【《鸡球虫与鸡球虫病的研究国内外文献综述》7200字】

鸡球虫与鸡球虫病的研究国内外文献综述目录TOC\o"1-3"\h\u21588鸡球虫与鸡球虫病的研究国内外文献综述 1104711.1鸡球虫的寄生部位及其致病性 262641.2鸡球虫的生活史 253411.3鸡球虫病的流行病学 2178131.4鸡球虫病的诊断 3276851.4.1传统方法 338361.4.2血清学诊断 4247881.4.3分子生物学诊断 46151.5鸡球虫病的防治 7178641.5.1药物防治 7314941.5.2疫苗防治 7138471.5.3饲养管理 710674参考文献 8鸡球虫病是由一种或多种艾美耳球虫（Eimeriaspp.）寄生于鸡肠上皮细胞引起的以肠道病变和损伤为特征的寄生虫病，其临床症状因球虫种类及数量的不同可表现为亚临床感染、腹泻甚至高致死率的急性出血性肠炎（DalloulandLillehoj2006）。该病在饲养家禽的地方普遍发生且常呈混合感染，每年对全球养禽业造成的经济损失超过30亿美元，严重影响行业的健康发展（BlakeandTomley2014；Williams1999）。临床上对鸡球虫病的防控主要依靠疫苗和抗球虫药物的使用，但随着耐药性和药物残留问题的日益突出，疫苗预防似乎是一种更具有发展前景的控制策略，但现有疫苗的使用受限于成本、效价及安全性问题（Olejniketal.2019；VenkatasandAdeleke2019；Lanetal.2017；ChapmanandJeffers2014；PeekandLandman2011；）。目前，世界公认的鸡艾美耳球虫共有7种，分别为柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）、堆形艾美耳球虫（E.acervulina）、布氏艾美耳球虫（E.brunetti）、早熟艾美耳球虫（E.praecox）、和缓艾美耳球虫（E.mitis）、巨型艾美耳球虫（E.maxima）和毒害艾美耳球虫（E.necatrix）（汪明2003）。不同鸡球虫种类在致病性、耐药性和危害程度等方面存在差异，虫种的准确鉴定不仅在鸡球虫病的临床诊断和控制中至关重要，在流行病学调查、耐药性研究和新疫苗研制等方面也具有重要意义（Lanetal.2017）。1.1鸡球虫的寄生部位及其致病性鸡球虫具有很强的寄生部位特异性，E.tenella主要寄生在盲肠及其附近，致病性最强；E.necatrix在其裂殖生殖阶段主要寄生在小肠中三分之一段，严重时可扩展至整个小肠，配子生殖阶段寄生在盲肠，致病性仅次于E.tenella；E.brunetti寄生于小肠后部、盲肠近端和直肠，致病性较强；E.acervulina主要寄生于十二指肠和空肠，致病性较强；E.maxima寄生于小肠中段，有中等程度致病性；E.mitis寄生于小肠前半段，致病性较轻；E.praecox寄生于小肠前三分之一，致病性不强（汪明2003）。1.2鸡球虫的生活史鸡球虫为通过粪--口途径传播的单宿主寄生虫，其生活史包括在宿主体内的裂殖生殖和配子生殖以及在外部环境中的孢子生殖。鸡从被污染的食物或饮水中摄取孢子化卵囊，这些卵囊进入胃肠道，在二氧化碳、消化酶和机械摩擦的作用下发生脱囊，子孢子逸出迁移至特定位置侵入肠上皮细胞进行裂殖生殖并形成裂殖体。裂殖体破裂后逸出大量裂殖子并侵入肠上皮细胞开始新一轮的裂殖生殖。这一阶段会对宿主造成严重的损害，并且常继发产气荚膜梭菌、大肠杆菌等其它病原的感染，加重病情，是球虫致病性和致死率最高的阶段。经过2～3代裂殖生殖后，裂殖子发育为大、小配子体，大、小配子结合形成合子并发育为卵囊。卵囊随粪便排出体外，在有氧且环境温度、湿度适宜的条件下经过1～2d发育为具有感染性的孢子化卵囊，卵囊内含有4个孢子囊，孢子囊内有2个子孢子，至此完成整个生活史（Burrelletal.2020；López-Osorioetal.2020；Suetal.2018；Novaesetal.2012；Jeurissenetal.1996；龙航宇等2020；尧国荣等2020；和潇等2010）。1.3鸡球虫病的流行病学鸡球虫具有严格的宿主特异性，鸡是其唯一宿主，受感染患病及带虫的鸡为传染源，鸡主要由于摄入被卵囊污染的水和食物而感染。E.necatrix引起的小肠球虫病多发生于8～18周龄的育成鸡，其发生明显晚于其它鸡球虫（Mattielloetal.2000；李武尧2012）。有报道指出，毒害艾美耳球虫病早期发生较少可能是由于E.necatrix繁殖能力较低，且在混合感染时易受其它虫种的竞争性抑制（董辉和索勋2002；李建梅2011）；而后期由于鸡逐渐产生了对其它虫种的免疫力，E.necatrix在宿主体内受到的抑制减轻从而大量繁殖，导致环境中的卵囊数越来越多，鸡摄入过多E.necatrix卵囊就易暴发小肠球虫病（刘梅等2013）。近年来，鸡的饲养周期延长，使得临床上更易发生毒害艾美耳球虫病，其原因有两点：一是随着人们对鸡肉风味要求的提高，养殖户更愿意饲养生长速度较慢但肉质更好的地方品种鸡；二是由于政府和消费者对食品安全的关注，为了减少药物残留养殖户会延长鸡出笼的时间（刘梅等2011）。另外，饲养管理、气候环境、球虫耐药性和鸡只自身情况等因素也会影响球虫病的流行（李超等2018）。7种鸡球虫呈全球性分布，不同地域不同鸡舍感染球虫的优势种类和感染强度存在明显差异，且多为混合感染。鸡球虫在我国各地均有分布，感染率在50%以上，而E.necatrix是华中、华东、华南，西南地区的优势虫种之一（李超等2018）。河南和湖北作为我国的家禽生产大省，鸡球虫感染率为97.17%，E.necatrix感染率高达41.51%（Gengetal.2021）。而浙江省肉鸡养殖场粪样中鸡球虫总感染率为30.7%，阳性样本中以E.tenella（30.5%）最多，其次为E.acervuline（24.2%）、E.maxima（21.1%）、E.necatrix（14.7%）和E.mitis（9.5%）（Lanetal.2017）。1.4鸡球虫病的诊断1.4.1传统方法传统方法一般根据临床症状、肠道病变、寄生部位、致病性和卵囊形态等指标来诊断鸡球虫病（李建梅等2009；JoynerandLong1974）。鸡感染不同种类的球虫往往出现不同的临床症状和肠道病变，如感染高致病性的E.tenella或E.necatrix会出现精神沉郁、翅膀下垂、食欲减退、腹泻、排血便甚至死亡，死后剖检可见被寄生部位的肠段高度肿大，呈深红色，浆膜层出现针尖大小的白色坏死点或大小不一的出血点，剪开肠道可见大量血凝块、粘液和坏死的肠黏膜，肠壁变薄；而感染E.mitis和E.praecox则主要表现为吸收不良、增重和饲料转化率降低，肠道病变也较轻（李武尧2012；汪明2003）。临床上，单个宿主常感染多种鸡球虫，从而导致肠道中寄生部位的重叠以及病变范围的变化；而同种球虫的不同虫株在致病性方面往往也存在差异，不能单独作为判断种类的依据（Shirley1985）。临床常用直接涂片法或饱和盐水漂浮法检查粪便样品中的卵囊来判断是否存在球虫感染，利用麦克马斯特氏法（MacMaster′smethod）得到每克粪便卵囊数（Oocystspergramoffeces，OPG）还能一定程度反映球虫的感染强度（汪明2003）。但若想通过卵囊形态鉴别鸡球虫种类，除了E.maxima有较大的淡黄色卵囊易于区分外，其它鸡球虫卵囊无极冒，无明显的卵孔，卵囊壁的结构和质地相似，孢子囊的形状和大小也无明显区别，因此鉴别有一定难度且需要专业人员（LongandJoyner1984）。1.4.2血清学诊断目前有很多用于检测鸡球虫病的血清学方法，如中和试验、琼脂免疫扩散法、子孢子和裂殖子溶解试验、子孢子制动反应、间接荧光抗体法和酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）等（Davisetal.1978）。Saatara等（1984）利用ELISA和间接血凝法（Indirecthemagglutilation，IHA）测定实验感染鸡对柔嫩艾美耳球虫的抗体反应，ELISA技术相对容易操作，比IHA检测更敏感，而且只需要IHA所需抗原的一小部分。Uchida等（1994）用卵囊制备的可溶性抗原进行ELISA发现，3种球虫（E.tenella、E.necatrix、E.acervulina）免疫鸡血清之间存在交叉反应，其中E.tenella和E.necatrix之间的交叉反应更为明显。利用免疫印迹法检测E.tenella卵囊抗原，同源抗血清检测出7条主条带，E.necatrix和E.acervulina抗血清分别检测出10条和6条主条带。1.4.3分子生物学诊断同工酶分析早期Shirley（1975）利用同工酶分析，发现6种艾美耳球虫（E.brunetti、E.tenella、E.acervulina、E.maxima、E.praecox、E.necatrix）的乳酸脱氢酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的淀粉凝胶电泳存在种内和种间差异，可以作为鉴别鸡球虫种类的指标，但由于试验分析需要大量的卵囊和复杂的操作，此方法的临床应用受到了一定程度的限制。限制性片段长度多态性分析（Restrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis，RFLP）Ellis和Bumstead（1990）首次将印迹分析（Southernblot）结合RFLP应用于鸡球虫鉴定，成功区分E.tenella、E.acervulina和E.necatrix等三种球虫。后来Woods等（2000）在变性凝胶上对第二内转录间隔区（Internaltranscribedspacer2，ITS-2）的扩增产物进行RFLP分析，制出了单个物种的特征图谱，成功对澳大利亚的6种鸡球虫种类（除了E.mitis）进行了鉴定，同时也证明ITS-2是具有实用性的遗传标记。随机扩增多态性DNA（RandomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD）Macpherson和Gajadhar（1993）首次利用RAPD技术成功鉴别来自不同宿主的7种艾美耳球虫，其中一种来自于鸡（E.tenella）。刘群等（2000）分析了国内4种鸡球虫和多个虫株间的RAPD多态性，发现RAPD技术可以用于鸡球虫种类鉴定，并且可用来筛选区分不同虫株的分子标记。RAPD的引物序列是任意的，不需要事先了解基因组序列，还可以用于筛选序列特征扩增区（Sequencecharacterizedamplifiedregion，SCAR），该区域可以作为物种特异性或虫株特异性遗传标记。虽然RAPD在球虫种内和种间鉴定都取得到了广泛应用，但是RAPD重复性较差，并且由于在电泳时多个序列可能隐藏在共迁移带中，这种技术不适用于混合感染的检测（MorrisandGasser2006）。PCR随着不同分子标记的发现和各种PCR技术的发展，PCR在鸡球虫的鉴别诊断和系统发育分析方面发挥着举足轻重的作用。Stucki等（1993）基于E.tenella的5S核糖体DNA（5SribosomalDNA，5SrDNA），利用反向PCR技术扩增出特异性条带，证明核糖体RNA（RibosomalRNA，rRNA）基因可以用来鉴别球虫种类。Tsuji等（1997）结合PCR和RAPD技术，扩增出8种鸡球虫的小亚单位核糖体RNA（SmallsubunitrRNA，SSUrRNA）基因，发现有8条RAPD引物可用于种类的鉴定，建立了两步法聚合酶链反应成功鉴别8种鸡球虫（当时认为E.hagani也是一种鸡球虫）。Ogedengbe等（2011）比较了球虫部分线粒体细胞色素C氧化酶亚基（cytochromecoxidasesubunitI，COI）和接近完整的18SrDNA序列，将COI基因作为DNA条形码标记，建立了更可靠的用于球虫物种鉴定和系统发育分析的DNA条形码技术。Fernandez等（2003a，b）筛选出能够有效区分7种鸡球虫的RAPD引物，转换为种特异性SCAR标记后建立了能够同时检测7种鸡球虫的多重PCR方法。Vrba等（2010）基于SCAR标记的唯一单拷贝序列建立了可以定量检测7种鸡球虫的定量PCR（Quantitativepolymerasechainreaction，qPCR），能够检测到相当于单个孢子化卵囊的DNA量。Peek等（2017）将Vrba等（2010）的方法合并为3种多重qPCR方法，同时改变了提取方法以便能够直接分析新鲜粪便。研究显示，尽管鸡球虫rDNA本身较为保守，但是内转录间隔区（Internaltranscribedspacer，ITS）在虫种之间的长度和序列相对异质，因此可以作为良好的分子标记（王鑫等2009；夏延富2009；夏延富等2009；薛方民2007）。Schnitzler等（1998）基于4种鸡球虫的第一内转录间隔区（Internaltranscribedspacer1，ITS-1）序列设计了种特异性引物，建立的PCR方法仅需约25个卵囊便能检测出球虫。Lew等（2003）针对ITS-1序列用巢氏PCR来鉴定鸡球虫，You（2014）建立了可同时检测4种鸡球虫的多重PCR方法，检测阈为1～4pg；辛玲等（2008）针对ITS-1序列建立了3种鸡球虫的单轮PCR和多重PCR方法，最小检出量为0.5ng，范现成等（2019）在此基础上建立了E.tenella和E.maxima双重PCR检测方法。Gasser等（2001；2005）对7种鸡球虫ITS-2基因进行PCR扩增，分别利用基于荧光标记的自动化电泳法和毛细管电泳法进行电泳，筛选出色谱图上特异的色谱峰用于虫种鉴定，在鸡球虫混合感染时同样适用。Morgan等（2009）针对鸡球虫ITS-2序列，使用TaqManMGB技术和种特异性探针建立定量PCR（Quantitativepolymerasechainreaction，qPCR）方法，实现了对7种鸡球虫的特异性检测和定量。环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）LAMP是一种简单、快速且相对便宜的诊断工具。Barkway等（2011）开发了一套针对7种鸡球虫的种特异性LAMP检测方法，能够检测到1到10个艾美耳球虫卵囊的基因组，相当于不到一个成熟裂殖体的基因量。纳米PCR纳米PCR（Nanoparticle-assistedPCR，nano-PCR）是结合纳米技术与分子生物学的一种新型PCR方法，体系中的纳米粒子在反应中发挥着重要作用（Alietal.2018）。首先，某些纳米粒子具有良好的导热性，可以提高体系加热和冷却的速率。Li等（2005a）发现金纳米粒子优异的传热性能可以明显使普通PCR的灵敏度提高5~10倍，使实时荧光PCR的灵敏度提高104倍；还有研究者发现25nm的TiO2纳米粒子能够通过自身良好的导热性提高反应缓冲液的热导率来增强PCR效率，有助于大幅减少PCR反应周期，并增强DNA扩增（包括难以扩增的GC含量高的DNA模板）（AbdulKhaliqetal.2010）。其次，纳米粒子还能发挥与单链结合蛋白（Singlestrandbindingprotein，SSB）类似的作用，显著降低引物和模板的错配从而提高特异性。Li等（2005b）发现金纳米粒子能够提高PCR反应的特异性并推测可能和金纳米粒子发挥的类似SSB的机制有关，其增强效果甚至超过市面上可用的SSB；而氧化石墨烯（Grapheneoxide，GO）能够通过促进匹配的引物-模板复合物的形成，抑制错配引物的扩增来增强PCR反应的特异性（Wang2017）。另外，在PCR体系中，纳米粒子还能够吸附DNA聚合酶、Mg2+、寡核苷酸引物或DNA模板，使PCR反应物聚集，提高反应效率（Baietal.2015）。纳米粒子的这些作用，使得纳米PCR相较于普通PCR具有更高的敏感性和特异性，在病原检测方面的应用日趋广泛。纳米PCR近年来开始应用于不同寄生性原虫的检测，Gabriel等（2018）使用氧化石墨烯、氧化铜、氧化铝纳米颗粒和属特异性探针，建立了快速检测食脑性阿米巴原虫（Acanthamoebaspp.，Balamuthiamandrillaris，Naegleriafowleri）的纳米PCR方法并优化得到了针对不同食脑性阿米巴原虫的最佳纳米粒子用量。Upadhyay等（2020）发现在检测犬巴贝斯虫（Babesiacanisvogeli）和犬肝簇虫（Hepatozooncanis）的PCR体系中加入氧化锌纳米絮凝剂能够显著增强PCR检测灵敏度，同时在不影响DNA扩增产量的情况下，减少了约45%～50%的反应时间。目前尚未有利用纳米PCR特异性检测鸡球虫的相关报道。1.5鸡球虫病的防治1.5.1药物防治预防和治疗性使用抗球虫药物促进了现代家禽业的快速发展，这些抗球虫药物可分为两类，一是化学合成药物，如地克珠利、磺胺间甲氧嘧啶/甲氧苄啶、磺胺氯吡嗪、氨丙啉、尼卡巴嗪和氯羟吡啶等；二是聚醚类离子载体抗生素，如莫能菌素、那拉霉素、盐霉素和马杜霉素等。此外，还有众多具有抗球虫活性的天然产物如青蒿、白芨、常山、常青克球灵、球克星等中草药方剂和从百里香、丁香、牛至和柑橘等提取的植物精油（Gordilloetal.2021；Quiroz-CastañedaandDantán-GonzálezE2015；毕菲菲等2018）。天然抗球虫产物一定程度上缓解了球虫耐药性和药物残留的问题，但是由于作用效果有限，生产上仍需要更高效的药物替代品。1.5.2疫苗防治由于鸡球虫具有高度的免疫原性，疫苗预防似乎可以作为一种替代抗球虫药物控制鸡球虫病的良好方法（Shirleyetal.2005）。最早的商品化球虫疫苗是美国于1951年研发的CocciVac®-D强毒活卵囊疫苗，而我国在2000年首次批准了鸡球虫病三价弱毒活疫苗（McDonaldandShirley2019）。除了活疫苗，以色列研究人员还利用配子体灭活抗原成功研制出了首个亚单位疫苗CoxAbic®（廖申权等2020）。其他国家如英国、加拿大、捷克等也在进行球虫疫苗的生产。1.5.3饲养管理鸡球虫卵囊在环境中能抵抗极端气候和消毒剂，可在土壤中存活数周或数月，但在暴露于发酵产生的热量和/或粪便产生的氨时，它们在粪便中可能只能存活数天（Williams1995）。对于养殖环境的管理，一是保持良好的卫生，如来往于鸡舍之间要换衣服和清洁鞋子；二是防治鼠害，以最大限度地减少卵囊的传播；三是及时检修圈舍器材，如使用无滴漏的水管可以最大限度地减少环境中感染性卵囊的数量，因为干燥可以大大降低卵囊的孢子化率（MorrisandGasser2006）。在集约化饲养条件下，及时清除粪便、垃圾，做好严格的生物安全措施也可以最大限度地减少感染性卵囊的传播，避免大规模球虫病的暴发（AllenandFetterer2002）。参考文献毕菲菲,郝振凯,孙霈,于咏兰,索勋,刘贤勇.2018.鸡球虫病防治药物及抗药性研究.寄生虫与医学昆虫学报,25(4):242-253董辉,索勋.2002.毒害艾美耳球虫的致病性研究.寄生虫与医学昆虫学报,9(3):129-135杜彩娟.2016.毒害艾美耳球虫子孢子cDNA文库的构建与筛选.[硕士学位论文].扬州:扬州大学范现成,马峋,张会军,唐欢,宋军科,赵光辉.2019.鸡柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法的建立.动物医学进展,40(2):17-21和潇,周宏生,杨再旭,和平.2010.鸡急性小肠球虫病诊断与药物试验.养殖与饲料,(12):16-17李超,顾小龙,卢春霞,廖琴,刘贤勇,索勋.2018.我国鸡球虫病流行病学研究进展.寄生虫与医学昆虫学报,25(4):230-241李佳暖,李得鑫,崔元,袁万哲,孙继国.2018.牛病毒性腹泻高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用.中国兽医学报,38(2):252-254李建梅,刘丹丹,任春芝,许金俊,陶建平.2009.和缓艾美球虫与早熟艾美球虫的分离与鉴定.中国动物传染病学报,17(4):57-60李建梅.2011.四种鸡艾美球虫ITS区序列分析及毒害与巨型或柔嫩艾美球虫间在免疫上相互影响的研究.[硕士学位论文].扬州:扬州大学李武尧.2012.育成期蛋鸡暴发小肠球虫病的诊断与治疗.养禽与禽病防治,(5):21-22廖申权,戚南山,吕敏娜,吴彩艳,李娟,蔡海明,林栩慧,胡俊菁,于林增,张健騑,谢明权,孙铭飞.2020.鸡球虫病流行病学、防治药物与疫苗研究进展.广东农业科学,47(11):171-181刘国昌,林瑞庆,严浩,胡钱江,刘丽丹,翁亚彪.2013.5株堆型艾美耳球虫顶质体rpoB基因的扩增及序列分析.河南农业科学,42(2):145-148刘梅,李建梅,刘丹丹,王尚尚,沈欣悦,程旭,刘加圣,戴亚斌,陶建平.2011.一毒害艾美耳球虫田间分离株耐药性分析.中国家禽,33(24):30-35刘梅,刘丹丹,李建梅,王尚尚,程旭,沈欣悦,戴亚斌,陶建平.2013.不同日龄鸡对毒害艾美耳球虫的易感性研究.畜牧与兽医,45(10):13-16龙航宇,吕梦娜,郭宸旭,尹乐子,林瑞庆.2020.鸡4种艾美耳球虫单一虫种与产气荚膜梭菌共感染对鸡生产性能的影响.中国兽医杂志,56(9):30-33秦彤,周灵,由欣月,梁琳,史利军,张建伟,李金祥,崔尚金.2019.犬细小病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用.畜牧兽医学报,50(6):1268-1274汪明.2006.兽医寄生虫学(第3版).北京:中国农业出版社王鑫,韩红玉,姜连连,赵其平,董辉,韩静芳,黄兵.2009.鸡球虫18SrRNA基因序列的测定与分析.生物技术通报,(S1):305-309王鑫.2007.鸡艾美耳球虫纯株的建立与DNA条形编码初探.[硕士学位论文].北京:中国农业科学院夏延富,陈兆国,陈铁桥,米荣升,薛方民.2009.鸡六种艾美耳球虫ITS-1的克隆和序列分析.中国家禽,31(13):24-27夏延富.2009.鸡球虫不同种株的ITS序列及RAPD分析.[硕士学位论文].长沙:湖南农业大学谢雯琴.2010.鸡球虫线粒体、顶质体基因多态性及线粒体全基因组研究.[硕士学位论文].长沙:湖南农业大学辛玲,许金俊,陶建平.2008.多重PCR检测3种鸡球虫方法的建立.中国兽医杂志,44(3):6-8薛方民.2007.鸡艾美耳球虫不同种株ITS-1、ITS-2序列的克隆和分析比较.[硕士学位论文].济南:山东师范大学尧国荣,张辉,曾作财,方霞.2020.1例地方麻鸡球虫病继发大肠杆菌病的诊治.养禽与禽病防治,(2):46-47张曼.2010.牛乳中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌多重PCR检测方法的建立及应用.[硕士学位论文].杨凌:西北农林科技大学郑丽,任卫科,路超,田向学,王利丽,李秀丽,鄢明华.2018.禽呼肠孤病毒纳米PCR检测方法的建立与应用.中国兽医科学,48(6):700-706AlexaA,RahnenfuhrerJ.2010.topGO:enrichmentanalysisforgeneontology.Rpackageversion2.8/packages/2.11/bioc/html/topGO.htmlAbdulKhaliqR,SonawanePJ,SasiBK,SahuBS,PradeepT,DasSK,MahapatraNR.2010.EnhancementintheefficiencyofpolymerasechainreactionbyTiO2nanoparticles:crucialrole