DB54T 0562-2026 牦牛片形吸虫病防控技术规程

ICS 65.020.3054CCSB4354西 藏 自 治 区 地 方 标 准DB54/T0562—2026牦牛片形吸虫病防控技术规程2026-1-4发布 2026-2-4实施西藏自治区市场监督管理局  发布DB54/T0562DB54/T0562—2026PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前 言 II范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1诊断 1实验室诊断 2防控 2治疗 3附 录 A （资料性）片形吸虫虫卵形态及感染牦牛肝脏 4附 录 B （规范性）实验室检测方法 5前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由西藏自治区农业农村标准化技术委员会提出并归口。本文件起草单位：西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所、佛山大学。本文件主要起草人：唐文强、黄福强、赵霞玲、石斌、马弘财、韩海玉、何小国、任晓丽。DB54/T0562DB54/T0562—2026PAGEPAGE1牦牛片形吸虫病防控技术规程范围本文件规定了牦牛片形吸虫病的临床诊断、实验室诊断、防控和治疗等技术要求。本文件适用于牦牛片形吸虫病的诊断、预防和治疗。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。《中华人民共和国兽药典》（2020版）NY/T1950-2010片形吸虫病诊断技术规范GB19489-2008实验室生物安全通用要求术语和定义下列术语和定义适用于本文件。片形吸虫片形吸虫病聚合酶链式反应（PCR）一种在体外扩增DNA片段的方法。当存在模板DNA、底物、上下游引物和耐热的DNA聚合酶时，经过多次“变性-退火-延伸”反应，模板可扩增至数百万倍。诊断流行病学临床症状急性期慢性期病理变化急性病例比较少见，主要变化为可视黏膜苍白，剖检可见腹腔中充满血水，含幼小虫体；肝脏肿大和充血，呈急性肝炎病变。慢性病例实验室诊断样本采集病原学检查粪便虫卵检查检测粪便中的片形吸虫虫卵，见附录A的图A.1和附录B的B.1。肝脏虫体检查剖检肝脏查看片形吸虫虫体，见附录A的图A.2和附录B的B.2。分子生物学（PCR）检查取新鲜粪便进行聚合酶链式反应，扩增出特异性目的片段，只出现约250bp的特异性条带为肝片吸虫，只出现约500bp的特异性条带为大片吸虫，同时出现约250bp和500bp条带为“中间型”片形吸虫，见附录B的B.3。防控预防性驱虫驱虫时间每年春、冬两季定期驱虫，牛群发病可随时驱虫。驱虫药物选择驱虫药多使用高效、低毒且能驱杀各发育阶段虫体的药物，推荐使用三氯苯达唑。驱虫方法防控中间宿主结合草原或农田基本建设、兴修水利和填补与改造低洼沼泽地带等措施，控制椎实螺生存的环境。具备条件的，可用饲养的水禽、鸭、鹅等生物方法灭螺。粪便无害化处理加强饲养卫生管理治疗附 录 A（资料性）片形吸虫虫卵形态及感染牦牛肝脏图A.1片形吸虫虫卵 图A.2感染片形吸虫牦牛肝脏附 录 B（规范性）粪便虫卵检查（水洗沉淀法）材料200mL玻璃杯，60目网筛，玻璃棒，镊子，胶帽吸管，载玻片和盖玻片，天平，显微镜。方法取新鲜粪便10g放入玻璃杯中，先加10mL水搅成糊状，然后再继续加水20倍。经充分混合后，用60目网筛3010（不加盖玻片，用低倍显微镜检查），统计全部虫卵数。结果判定116m～13m×6μ～8μm150μm～190μm×75μm～90μm。由于西藏地区存在中间型片形吸虫，因此无法通过虫卵形态区别出所检PCR（按B.3进行进行（genus别端，而同盘吸虫的胚细胞在虫卵中部偏后。肝脏虫体检查材料解剖刀，组织剪，挑虫针，无齿镊，搪瓷盆，搪瓷盘，搪瓷缸，大平皿，载玻片。虫体采集a）按一般剖检术式摘出肝脏，再剪断胆管与十二指肠连接部位，要注意观察断端有无虫体流出。b）将肝脏放搪瓷盘中。首先分离胆囊，单放在大平皿中，剪开囊壁，将胆汁用清水稀释，等自然沿肝脏的大胆管及其分支剪开，如发现虫体取出放在盛有清水的平皿中。再沿着与胆管垂直的方向将肝组织切成数大块，注意断面有无虫体或病灶。用手压挤，看是否有虫体被压出。将肝块浸入盛有多量水的搪瓷盆中，用手撕成小块，再挤每个小肝块，洗净后取出。向搪瓷盆内再加些水进行反复水洗沉淀，检查沉淀物，用无齿镊挑出虫体。挑出的虫体用生理盐水洗净，再放在常温自来水中使虫体松弛。有些虫体的肠管内含有大量食物，可在生理盐水中放置过夜，待其食物消化或排出。虫体固定虫体染色标本制作步骤（硼砂卡红染色）体色 保于70酒内标直取投硼卡4硼NaBO)液100L，加入卡红染粉1g，加热使其溶解，再加入70％酒精100mL，放冷，过滤，滤液即为硼砂卡红染液）染色液中染色。保存于福尔马林液内的虫体标本，应先取出水洗1～2h，尔后循序通过30％，50％，70％的酒精各0.5～1h，再投入染液中，在染液中过夜，使虫体染成深红色。虫体脱色 自染液中取出虫体放入1%酸酒精中褪（1%酸酒精是以70％酒精99mL加浓盐酸1mL，根据情况也可以使用2%或3%的酸酒精），使颜色深浅分明，即虫体外层呈淡红色，内部构造呈深红色。虫体脱水 将脱色好的虫体移入80%，95％和100%酒（2次中各0.5～1h（如果脱水不充分制作出的标本会有一层雾状膜，原因就是浸泡时间不够或最后一步就酒精使用过程中已不是无水酒精，建议更换新的无水酒精）虫体透明将虫体先经1:1的100%酒精和二甲苯混合液中透明30min，再取出放入纯二甲苯中，虫体封片已透明的虫体，移至载玻片上，加适量滴加拿大树胶，加盖玻片封固，封固时切忌留有气泡在内，待干后放入标本盒内。结果判定表B.1肝片形吸虫与大片形吸虫成虫的形态鉴别鉴别要点肝片吸虫大片吸虫体形较狭长，有明显的肩部，末端较尖呈“V”形狭长，肩不明显，两侧平，末端钝圆呈“U”形大小21～41mm×9～14mm25～75mm×5～12mm体长：体宽2:1～3:1左右3:1以上吸盘腹吸盘稍大于口吸盘腹吸盘约为口吸盘的1.5倍肠管内侧支分支少内侧支分支复杂睾丸分支区域约占虫体的2/3分支区域约占虫体的1/2PCR试剂粪便基因组DNA提取试剂盒，TaqPCRMix（2X,含蓝染料），1.5%琼脂糖凝胶，50×TAE电DL2000NAMarerDN10n/μ，条引物序列及配置的母液浓度见表B.2。表B.2引物序列及浓度引物名称引物序列母液浓度（μM）Fh-pepck-F5’-GATTGCACCGTTAGGTTAGC-3’100Fg-pepck-F5’-AAAGTTTCTATCCCGAACGAAG-3’100Fcmn-pepck-R5’-CGAAAATTATGGCATCAATGGG-3’100耗材离心管（15mL、50mL、1.5mL），药匙，称量纸，0.2mL薄壁PCR管，500mL量筒，500mL锥形瓶，枪头（10μL、200μL、1000μL），记号笔。仪器设备分析天平，PCR扩增仪，台式低温高速离心机，水平电泳仪，紫外凝胶成像系统，可调移液器（2μL、20μL、200μL、1000μL），恒温水浴锅或金属浴。实验步骤牦牛粪便样品采集和处理采集待检测牦牛200mg左右的粪便，放入一个1.5mL离心管中，供PCR检查用，每头牦牛采的粪便样品不少于2管；采集的样品宜当天处理和检测，若不能当天检测，应暂时放于冰箱冷冻室-20℃保存，若需长期保存，应放置于-80℃超低温冰箱；使用粪便基因组DNA提取试剂盒提取粪便样品中的全基因组；提取好的全基因组置于4℃保存，若不能当天检测，应放于冰箱冷冻室-20℃保存。PCR反应体系：30μL，体系组成见表B.3。设置至少两个平行样品，设立阴性、阳性及空白提取对照。表B.3PCR扩增反应体系试剂名称用量（μL）TaqPCRMix预混液（2X,含蓝染料）15Fh-pepck-F3Fg-pepck-F3Fcmn-pepck-R3DNA模版2ddH2O补足至30PCR扩增条件：95℃预变性90s；95℃变性30s，61℃复性30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR用TAE电泳缓冲液配制成1.5%琼脂凝胶。将琼脂凝胶放入电泳槽中