非洲猪瘟病毒一体化分子检测方法

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非洲猪瘟病毒一体化分子检测方法

Automaticintelligentmoleculardetectionmethod

forAfricanswinefevervirus

征求意见稿

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

中国兽医协会发布

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非洲猪瘟病毒一体化分子检测方法

1范围

本文件规定了非洲猪瘟病毒一体化分子检测方法的技术原理、试剂与耗材、仪器设备、操作方法和

结果判定。

本文件适用于猪唾液、血清或血浆、拭子（包括口鼻拭子、血拭子、肛拭子）、组织研磨液、种猪

精液中非洲猪瘟病毒核酸的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

SN/T1193基因检验实验室技术要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1MAOPA技术

MAOPA（MagneticbeadsmediatedAll-in-OnePolymeraseAmplification）技术，即磁珠介导的一体

化聚合酶扩增技术，实现磁珠贯穿核酸检测的全流程，减少了样品核酸随着吸附、洗涤、洗脱直至扩增

逐级发生的损耗，具备较强的兼容性，可为各类核酸检测方法的一体化提供技术平台。

3.2Unigen系统

Unigen系统是基于MAOPA技术开发的智能软件、搭配精密硬件的全封闭智能分析系统，采用微流

控卡槽式芯片技术将核酸提取与分子扩增整合在一体化全封闭反应装置中。

4符号和缩略语

下列缩略语适用于本文件。

ASFV：非洲猪瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus）

DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyriboNucleicAcid）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

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5原理

本方法针对非洲猪瘟病毒P72基因序列设计特异性引物和探针，并根据随机DNA序列设计了内标引

物和探针，同时将核酸提取与荧光PCR扩增通过微流控卡槽式芯片技术整合为一体，病原核酸可随着磁

珠全部进入反应体系，实现基于MAOPA技术的一体化分子检测。其中检测卡盒为本试剂盒重要组分之

一，在一体化卡盒的不同腔体位置依次装填各检测试剂密封后制备而成。其特征在于：通过在一个密闭

卡盒内设置多个分离腔体，相邻分离腔体之间使用柱塞阻断，分离腔体内分别放置有裂解液、洗涤液和

反应液；检测样品时，推动各个柱塞，使柱塞的柱塞孔对准分离腔体，进而导通各个分离腔体，利用电

磁控制方式，控制随待测样品一同加入的磁珠，依次经过各个分离腔体，完成样品核酸的吸附、洗涤、

洗脱和反应，最后从外部对反应液中基因扩增引起的荧光信号变化进行光学检测。与传统的荧光PCR

方法比较，非洲猪瘟病毒一体化分子检测方法操作更加便捷，特异性、敏感性、重复性好，降低污染风

险，为非洲猪瘟病毒的感染早期的精准检测及环境监测提供了技术支撑。

6试剂和耗材

6.1试剂

6.1.1除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682中二级水的要求。

6.1.2洗涤液Ⅰ，按照附录A中A.1配制。

6.1.3洗涤液Ⅱ，按照附录A中A.2配制。

6.1.4裂解液，按照附录A中A.3配制。

6.1.5磁珠，按照附录A中A.4配制。

6.1.6针对非洲猪瘟病毒P72基因序列设计的特异性引物和探针，并根据随机DNA序列设计的内标

引物和探针。P72基因序列和内标基因序列见附录B，引物和探针序列见表1。

表1引物和探针序列

名称序列

ASFV检测上游引物5’-GCCTTATGTTCCAGTAGGGT-3’

ASFV检测下游引物5’-AGTCTCCGTACTGGGGAATAC-3’

ASFV检测探针5’-（FAM）AGGTGGGGGTACCCGTATGC（BHQ1）-3’

内标上游引物5’-GGGATATACTACCTAAGGTTA-3’

内标下游引物5’-TGGTCGATTTACTAGAATTG-3’

内标探针5’-（ROX）CCTATTCAACGTATCGACATGGCTTAC（BHQ1）-3’

6.1.7非洲猪瘟病毒阳性对照样品：培养的灭活病毒，由指定单位提供；或为含有P72基因的重组大

肠杆菌菌液。

6.1.8非洲猪瘟病毒阴性对照样品：可采用健康猪的组织材料。

6.1.9内标样品：含有人工内标基因的重组大肠杆菌菌液。

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6.1.10其它商品化试剂：石蜡、硅油、荧光PCR预混液（2×）等。

6.1.11无菌去离子水，符合GB/T6682要求。

6.2耗材

6.2.1一体化检测卡盒。

6.2.2离心管（1.5mL，无核酸酶）。

6.2.3微量移液器吸头（10μL、200μL、1000μL，无核酸酶）。

7仪器设备

7.1二级生物安全柜。

7.2Unigen®全封闭智能分析系统

7.3微量可调移液器（2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格）。

7.4组织匀浆器。

7.5台式高速离心机。

8样品采集、处理和储存

8.1生物安全措施

样品采集及运输的生物安全措施按《NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范》的规

定执行；样品处理的生物安全措施按《GB19489实验室生物安全通用要求》的规定执行；基因检测实

验室按《SN/T1193基因检验实验室技术要求》的规定执行。

8.2样品采集及运输

样品采集及运输按照NY/T541的规定执行。采集猪全血、血清、口鼻拭子等液体样品，脾脏、扁桃

体、淋巴结、肾脏、骨髓、肌肉等组织样品，饲料、污水等周边环境样品用于检测，样品应在冷藏条件下

尽快运输至实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，结束后严格按NY/T541的规定

实施现场消毒和废弃物处理。

8.3样品处理

应在Ⅱ级生物安全柜中处理检测前样品。样品处理方法如下：

8.3.1唾液样品：5000r/min离心2min，吸取200μL上清上样。

8.3.2拭子（包括口鼻拭子、血拭子、肛拭子）样品：5000r/min离心2min，吸取上清待检。

8.3.3组织研磨液样品：5000r/min离心5min，吸取上清待检。

8.3.4种猪精液样品：反复冻融3次，5000r/min离心2min，吸取上清待检。

8.3.5血清或血浆样品：无需处理，可直接吸取待检。

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8.4样品存放

采集或处理好的样品在2℃～8℃保存应不超过24小时；若需长期保存，须放置−70℃以下保存，并

应避免反复冻融。

9操作步骤

9.1扩增反应液的配制

将40μmol/LASFV检测上游和下游引物各0.5µL，20μmol/L探针0.4µL，与40μmol/L内标上游、下游

引物各0.4µL、20μmol/L探针0.3µL，荧光PCR预混液（2×）20µL，无菌去离子水17.5µL混合均匀。

9.2检测卡盒的装填

将40μL扩增反应液、0.058g石蜡（加热溶解后装填）、0.51g硅油、各140μL洗涤液Ⅱ、洗涤液Ⅰ和1.2mL

裂解液依次灌装至一体化空卡盒对应位置，完成检测卡盒的装填，如附录A.5中图1所示。

9.3一体化分子检测

9.3.1加样

打开检测卡盒顶盖，分别向各卡盒中加入20μL内标样品、10μL磁珠（需提前混匀）及200μL-600μL

待测样品，盖紧卡盒顶盖，水平摇晃，使检测卡盒内液体充分混匀，转移至扩增区，每次检测设阴、阳

性对照。

9.3.2测定

打开Unigen®全封闭智能分析系统翻盖，按提示将检测卡盒插入仪器相应的检测通道，按紧。提取

部分运行参数为：裂解35℃8分钟；扩增部分运行参数为：预变性95°C5分钟；变性95°C15秒、退火延

伸58°C30秒，共45个扩增循环，于每一循环退火结束时收集FAM和ROX荧光信号。

10结果判定

10.1试验成立条件

阳性对照显示检测结果为阳性，同时FAM通道Ct值≤30并出现典型的扩增曲线，且内标ROX通道

Ct值≤30并呈现典型的扩增曲线；阴性对照显示检测结果为阴性，同时FAM通道无Ct值且无典型的扩

增曲线，且内标ROX通道Ct值≤30并呈现典型的扩增曲线，则判为试验成立。

10.2结果判定

10.2.1阳性

待检样品FAM通道Ct值＜36并呈现典型的扩增曲线，ROX通道Ct值≤30并呈现典型的扩增曲线。

10.2.2阴性

待检样品FAM通道无Ct值且无典型的扩增曲线，ROX通道Ct值≤30并呈现典型的扩增曲线。

10.2.3复检

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待检样品FAM通道36≤Ct值≤45并呈现典型的扩增曲线，ROX通道Ct值≤30并呈现典型的扩增曲

线，判为疑似；对疑似样品按原条件进行复检，结果FAM通道Ct值≤45并呈现典型的扩增曲线，ROX

通道Ct值≤30并呈现典型的扩增曲线，则判为阳性；否则判为阴性。

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附录A（规范性附录）

溶液配制及检测卡盒装填

A.1洗涤液Ⅰ

称取15.138g三羟甲基氨基甲烷、100g聚乙二醇，加灭菌纯化水定容至1L，混合均匀，0.22μm滤膜

过滤除菌。

A.2洗涤液Ⅱ

称取6.055g三羟甲基氨基甲烷、15g氯化钾、300mL无水乙醇，加灭菌纯化水定容至1L，混合均匀，

0.22μm滤膜过滤除菌。

A.3裂解液

称取486.59g异硫氰酸胍、26.8g无水乙酸钠、60mLTritonX-100、2mL乙酸，加灭菌纯化水定容至

1L，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌。

A.4磁珠

用商品化HEPES缓冲液（1mol/L）将商品化磁珠进行10倍稀释，混合均匀。

A.5检测卡盒装填

图1检测卡盒装填示意图

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附录B（资料性附录）

P72基因序列和内标序列

B.1P72基因序列

5'-ATGGCATCAGGAGGAGCTTTTTGTCTTATTGCTAACGATGGGAAGGCCGACAAGATTATATT

GGCCCAAGACTTGCTGAATAGCAGGATCTCTAACATTAAAAATGTGAACAAAAGTTATGGGAAAC

CCGATCCCGAACCCACTTTGAGTCAAATCGAAGAAACACATTTGGTGCATTTTAATGCGCATTTTA

AGCCTTATGTTCCAGTAGGGTTTGAATACAATAAAGTACGCCCGCATACGGGTACCCCCACCTTGG

GAAACAAGCTTACCTTTGGTATTCCCCAGTACGGAGACTTTTTCCATGATATGGTGGGCCATCATAT

ATTGGGTGCATGTCATTCATCCTGGCAGGATGCTCCGATTCAGGGCACGTCCCAGATGGGGGCCCA

TGGGCAGCTTCAAACGTTTCCTCGCAACGGATATGACTGGGACAACCAAACACCCTTAGAGGGCG

CCGTTTACACGCTTGTAGATCCTTTTGGAAGACCCATTGTACCCGGCACAAAGAATGCGTACCGAA

ACTTGGTTTACTACTGCGAATACCCCGGAGAACGACTTTATGAAAACGTAAGATTCGATGTAAATG

GAAATTCCCTAGACGAATATAGTTCGGATGTCACAACGCTTGTGCGCAAATTTTGCATCCCAGGGG

ATAAAATGACTGGATATAAGCACTTGGTTGGCCAGGAGGTATCGGTGGAGGGAACCAGTGGCCCT

CTCCTATGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGCAAACCTATTCTTACCGATGAAAATG

ATACGCAGCGAACGTGTAGCCATACCAACCCGAAATTTCTTTCACAGCATTTTCCCGAGAACTCTC

ACAATATCCAAACAGCAGGTAAACAAGATATTACTCCTATCACGGACGCAACGTATCTGGACATAA

GACGTAATGTTCATTACAGCTGTAATGGACCTCAAACCCCTAAATACTATCAGCCCCCTCTTGCGCT

CTGGATTAAGTTGCGCTTTTGGTTTAATGAGAACGTGAACCTTGCTATTCCCTCAGTATCCATTCCC

TTCGGCGAGCGCTTTATCACCATAAAGCTTGCATCGCAAAAGGATTTGGTGAATGAATTTCCTGGA

CTTTTTGTACGCCAGTCACGTTTTATAGCTGGACGCCCCAGTAGACGCAATATACGCTTTAAACCAT

GGTTTATCCCAGGAGTCATTAATGAAATCTCGCTCACGAATAATGAACTTTACATCAATAACCTGTT

TGTAACCCCTGAAATACACAACCTTTTTGTAAAACGCGTTCGCTTTTCGCTGATACGTGTCCATAAA

ACGCAGGTGACCCACACCAACAATAACCACCACGATGAAAAACTAATGTCTGCTCTTAAATGGCC

CATTGAATATATGTTTATAGGATTAAAACCTACCTGGAACATCTCCGATCAAAATCCTCATCAACACC

GAGATTGGCACAAGTTCGGACATGTTGTTAACGCCATTATGCAGCCCACTCACCACGCAGAGATAA

GCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCTTCCAGACGCATGTTCATCTATATCTGATATTAGCCCCGTTACG

TATCCGATCACATACCTATTATTAAAAACATTTCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAAT

TTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACCCCCGA

TGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCA

TATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTGGGACACGGATTACGTGGGGTCTATCACT

ACGGCTGATCTTGTGGTATCGGCATCTGCTATTAACTTTCTTCTTCTTCAGAACGGTTCAGCTGTGC

TGCGTTACAGTACCTAA-3'

注1：序列来自GenBank中公布的非洲猪瘟病毒HLJ株（登录号MK333180.1）。

注2：ASFV检测上游引物序列（5’-GCCTTATGTTCCAGTAGGGT-3’）位于195至214bp，ASFV检测

下游引物序列（5’-AGTCTCCGTACTGGGGAATAC-3’）位于278至298bp，ASFV检测探针（5’（-FAM）

AGGTGGGGGTAC