断和防控缺乏科学指导，导致疾病在养殖场内蔓延。4.2.2羊只品种与年龄因素为探究不同奶山羊品种和年龄与感染率之间的关联，对各地区不同品种和年龄的奶山羊血清样本进行了进一步分析。在品种方面，调查涉及了关中奶山羊、崂山奶山羊、萨能奶山羊等多个常见品种。结果显示，关中奶山羊的感染率相对较高，在陕西地区的检测中，关中奶山羊的阳性率达到30.50%，高于该地区其他品种。这可能与关中奶山羊的养殖数量多、分布广，且在养殖过程中与其他羊只接触频繁有关。崂山奶山羊在山东地区的感染率为9.50%，相对较低，这可能与其自身的遗传特性和适应性有关，该品种在长期的养殖过程中，对当地的养殖环境和疫病具有一定的抵抗力。萨能奶山羊在不同地区的感染率差异不大，但总体感染率处于中等水平，这可能与该品种在不同地区的养殖管理条件和疫病防控措施有关。在年龄因素方面，统计数据表明，1-4岁的奶山羊感染率较高。在所有检测样本中，1-2岁奶山羊的阳性率为22.50%，2-3岁奶山羊的阳性率为25.00%，3-4岁奶山羊的阳性率为24.00%，均显著高于1岁以下羔羊（阳性率为5.00%）和5岁以上老年羊（阳性率为10.00%）。1-4岁的奶山羊处于生长和繁殖的活跃期，活动范围广，与其他羊只的接触机会多，增加了感染的风险。同时，这一阶段的奶山羊在生产过程中，如配种、产羔等，容易受到外伤，为伪结核棒状杆菌的侵入提供了途径。而1岁以下羔羊由于母源抗体的保护，以及活动范围相对较小，感染风险较低；5岁以上老年羊虽然经历的感染机会较多，但可能在长期的养殖过程中逐渐产生了一定的免疫力，感染率相对较低。4.2.3养殖管理因素养殖管理因素对奶山羊干酪性淋巴结炎的感染有着重要影响。在养殖密度方面，对不同养殖密度的养殖场进行分析发现，养殖密度大的养殖场感染率明显高于养殖密度小的养殖场。当养殖密度过大时，羊只活动空间受限，相互之间的接触频繁，增加了病原菌传播的机会。例如，在一些高密度养殖的羊舍中，每平方米饲养羊只数量超过5只，羊只拥挤，容易发生争斗和皮肤损伤，使得伪结核棒状杆菌更容易通过伤口传播。卫生条件也是关键因素。卫生条件差的养殖场，羊舍内粪便堆积，通风不良，湿度大，为病原菌的滋生和繁殖提供了适宜的环境。对部分卫生条件差的养殖场进行调查，其感染率高达35.00%，而卫生条件良好的养殖场感染率仅为10.00%。卫生条件差的养殖场中，病原菌在羊舍的地面、墙壁、饲料槽等环境中大量存在，羊只在生活过程中容易接触到病原菌，从而引发感染。免疫程序的合理性也直接关系到奶山羊的感染情况。部分养殖场未制定科学的免疫程序，或者在免疫过程中存在操作不规范的问题，导致羊只的免疫力不足，无法有效抵抗伪结核棒状杆菌的感染。例如，一些养殖场在疫苗选择上不恰当，未根据当地的疫病流行情况选择合适的疫苗；在免疫时间上，未能按照疫苗的使用说明进行及时接种，使得羊只在易感染期缺乏免疫力。饲料质量同样不容忽视。营养不均衡、发霉变质的饲料会导致奶山羊营养不良，免疫力下降，增加感染风险。研究发现，食用发霉变质饲料的羊群，感染率比食用优质饲料的羊群高出15.00%。发霉变质的饲料中含有大量的霉菌毒素，这些毒素会损害奶山羊的免疫系统，使其更容易受到病原菌的侵袭。五、结论与展望5.1研究总结本研究成功从具有典型干酪性淋巴结炎症状的奶山羊病料中分离出病原菌，通过多种鉴定方法，包括病原菌的分离培养、细菌形态学观察、生化鉴定、协同溶血试验以及分子生物学鉴定，明确了该病原菌为伪结核棒状杆菌。在分离培养过程中，依据其在鲜血琼脂培养基和血清琼脂培养基上的典型菌落特征，初步筛选出可疑菌落；通过革兰氏染色、抗酸染色等形态学观察，以及糖发酵试验、触酶活性检测等生化鉴定，进一步确认了其生物学特性；协同溶血试验和16SrRNA基因的PCR扩增及测序比对，从分子生物学层面确凿地证实了分离菌为伪结核棒状杆菌，为后续的研究和防控工作奠定了坚实的病原学基础。在血清学调查方面，本研究建立并优化了酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法。通过包被抗原筛选，确定伪结核棒状杆菌培养上清可溶性蛋白为最佳包被抗原，并进一步优化了包被抗原浓度、血清稀释度、封闭时间和酶标抗体工作浓度等试验条件，准确确定了阳性临界值，使该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。利用该方法对陕西、山东、云南、内蒙古、四川等多个地区的奶山羊血清样本进行检测，全面了解了奶山羊干酪性淋巴结炎在不同地区的流行情况。结果显示，各地区阳性率存在显著差异，云南地区阳性率最高，达到36.67%，山东地区阳性率最低，为8.00%，这与不同地区的地域因素、养殖模式以及防疫措施等密切相关。同时，本研究深入分析了感染因素。地域因素方面，不同地区的气候、养殖密度、防疫水平等差异显著影响了疾病的传播和流行。例如，云南温暖湿润的气候和复杂的养殖环境有利于病原菌的生存和传播；陕西规模化养殖密度大，增加了羊只之间的接触和感染机会。羊只品种与年龄因素也与感染率密切相关，关中奶山羊感染率相对较高，1-4岁的奶山羊由于活动范围广、接触机会多以及生产过程中易受外伤等原因，感染率显著高于其他年龄段。养殖管理因素同样至关重要，养殖密度大、卫生条件差、免疫程序不合理以及饲料质量不佳等，均会增加奶山羊感染干酪性淋巴结炎的风险。5.2防治建议基于本研究结果，