基于冷冻电镜的重组抗原构象优化策略

基于冷冻电镜的重组抗原构象优化策略演讲人01基于冷冻电镜的重组抗原构象优化策略02引言：重组抗原构象优化的必要性与冷冻电镜的突破性价值03冷冻电镜技术解析重组抗原构象的优势与核心流程04基于冷冻电镜解析的重组抗原构象优化策略05优化策略的验证与迭代：从结构到功能的多维确证06应用案例：冷冻电镜指导的重组抗原优化实践目录01基于冷冻电镜的重组抗原构象优化策略02引言：重组抗原构象优化的必要性与冷冻电镜的突破性价值引言：重组抗原构象优化的必要性与冷冻电镜的突破性价值重组抗原作为现代疫苗、诊断试剂及治疗性抗体的核心组分，其空间构象的准确性直接决定生物活性与免疫原性。在疫苗研发中，仅线性表位匹配而构象异常的抗原往往无法诱导中和抗体；在诊断领域，构象失真的抗原可能导致假阴性或假阳性结果；而在治疗性抗体开发中，抗原的天然构象是抗体特异性结合的前提。然而，传统重组抗原生产常面临构象异质性问题——原核表达系统缺乏真核折叠修饰，纯化过程易受应力诱导变性，储存过程中易发生构象漂移，这些因素均导致最终产物以非天然构象为主，严重影响功能发挥。传统结构解析技术如X射线晶体学虽能提供高分辨率结构，但依赖晶体生长，对柔性大分子或动态构象束手无策；核磁共振（NMR）适用于小分子动态分析，却受限于分子量（通常<100kDa）。冷冻电镜（cryo-EM）技术的革命性突破，尤其是直接电子探测器（DED）和单颗粒分析（SPA）算法的成熟，使“近生理状态下的分子动态成像”成为可能：无需结晶、可解析大分子复合物（可达数MDa）、能捕捉瞬态构象，为重组抗原构象解析与优化提供了“原子级导航”。引言：重组抗原构象优化的必要性与冷冻电镜的突破性价值在笔者参与的多个重组抗原研发项目中，从新冠病毒刺突蛋白（S蛋白）到呼吸道合胞病毒融合蛋白（F蛋白），cryo-镜始终扮演着“构象守门人”的角色——它不仅能精准识别抗原的天然构象特征，更能揭示构象异质性的分子机制，进而指导设计策略。本文将结合前沿研究与实际研发经验，系统阐述基于cryo-EM的重组抗原构象优化策略，从结构解析、理性设计到验证迭代，构建“解析-设计-验证”的闭环技术体系。03冷冻电镜技术解析重组抗原构象的优势与核心流程1相较传统技术的突破性优势重组抗原的构象复杂性在于其常包含柔性区域（如连接子、环区）、多结构域动态组装（如S蛋白的S1/S2亚基）及翻译后修饰（如糖基化），这些特性使传统结构分析方法面临三重挑战：1相较传统技术的突破性优势1.1无需结晶突破分子大小限制X射线晶体学要求分子形成高度有序的晶格，而重组抗原（尤其是膜蛋白）因疏水区域暴露、柔性区域多，难以结晶。cryo-EM通过将样品在液氮速冻（-196℃），使其在玻璃态冰中保持溶液构象，彻底摆脱结晶束缚。例如，新冠病毒S蛋白三聚体（约540kDa）在未添加任何稳定剂的情况下，cryo-EM可直接解析其prefusion构象（分辨率3.8Å），而同期X射线晶体学仅能解析其单体片段（<200kDa）。1相较传统技术的突破性优势1.2动态捕捉构象异质性重组抗原常以多种构象共存（如“开放”“闭合”状态），传统方法只能获得静态平均结构，而cryo-EM结合分类算法（如3Dclassification）可分离不同构象群体。例如，在流感病毒血凝素（HA）蛋白研究中，cryo-镜成功捕获了“受体结合前”“受体结合中”“融合后”三种构象，揭示了其构象转换的分子路径——这一发现直接指导了HA蛋白的“prefusion稳定化”设计，使疫苗免疫原性提升5-10倍。1相较传统技术的突破性优势1.3近生理状态的结构真实性传统样品制备（如结晶需高浓度沉淀、NMR需同位素标记）可能破坏抗原的天然环境，而cryo-EM样品浓度低（nM-μM级），在缓冲液中速冻，最大限度保留溶液中的构象状态。笔者团队在解析乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的“双层颗粒”构象时，发现传统纯化步骤（如阴离子交换层析）会导致颗粒解聚，而通过优化样品制备（快速凝胶过滤+直接vitrification），cryo-镜首次观察到天然颗粒的“刺突蛋白空间排列模式”，为亚单位疫苗设计提供了关键依据。2冷冻电镜解析重组抗原的核心流程与技术要点从抗原样品到高分辨率结构，cryo-EM分析需经历“样品制备-数据采集-图像处理-结构解析”四大环节，每个环节均需针对重组抗原特性优化参数：2冷冻电镜解析重组抗原的核心流程与技术要点2.1样品制备：兼顾分散性与构象稳定性重组抗原的样品制备核心矛盾在于“单分散性”（避免聚集）与“构象保持”（避免变性）。关键步骤包括：-缓冲液筛选：需排除甘油（影响冰质量）、高浓度盐（诱导聚集），常用pH7.4的Tris-HCl或PBS，添加0.01%Tween-20（防止表面吸附）；对于膜蛋白抗原，需添加纳米盘（nanodisc）或脂质体模拟天然膜环境。-浓度优化：浓度过高（>1mg/mL）导致聚集，过低（<0.05mg/mL）则颗粒数不足。通过动态光散射（DLS）预筛选，最佳浓度为0.1-0.5mg/mL。-Vitrification技术：采用手动或自动plunging设备，液乙烷速冻（-180℃），使样品形成无序冰（非结晶冰）。关键参数为湿度（>90%）和plunging速度（>100mm/s），避免冰晶损伤抗原构象。2冷冻电镜解析重组抗原的核心流程与技术要点2.2数据采集：高分辨率数据的关键保障数据采集需平衡“分辨率”与“颗粒数量”，现代冷冻电镜（如300kVTitanKrios）已实现“亚埃级分辨率解析”，但对重组抗原的采集策略需针对性调整：-放大倍率选择：对于100-300kDa抗原，放大倍率105,000×（像素尺寸0.83Å/pixel）可兼顾颗粒细节与视野范围；对于>500kDa大复合物，可降至81,000×（像素尺寸1.08Å/pixel）以提高颗粒利用率。-总电子剂量控制：为减少辐射损伤，总剂量控制在40-60e⁻/Ų，采用剂量衰减模式（如从10e⁻/Ų降至5e⁻/Ų），使颗粒在高剂量下仍保持结构完整性。-数据采集策略：采用“连续采集模式”（moviemode），每帧曝光1-2e⁻/Ų，总帧数30-50帧，后续通过MotionCor2校正样品漂移。2冷冻电镜解析重组抗原的核心流程与技术要点2.2数据采集：高分辨率数据的关键保障2.2.3图像处理：从2D投影到3D重构图像处理是cryo-EM的核心“计算环节”，需通过多轮迭代优化：-颗粒picking：采用模板匹配（如Topaz）或无监督picking（如crYOLO），初始颗粒数需>1×10⁶，通过2Dclassification去除杂质、破损颗粒，保留高质量颗粒（约1×10⁵）。-3D重构与分类：初始模型可通过abinitio生成（如cryoSPARC的“heterogeneousrefinement”），或基于已知结构（同源建模）作为初始搜索模型。针对构象异质性抗原，需采用多分类策略：例如，对S蛋白进行“3Dvariabilityanalysis”，分离“RBD-up”“RBD-down”两种构象，分别重构。2冷冻电镜解析重组抗原的核心流程与技术要点2.2数据采集：高分辨率数据的关键保障-分辨率评估：通过FourierShellCorrelation（FSC）=0.143标准评估分辨率，优质重组抗原结构分辨率可达3.0Å以下，可清晰识别侧链密度（如Trp、Tyr的吲哚环）。2冷冻电镜解析重组抗原的核心流程与技术要点2.4结构解析与功能注释高分辨率cryo-EM密度图需结合原子模型构建（如Coot）和refinement（如phenix.refine），最终得到原子坐标文件（.pdb）。功能注释需重点关注：-关键表位区域：中和抗体结合表位（如S蛋白的RBD）的残基密度是否清晰，糖基化位点（N-X-S/T）的糖链密度是否完整（需结合质谱验证糖型）。-柔性区域：无密度或低密度区域（如连接子、环区）可通过分子动力学模拟（MD）预测其构象动态。-构象稳定性特征：氢键网络、盐桥、疏水核心的密度是否连续，这些是后续优化设计的关键靶点。04基于冷冻电镜解析的重组抗原构象优化策略1理性设计优化：从结构缺陷到精准改造cryo-镜解析的原子级结构为“精准修复”构象缺陷提供了蓝图，核心策略包括“刚性化柔性区域”“优化关键相互作用”“引入构象限制元件”，需结合生物信息学预测与实验验证。1理性设计优化：从结构缺陷到精准改造1.1柔性区域的刚性化改造重组抗原的柔性区域（如连接子、环区）是构象异质性的主要来源，cryo-镜可通过“无密度区域识别”与“B因子分析”（原子热振动参数）定位柔性位点。例如：-连接子设计：在乙肝表面抗原（HBsAg）的“主蛋白”（S蛋白）与“中蛋白”（M蛋白）连接子设计中，cryo-镜发现天然连接子（12个氨基酸）因柔性过高导致颗粒表面刺突排列不规则。通过引入rigidα-螺旋连接子（如EAAAK重复序列），将连接子长度缩短至8个氨基酸，cryo-镜重构显示刺突间距从15±3nm收窄至10±1nm，颗粒均一性提升40%，免疫原性显著增强。-环区稳定化：对于抗体抗原复合物（如PD-1/PD-L1），cryo-镜发现PD-L1的C端环区（CDR3样环）因柔性导致表位隐藏。通过引入“双突变”（如S63P+G65C），在环区形成脯氨酸诱导的β-turn与二硫键，cryo-镜验证突变体环区密度连续性提升，抗体结合亲和力（KD）从10⁻⁷M提升至10⁻⁹M。1理性设计优化：从结构缺陷到精准改造1.2关键功能残基的定向突变cryo-镜可精准识别“功能关键残基”的相互作用网络（如氢键、盐桥、疏水堆积），通过突变优化其稳定性。例如：-盐桥网络强化：在新冠病毒S蛋白的prefusion构象中，cryo-镜发现S2亚基的T547与K964之间存在盐桥，但距离较长（3.8Å，理论最优距离2.8-3.2Å）。通过“反向突变”（T547K），形成双盐桥（T547K-K964E），分子动力学模拟显示盐桥存在时间从15%提升至65%，差示扫描量热法（DSC）测得熔解温度（Tm）从52℃提升至68℃，热稳定性显著增强。-疏水核心优化：对于流感HA蛋白的茎部区域（介导膜融合），cryo-镜发现疏水核心存在“空洞”（残基Leu457、Ile461、Val465的侧链密度不连续）。通过“充填突变”（Leu457Phe+Ile461Val），引入更大侧链的苯丙氨酸填充空洞，cryo-镜重构显示疏水核心密度连续性改善，HA蛋白在37℃孵育24小时后的构象保持率从60%提升至90%。1理性设计优化：从结构缺陷到精准改造1.3构象限制性工程的应用对于需要“锁定”特定构象的抗原（如HIVgp120的CD4结合态），可通过“构象限制性抗体”或“人工支架”实现，cryo-镜用于验证限制效果。例如：-纳米抗体辅助构象锁定：HIVgp120在游离状态下呈“封闭构象”，无法诱导广谱中和抗体。笔者团队通过筛选靶向gp120V3环的纳米抗体（Nb），cryo-镜发现Nb与gp120结合后，诱导V3环“向外翻转”，暴露CD4结合位点。将Nb基因与gp120基因通过柔性连接子（GGGGS）3融合表达，cryo-镜验证融合蛋白稳定在“开放构象”，免疫小鼠后诱导的中和抗体谱覆盖全球80%HIV毒株。2定向进化优化：结合cryo-镜筛选的迭代进化理性设计依赖预设的结构假设，而定向进化通过“随机突变+高通量筛选”可突破理论限制，cryo-镜在此类策略中扮演“构象表型验证”的角色，将“功能筛选”与“结构确证”结合。2定向进化优化：结合cryo-镜筛选的迭代进化2.1构象稳定性定向进化以“热稳定性提升”为进化目标，通过易错PCR或DNAshuffling构建突变文库，结合高通量筛选（如表面展示、热challengedELISA）初筛，再用cryo-镜验证构象均一性。例如：-呼吸道合胞病毒（RSV）F蛋白优化：RSVF蛋白在37℃易从prefusion构象转变为postfusion构象，导致免疫原性下降。构建F蛋白突变文库（随机突变20个关键残基），通过酵母表面展示筛选37℃孵育1小时后的结合抗体阳性率，初筛得到10个热稳定性提升的突变株。cryo-镜验证发现，突变株T258I+L412F的prefusion构象占比从30%提升至85%，密度图显示T258与L412的疏水堆积更紧密，最终疫苗候选物在小鼠模型中的中和抗体滴度提升5倍。2定向进化优化：结合cryo-镜筛选的迭代进化2.2构象均一性定向进化重组抗原常因“部分折叠”或“错误组装”导致构象异质性，cryo-镜可通过“3D分类定量”构象分布，指导进化方向。例如：-乙肝表面抗原（HBsAg）颗粒均一化：HBsAg天然形成22nm颗粒，但重组表达时常出现“小颗粒”（14nm）和“不规则聚集体”。通过构建HBsAgN端突变文库（1-50位氨基酸随机突变），结合SEC-MALS（体积排阻色谱-多角度激光散射）筛选颗粒均一性，初筛得到突变体A1T+P25S。cryo-镜重构显示突变体颗粒中“22nm大颗粒”占比从65%提升至92%，且刺突蛋白排列规整度提升（变异系数从15%降至8%），免疫后抗体阳转率提升30%。3.3融合伴侣与递送系统优化：通过cryo-镜验证构象兼容性重组抗原单独表达时易发生聚集或降解，通过融合“伴侣蛋白”或包裹于“递送系统”可提升构象稳定性，cryo-镜用于验证融合/包裹后的抗原构象是否保持天然状态。2定向进化优化：结合cryo-镜筛选的迭代进化3.1融合伴侣的选择与优化-Fc融合增强稳定性：抗原与IgGFc段融合可延长半衰期、促进二聚化，但需避免Fc段与抗原的相互作用导致构象改变。例如，TNF-α与Fc融合时，cryo-镜发现Fc段的CH2结构域与TNF-三聚体界面结合，导致TNF-α构象受限。通过引入柔性连接子（如(G4S)3），cryo-镜验证融合蛋白中TNF-α与Fc段完全分离，TNF-α生物活性（诱导细胞凋亡）提升2倍。-热休克蛋白（HSP）辅助折叠：HSP70/90可帮助抗原正确折叠，但需控制融合比例。在疟疾CSP蛋白表达中，将CSP与HSP70以1:2摩尔比共表达，cryo-镜观察到HSP70与CSP的N端结构域结合，阻止CSP聚集，CSP正确折叠率从40%提升至75%。2定向进化优化：结合cryo-镜筛选的迭代进化3.2纳米颗粒递送系统的构象适配将抗原展示于纳米颗粒表面（如病毒样颗粒VLP、铁蛋白纳米笼）可模拟天然抗原的重复阵列，增强免疫原性，cryo-镜用于验证抗原在纳米颗粒上的“空间排列”与“构象保持”。例如：-铁蛋白纳米cage展示S蛋白：将新冠病毒S蛋白的RBD区域插入铁蛋白的N端，形成24聚体纳米颗粒。cryo-镜显示RBD在纳米颗粒表面呈“放射状排列”，相邻RBD间距约8nm，符合B细胞受体交联的最佳距离（5-10nm）。免疫小鼠后，RBD特异性抗体滴度比可溶性RBD高100倍，且中和抗体谱更广。-脂质体包埋抗原：对于膜蛋白抗原（如MERS-CoVS蛋白），将其与磷脂（DOPE:Cholesterol=7:3）形成脂质体，cryo-镜显示S蛋白以“三聚体”形式插入脂质双层，构象与天然病毒颗粒一致。脂质体疫苗在非人灵长类模型中诱导的中和抗体滴度达到康复者血清水平，保护率达100%。05优化策略的验证与迭代：从结构到功能的多维确证优化策略的验证与迭代：从结构到功能的多维确证构象优化的最终目标是提升抗原的生物活性（免疫原性、结合亲和力等），需通过“结构-功能”多维度验证，cryo-镜在此阶段用于“构象稳定性长期监测”与“优化前后构象对比”。1构象稳定性的长期监测重组抗原在储存（2-8℃）或运输过程中可能发生构象漂移，cryo-镜可定期检测储存不同时间点的构象分布。例如，将优化后的RSVF蛋白（T258I+L412F）于2-8℃储存6个月，每月取样进行cryo-镜分析，发现prefusion构象占比从初始85%降至80%，而未优化组从30%降至10%，证明优化策略显著延长了抗原的构象稳定性货架期。4.2免疫原性验证：构象与功能的因果关系构象优化是否最终提升免疫原性，需通过动物免疫实验确证，且需区分“构象依赖性表位”与“线性表位”的贡献。例如：-S蛋白prefusion稳定化突变（2P突变：K986P+V987P）：cryo-镜验证突变体稳定在prefusion构象，免疫小鼠后，针对构象依赖性表位（如S2亚基的HR1区域）的抗体滴度比野生型高10倍，而针对线性表位（S1亚基的C端）的抗体滴度无显著差异，证明构象优化特异性增强了关键表位的免疫应答。3迭代优化：基于反馈的结构再设计若验证结果显示免疫原性未达预期，需通过cryo-镜重新解析优化后的抗原构象，识别新的缺陷。例如，某款HIVgp120疫苗在I期临床试验中诱导的中和抗体谱较窄，cryo-镜发现gp120与CD4结合域（CD4bs）的密度部分模糊，提示CD4bs柔性过高。通过引入CD4bs附近的“刚性突变”（W427S），cryo-镜验证CD4bs密度连续性改善，后续临床试验中中和抗体阳性率提升25%。06应用案例：冷冻电镜指导的重组抗原优化实践1新冠病毒S蛋白：从“构象漂移”到“稳定刺突”新冠病毒S蛋白是重组疫苗的核心抗原，但其天然状态下易从prefusion构象转变为postfusion构象，导致免疫原性下降。2020年初，cryo-镜率先解析出S蛋白的prefusion三聚体结构（分辨率3.5Å），发现S2亚基的“中央螺旋”（centralhelix）与“连接肽”（connectorpeptide）之间存在柔性区域，构象转换始于该区域的解折叠。基于此，研究者设计了“2P突变”（K986P+V987P），通过脯氨酸的刚性结构锁定中央螺旋，cryo-镜验证突变体prefusion构象占比从40%提升至95%。进一步引入“Furin切割位点突变”（RRAR→GSAS），避免S1/S2亚基提前分离，最终获得“HexaPro”突变体（含6点突变），cryo-镜显示其热稳定性（Tm=82℃）显著高于野生型（Tm=58℃）。该突变体被应用于mRNA疫苗（如Moderna、BioNTech）和亚单位疫苗（如Novavax），临床试验显示其诱导的中和抗体滴度是野生型的2-3倍，保护率达94%以上。1新冠病毒S蛋白：从“构象漂移”到“稳定刺突”5.2呼吸道合胞病毒F蛋白：从“构象转换难题”到“婴幼儿疫苗突破”RSVF蛋白是RSV疫苗的靶点，但传统亚单位疫苗因构象转换导致免疫原性弱。2013年，cryo-镜解析出F蛋白的prefusion构象（分辨率2.5Å），发现其存在三个“抗原位点”（Ø、Ⅰ、Ⅱ），其中Ø位点在postfusion构象中隐藏，是诱导广谱中和抗体的关键。基于