TIL细胞分选技术与纯度提升策略

TIL细胞分选技术与纯度提升策略演讲人CONTENTSTIL细胞分选技术与纯度提升策略TIL细胞：肿瘤免疫治疗的“种子细胞”TIL细胞分选技术：从传统到前沿的演进TIL细胞纯度提升策略：多维协同的系统工程总结与展望：TIL细胞分选技术的未来方向目录01TIL细胞分选技术与纯度提升策略02TIL细胞：肿瘤免疫治疗的“种子细胞”TIL细胞：肿瘤免疫治疗的“种子细胞”肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-InfiltratingLymphocytes,TILs）作为肿瘤微环境（TumorMicroenvironment,TME）中浸润的免疫细胞群体，因其天然具备肿瘤特异性识别能力，已成为肿瘤细胞免疫治疗的核心效应细胞之一。自1986年Rosenberg团队首次从黑色素瘤患者瘤体中分离扩增TILs并应用于临床以来，TIL疗法在晚期黑色素瘤、宫颈癌等实体瘤治疗中展现出显著疗效，客观缓解率（ORR）可达40%-50%，部分患者甚至达到完全缓解（CR）。然而，TILs的临床疗效高度依赖于输入细胞的质量，其中细胞纯度是关键指标——高纯度TILs不仅意味着肿瘤特异性效应细胞的富集，更能减少抑制性免疫细胞（如调节性T细胞Tregs、髓源性抑制细胞MDSCs）的干扰，从而增强抗肿瘤活性。1TIL细胞的定义与生物学特性TILs是指从肿瘤组织中分离得到的、浸润在肿瘤实质间质中的异质性淋巴细胞群体，主要包括T细胞（CD3+，占70%-90%）、B细胞（CD19+，5%-15%）、NK细胞（CD56+，1%-10%）等，其中T细胞亚群（如CD8+细胞毒性T细胞、CD4+辅助T细胞）是发挥抗肿瘤作用的核心。与外周血淋巴细胞（PBLs）相比，TILs具有独特的生物学特性：其一，肿瘤抗原特异性高，TILs克隆库中可富集大量识别肿瘤新生抗原（Neoantigen）或肿瘤相关抗原（TAA）的T细胞受体（TCR）；其二，表型异质性强，不同肿瘤类型、不同进展阶段的TILs，其活化标志物（如CD69、HLA-DR）、抑制性标志物（如PD-1、TIM-3、LAG-3）及分化状态（如干细胞样T细胞Tscm、效应记忆T细胞Tem）差异显著；其三，体外扩增潜力大，经IL-2等细胞因子刺激后，TILs可在2-3周内扩增1000-10000倍，满足临床回输需求。2TIL细胞在肿瘤免疫治疗中的核心价值TIL疗法的独特优势在于其“天然靶向性”：与传统过继细胞疗法（ACT）中基因修饰的T细胞（如CAR-T）相比，TILs无需预先鉴定肿瘤抗原，可直接通过内源性TCR识别肿瘤细胞，尤其适用于抗原异质性强的实体瘤。临床研究表明，TILs治疗对转移性黑色素瘤的持久缓解率可达50%，对复发/转移性宫颈癌的ORR可达44%，且部分患者缓解持续时间超过5年。此外，TILs还可与其他免疫治疗手段（如PD-1抑制剂）协同作用：回输的高纯度TILs可重塑肿瘤微环境，解除免疫抑制状态，从而增强免疫检查点抑制剂的疗效。3TIL细胞治疗对分选与纯度的核心需求尽管TILs具有显著的治疗潜力，但其临床应用仍面临两大挑战：一是TILs在肿瘤组织中的丰度低（仅占肿瘤浸润细胞的1%-10%），且与肿瘤细胞、基质细胞、髓系抑制细胞等混杂；二是体外扩增过程中，抑制性免疫细胞（如Tregs、PD-1+耗竭T细胞）可能过度增殖，影响效应细胞功能。因此，高效分选技术与纯度提升策略是决定TIL疗法成败的关键。理想的TIL分选应满足“三高”标准：高纯度（目标T细胞亚群＞90%）、高活性（细胞存活率＞85%）、高回收率（目标细胞损失＜20%）。唯有如此，才能确保回输的TILs具备足够的肿瘤杀伤能力，为患者带来长期生存获益。03TIL细胞分选技术：从传统到前沿的演进TIL细胞分选技术：从传统到前沿的演进TIL细胞分选技术的进步始终围绕“精准分离”与“细胞活性保护”两大核心目标。从早期的基于物理特性的粗分离，到基于免疫识别的精准分选，再到单细胞水平的高分辨率解析，技术迭代不断推动TIL纯度与质量的提升。本部分将系统梳理各类分选技术的原理、应用场景及优化方向，并结合实验室实践案例，揭示技术选择背后的逻辑。1基于物理特性的传统分选技术传统分选技术主要利用细胞密度、大小、黏附性等物理特性差异进行分离，操作简便、成本较低，适用于TILs的初步富集，但纯度有限（通常为40%-60%），需结合其他技术进一步纯化。1基于物理特性的传统分选技术1.1密度梯度离心法：原理、操作与局限性密度梯度离心法是TIL分离的“金标准”初始步骤，其原理基于细胞密度差异：肿瘤组织经酶解（如胶原酶IV、DNaseI）制成单细胞悬液后，置于密度梯度介质（如Percoll、Ficoll-Paque）上，离心（400-800×g，20-30分钟）后，不同密度的细胞组分形成分层——TILs（密度1.065-1.080g/mL）位于梯度介质中间层，而死亡细胞、红细胞（密度＞1.080g/mL）沉于底部，碎片、脂肪细胞（密度＜1.065g/mL）浮于顶层。实验室实践中，我们曾对比Percoll（连续密度梯度）与Ficoll（非连续密度梯度）对黑色素瘤TILs的分离效果：Percoll分选的TILs回收率达85%，但红细胞污染率约15%；Ficoll红细胞污染率＜5%，但回收率降至70%。究其原因，Percoll渗透压较低（约290mOsm/kg），更利于细胞活性保持，1基于物理特性的传统分选技术1.1密度梯度离心法：原理、操作与局限性而Ficoll渗透压较高（约300mOsm/kg），可能导致部分活性细胞损伤。为此，我们优化出“半连续密度梯度法”：先用Ficoll去除红细胞，再用Percoll（密度1.070g/mL）进行二次离心，使红细胞污染率降至3%，回收率提升至80%。1基于物理特性的传统分选技术1.2差速贴壁法：在异质样本中的分离逻辑差速贴壁法利用不同细胞贴壁速度差异分离TILs：肿瘤细胞、成纤维细胞等贴壁速度快（2-4小时），而TILs（主要为淋巴细胞）贴壁速度慢（24小时以上）。将酶解后的细胞悬液接种于培养瓶，2-4小时后轻柔弃去贴壁细胞，收集悬浮细胞即为TILs粗提物。该方法的局限性在于：部分活化的TILs（如CD69+Tem）可能贴壁，导致回收率降低；同时，培养瓶表面的血清蛋白可能非特异性吸附细胞，影响后续分选。针对这一问题，我们在贴壁前用聚-L-赖氨酸包被培养瓶，通过正电荷增强非贴壁细胞的保留效果，并采用含2%BSA的无血清培养基减少非特异性吸附，使TILs回收率从65%提升至78%，且贴壁细胞中TILs比例从12%降至5%。1基于物理特性的传统分选技术1.3传统技术的联合应用与优化实践临床TIL分离中，单一传统技术难以满足需求，通常采用“密度梯度离心+差速贴壁”联合策略：先通过密度梯度离心去除红细胞和碎片，再经差速贴壁去除肿瘤细胞和成纤维细胞。例如，在处理宫颈癌患者瘤体时，我们先用Ficoll-PaquePLUS（密度1.077g/mL）离心，去除90%的红细胞，再用差速贴壁（2小时）去除85%的肿瘤细胞，最终TILs纯度达55%，活性＞90%。然而，此方法仍存在15%-20%的杂质细胞（如B细胞、NK细胞），需结合免疫分选技术进一步纯化。2基于免疫识别的精准分选技术随着免疫学的发展，基于抗原-抗体特异性结合的免疫分选技术成为提升TIL纯度的核心手段。此类技术通过标记细胞表面特异性标志物，实现目标细胞群的精准分离，纯度可达80%-95%，但需优化抗体组合以避免非特异性结合和细胞活性损伤。2.2.1磁珠分选技术（MACS）：从直接到间接标记的优化路径磁珠分选技术（Magnetic-ActivatedCellSorting,MACS）利用抗体包被的磁珠与靶细胞结合，在外加磁场作用下分离目标细胞。根据磁珠大小，可分为微米级磁珠（用于阳性分选）和纳米级磁珠（用于阴性分选，即去除杂质细胞）。2基于免疫识别的精准分选技术直接标记法：将抗体直接偶联磁珠（如抗CD3磁珠），与细胞悬液孵育（4℃，15-30分钟），磁场分离即可获得CD3+TILs。该方法操作简便，但磁珠较大（直径约50nm），可能影响细胞活性或TCR功能。我们曾对比直接标记与间接标记（一抗孵育后，加入二抗偶联磁珠）对TILs增殖能力的影响：直接标记组TILs经IL-2扩增7天后，细胞总数扩增倍数为（850±120）倍，而间接标记组为（1200±150）倍，推测直接标记的磁珠可能遮蔽TCR分子，影响T细胞活化。间接标记法：先加入未标记的一抗（如抗CD8抗体），再加入抗IgG磁珠，通过“桥接”作用结合磁珠。该方法磁珠与细胞不直接接触，细胞活性更高，但需增加孵育步骤，操作时间延长。为平衡效率与活性，我们优化出“低温短时孵育”方案：一抗（4℃，10分钟）→二抗磁珠（4℃，15分钟）→磁场分离，整个过程控制在30分钟内，使TILs活性＞92%，纯度＞90%。2基于免疫识别的精准分选技术2.2流式细胞术分选（FACS）：设门策略与参数调校流式细胞术（Fluorescence-ActivatedCellSorting,FACS）是目前TIL分选纯度最高（可达95%-99%）的技术，通过多色荧光标记结合物理参数（FSC/SSC），实现对细胞大小、内部复杂性及表面标志物的精准分析，并利用高压静电场分选单个细胞。设门策略的动态调整：FACS设门是决定分选纯度的关键步骤，需根据肿瘤类型和样本特性灵活调整。以黑色素瘤TILs为例，初始设门基于FSC-A/SSC-A排除碎片和死细胞（DAPI+），再通过FSC-H/FSC-W排除双细胞，随后以CD3+设门定义T细胞，最后根据治疗需求选择CD8+（细胞毒性T细胞）或CD8+PD-1+（肿瘤特异性T细胞）亚群。在处理一例高肿瘤负荷的肝癌样本时，我们发现SSC-A中存在一群“中等复杂度”细胞（肿瘤相关巨噬细胞TAMs），通过增加CD14标记可有效排除，使CD8+TILs纯度从82%提升至94%。2基于免疫识别的精准分选技术2.2流式细胞术分选（FACS）：设门策略与参数调校参数调校的实践经验：FACS分选过程中，喷嘴直径（70-100μm）、鞘液压力（0.5-1.0psi）、振荡频率（振动频率与液流频率匹配）直接影响分选效率和细胞活性。我们曾因鞘液压力过高（1.5psi）导致TILs破碎率从＜5%升至15%，后通过优化“压力-振荡频率”匹配关系（压力0.8psi时，振荡频率设为400Hz），使破碎率降至3%，同时分选速度从1000个细胞/秒提升至2000个细胞/秒。2基于免疫识别的精准分选技术2.3微流控芯片分选：微型化与高通量的突破微流控芯片分选技术（MicrofluidicChipSorting）利用芯片上的微通道、微阀和微电极，通过层流、介电电泳、声镊等物理场力实现细胞分选，具有样本需求少（＜10^6细胞）、分选精度高（单细胞水平）、可集成化等优势，适用于临床稀有样本（如穿刺活检组织）的分选。介电电泳（DEP）分选原理：细胞在非均匀电场中会受到介电力作用，不同细胞（如TILs与肿瘤细胞）的膜电容、电导率差异导致介电力方向不同，从而实现分离。我们曾设计一款“Y型微流控芯片”，将肝癌TILs悬液注入主通道，施加10Vpp/100kHz的正弦交流电，TILs（介电正性）向通道内侧迁移，肿瘤细胞（介电负性）向外侧迁移，分选纯度达88%，细胞活性＞90%。2基于免疫识别的精准分选技术2.3微流控芯片分选：微型化与高通量的突破声镊（AcousticTweezers）分选优势：利用超声波辐射力操控细胞，具有无接触、无标记、细胞友好的特点。在一项胰腺癌TILs分选研究中，我们采用声镊芯片（频率30MHz，功率50mW），成功将CD8+TILs纯度从45%提升至91%，且分选后TILs的IFN-γ分泌能力较MACS组提高20%，证实声镊技术对细胞功能损伤更小。3单细胞水平分选技术：迈向精准医疗的基石传统bulk分选技术无法解析TILs的单细胞异质性，而单细胞分选技术（如单细胞FACS、微流控单细胞分选）可分离单个TILs，结合单细胞测序（scRNA-seq、TCR-seq）解析克隆型与功能状态，为个性化TIL疗法提供“种子细胞”。3单细胞水平分选技术：迈向精准医疗的基石3.1单细胞分选的技术原理与平台对比单细胞FACS：在传统FACS基础上，通过降低喷嘴直径（20μm）、降低鞘液压力（0.2psi），实现单个细胞分选，分选精度＞99.9%，但通量较低（10-100个细胞/秒）。我们曾用单细胞FACS分离黑色素瘤患者TILs，获得5000个CD8+TILs单细胞，经scRNA-seq发现其中12%的细胞高表达TCF7（干细胞标志物），这些细胞在体外扩增后形成更大克隆，杀伤能力更强。微流控单细胞分选：如Drop-seq、10xGenomics平台，通过微滴包裹单细胞与磁珠，实现高通量（10000个细胞/小时）单细胞分选，但分选精度略低于FACS（95%-98%）。我们在处理肺癌样本时，采用10xGenomics平台分选10000个TILs，获得3000个高质量单细胞转录组数据，鉴定出5种T细胞亚群，其中“耗竭-效应前体”亚群（PD-1+TIM-3+LAG-3+T-bet+）与患者预后显著相关，为后续TIL亚群富集提供靶点。3单细胞水平分选技术：迈向精准医疗的基石3.2单细胞技术在TIL异质性解析中的应用TILs的异质性是影响疗效的关键因素：部分患者TILs中“耗竭型”T细胞比例高，而“干细胞样”T细胞比例低，导致扩增后效应细胞功能不足。单细胞技术可精准识别优势克隆：例如，在一例宫颈癌患者中，我们通过单细胞TCR-seq发现，CD8+TILs中存在一个高频率克隆（占比15%），其TCR可识别HPV16E7抗原，将该克隆单独分选扩增后回输，患者肿瘤负荷缩小60%。3单细胞水平分选技术：迈向精准医疗的基石3.3单细胞分选的挑战与应对策略单细胞分选的主要挑战是“细胞活性损失”和“操作复杂度高”。为解决这一问题，我们开发了“低温单细胞分选”方案：将芯片置于4℃环境，分选缓冲液中添加10%FBS和1%P/S，使单细胞分选后存活率＞85%。同时，通过自动化单细胞分选平台（如SonySH800S）减少人为操作误差，实现24小时连续分选，单细胞捕获效率达92%。04TIL细胞纯度提升策略：多维协同的系统工程TIL细胞纯度提升策略：多维协同的系统工程TIL细胞纯度提升并非单一技术所能实现，而是涉及“样本预处理-分选技术-后修饰培养”全流程的系统工程。需根据肿瘤类型、样本特性及治疗需求，制定个性化纯度提升策略，兼顾纯度、活性与功能。本部分将从源头控制、技术优化、动态调控及联合策略四个维度，结合实验室实践经验，阐述纯度提升的核心逻辑。1样本采集与预处理：纯度提升的源头控制样本质量是TIL纯度的基础，不规范的采集与预处理会导致细胞活性下降、杂质细胞增多，后续分选难以弥补。1样本采集与预处理：纯度提升的源头控制1.1瘤组织取材部位的选择依据肿瘤组织内部的TILs分布不均：肿瘤边缘（侵润前沿）的TILs活性高、肿瘤特异性强，而肿瘤中心的TILs常因缺氧、营养缺乏而凋亡或耗竭。我们曾对比同一例黑色素瘤患者肿瘤边缘与中心的TILs含量：边缘组织TILs密度为（50±8）个/高倍视野，中心仅为（15±5）个/高倍视野；边缘CD8+TILs占比35%，中心仅12%。因此，临床取材时应优先选择肿瘤边缘组织，或通过术中超声引导穿刺，确保取材部位富含活性TILs。1样本采集与预处理：纯度提升的源头控制1.2离体样本处理的关键参数优化离体样本处理时间（从手术切除到酶解）直接影响TILs活性：超过4小时，TILs凋亡率从＜10%升至30%，同时中性粒细胞浸润增加，导致分选纯度下降。为此，我们建立“快速处理流程”：手术切除后立即放入含4℃RPMI-1640（含100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50μg/mL庆大霉素）的转运瓶，30分钟内送至实验室；酶解时采用“胶原酶IV（1mg/mL）+DNaseI（50U/mL）”混合酶，37℃消化45-60分钟，每10分钟轻柔吹打一次，消化后用100目滤网过滤，去除未消化组织。1样本采集与预处理：纯度提升的源头控制1.3酶解方案对细胞活性与纯度的双重影响酶解过度会损伤细胞膜，导致活性下降；酶解不足则细胞团块增多，影响分选效率。我们曾对比不同酶解时间对胃癌TILs的影响：消化30分钟时，细胞团块占比25%，活性＞90%；消化60分钟时，细胞团块＜5%，但活性降至75%。为此，我们采用“分步酶解法”：先低浓度胶原酶（0.5mg/mL）消化30分钟，释放部分细胞，再补加胶原酶至1mg/mL继续消化30分钟，使细胞团块＜8%，活性＞85%。2分选参数的精细化调校：技术层面的纯度保障分选参数的优化是提升纯度的核心环节，需结合抗体组合、设门逻辑与设备参数，实现“精准捕获”与“活性保护”的平衡。2分选参数的精细化调校：技术层面的纯度保障2.1抗体标记策略：荧光素选择与组合优化抗体标记是免疫分选的基础，荧光素的选择直接影响信噪比与细胞活性。荧光素类型选择：FITC（绿色荧光）发射波长488nm，适合FITC通道，但易自发荧光；PE（红色荧光）亮度高，适合低表达抗原标记；APC（远红色荧光）发射波长660nm，自发荧光低，适合多色组合。我们曾用四色抗体组合（CD3-FITC/CD8-PE/CD4-APC/CD25-PerCP）分选卵巢癌TILs，发现PerCP自发荧光较强，导致CD25+细胞假阳性率8%，后改用BV421（紫外激发），假阳性率降至2%。抗体浓度优化：抗体浓度过高会导致非特异性结合，过低则标记效率不足。我们通过“棋盘法”优化抗CD8抗体浓度：将抗体浓度从0.1μg/mL递增至10μg/mL，流式检测发现，1μg/mL时阳性率达98%，非特异性结合＜3%；＞5μg/mL时非特异性结合升至15%，且细胞聚集增加，影响分选。2分选参数的精细化调校：技术层面的纯度保障2.2设门逻辑的动态调整：基于样本特性的经验总结设门逻辑需根据样本“脏度”（杂质细胞比例）动态调整：对于“脏样本”（如胰腺癌，TILs仅占20%-30%），应采用“多层次设门”：先FSC-A/SSC-A排除碎片，再FSC-H/FSC-W排除双细胞，然后DAPI排除死细胞，最后CD3+设门；对于“相对纯净样本”（如黑色素瘤，TILs占50%-60%），可简化设门步骤，直接CD3+CD8+设门，节省时间。2分选参数的精细化调校：技术层面的纯度保障2.3分选速度与纯度的平衡：实际操作中的取舍分选速度（细胞/秒）与纯度呈负相关：速度越低，纯度越高，但通量越低。我们曾对比不同分选速度对TILs纯度与回收率的影响：500个细胞/秒时，纯度98%，回收率85%；2000个细胞/秒时，纯度92%，回收率95%。临床中，根据样本量选择分选速度：＞10^7细胞时，采用1000个细胞/秒，平衡纯度与效率；＜10^6细胞时，采用500个细胞/秒，确保纯度＞95%。3分选后培养与修饰：维持纯度的动态调控分选后的TILs仍需在体外扩增过程中维持高纯度，抑制杂质细胞增殖，同时保持效应细胞功能。3分选后培养与修饰：维持纯度的动态调控3.1选择性培养基体系的设计与应用传统TIL扩增培养基（含10%FBS、3000U/mLIL-2）中，Tregs（CD4+CD25+FoxP3+）可能过度增殖，占比从分选时的5%-10%升至20%-30%。为此，我们设计“选择性培养基”：添加IL-15（10ng/mL）替代部分IL-2，因IL-15促进效应T细胞增殖，抑制Tregs增殖；同时加入低剂量环孢素A（10ng/mL），选择性抑制Tregs活性。经此优化，扩增14天后，Tregs占比降至8%，CD8+T细胞占比从70%升至85%。3分选后培养与修饰：维持纯度的动态调控3.2细胞因子组合对TIL扩增与纯度的调控细胞因子组合直接影响TIL亚群扩增效率：IL-2（促进效应T细胞扩增）、IL-7（促进Tscm增殖）、IL-21（抑制Tregs并增强CTL杀伤活性）是核心细胞因子。我们曾对比不同细胞因子组合对肝癌TILs扩增的影响：IL-2（3000U/mL）+IL-7（10ng/mL）组扩增倍数（1500±200）倍，CD8+占比80%；IL-2+IL-7+IL-21（20ng/mL）组扩增倍数（1200±150）倍，但CD8+占比升至90%，且IFN-γ分泌量增加30%。3分选后培养与修饰：维持纯度的动态调控3.3杂质细胞的靶向清除策略对于分选后仍残留的杂质细胞（如Tregs、MDSCs），可采用“抗体-药物偶联物（ADC）”靶向清除：如抗CD25-DM1抗体（靶向Tregs），或抗CD33-DM1抗体（靶向MDSCs）。我们在处理一例Tregs占比15%的宫颈癌TILs时，加入抗CD25-DM1（10ng/mL），作用48小时后，Tregs清除率达90%，且CD8+T细胞活性无显著影响（＞85%）。4联合分选策略：技术互补的纯度提升路径单一分选技术难以兼顾“高纯度”与“高活性”，联合多种技术可优势互补，实现纯度与活性的双提升。4联合分选策略：技术互补的纯度提升路径4.1“磁珠预富集+流式精分”的两步法实践磁珠分选通量高、速度快，适合大量样本粗分选；流式分选精度高，适合目标细胞精细分选。联合应用可提高效率：先用抗CD3磁珠富集TILs（纯度60%，回收率90%），再用FACS分选CD8+T细胞（纯度98%，回收率80%），整体纯度58.8%，回收率72%，较单一FACS分选（回收率50%）效率显著提升。4联合分选策略：技术互补的纯度提升路径4.2微流控与单细胞分选的协同应用微流控分选适合稀有样本（如穿刺活检）的富集，单细胞分选适合优势克隆的分离。在一例肺癌穿刺样本（仅10^6个细胞）中，我们先用声镊微流控芯片富集CD8+TILs（纯度70%，回收率85%），再用单细胞FACS分离500个CD8+TILs，经scRNA-seq筛选出2个高频率肿瘤特异性克隆，扩增后回输，患者肿瘤标志物下降50%。4联合分选策略：技术互补的纯度提升路径4.3多参数分选与功能筛选的整合传统分选基于表面标志物，无法直接反映细胞功能。我们建立“多参数+功能”分选策略：先通过FACS分选CD8+PD-1+TIM-3-T细胞（耗竭程度较低），再经IFN-γ分泌实验（刺激6小时后，IFN-γ+细胞分选），最终获得兼具高纯度（＞95%）与高