蛋白表达实验步骤及技巧总结

蛋白表达实验步骤及技巧总结蛋白表达是生物医学研究、药物开发及工业生产中核心的技术环节，其效率与质量直接影响后续功能研究或产品开发的成败。结合多年实验实践与优化经验，本文系统梳理不同表达系统的实验流程，提炼关键技巧，助力研究者高效获得目标蛋白。一、实验前的规划与准备（一）目标蛋白的特性分析启动实验前，需结合生物信息学工具（如UniProt、TMHMM）分析目标蛋白的分子量、等电点、跨膜结构域、糖基化位点及潜在疏水区域。若蛋白含复杂翻译后修饰（如哺乳动物特异性糖基化），需优先考虑真核表达系统；若为结构简单的胞内蛋白，原核系统（如大肠杆菌）可作为首选以降低成本、缩短周期。（二）表达系统的选择策略1.原核表达系统（以大肠杆菌为例）优势：操作简便、周期短、成本低，适合表达结构简单、无复杂修饰的蛋白。局限：易形成包涵体，对含二硫键的分泌蛋白或膜蛋白兼容性差。2.真核表达系统酵母系统（如毕赤酵母）：可实现蛋白的分泌表达与部分糖基化修饰，适合中等规模的重组蛋白制备。哺乳动物细胞系统（如HEK293、CHO）：能精准模拟天然蛋白的翻译后修饰（如糖基化、磷酸化），但操作复杂、成本高，适合功能研究或临床级蛋白生产。昆虫细胞-杆状病毒系统：兼具真核修饰与较高表达量，适合病毒相关蛋白或膜蛋白的表达。二、原核表达（大肠杆菌）的核心步骤与技巧（一）载体构建与转化1.载体选择：根据蛋白特性选择载体，如pET系列（强启动子T7，适合诱导表达）、pGEX（融合谷胱甘肽S-转移酶，利于纯化）。若需分泌表达，可选择pET-22b（含pelB信号肽）。2.转化技巧：采用新鲜制备的感受态细胞（如BL21(DE3)、Rosetta-gami），转化后先在无抗生素的LB培养基中复苏30分钟（250rpm，37℃），再涂布抗性平板，可提高转化效率。（二）诱导表达的优化1.诱导时机：待菌液OD₆₀₀达到0.6~0.8时（对数生长期中期）加入诱导剂（如IPTG），避免细胞过度生长导致代谢压力。2.温度与时间优化：若追求可溶性蛋白，可尝试低温诱导（16~25℃，诱导12~16小时），降低蛋白折叠压力；若需大量表达（含包涵体），可选择37℃诱导3~6小时。3.IPTG浓度梯度试验：从0.1mM到1mM设置梯度，筛选最佳诱导浓度（部分蛋白对高浓度IPTG敏感，低浓度反而提高可溶性）。（三）蛋白的收集与处理诱导结束后，4℃、5000rpm离心10分钟收集菌体，用预冷的PBS重悬（含蛋白酶抑制剂，如PMSF、EDTA）。若为包涵体蛋白，需用超声破碎（功率30%~50%，工作3秒/停5秒，总时长10~15分钟）后，经8M尿素或6M盐酸胍溶解，后续需复性；若为可溶性蛋白，直接取上清进行纯化。三、真核表达（以哺乳动物细胞为例）的关键流程（一）载体与转染试剂的选择载体需含真核启动子（如CMV、EF1α）、筛选标记（如嘌呤霉素抗性、Zeocin）及信号肽（如需分泌表达）。转染试剂推荐：Lipofectamine3000（效率高，毒性低）、PEI（成本低，适合大规模转染）。（二）转染与培养1.细胞状态要求：转染前24小时，将HEK293或CHO细胞铺板，确保转染时细胞密度达70%~80%汇合度，且状态良好（无悬浮、无污染）。2.转染操作：按试剂说明书混合载体与转染试剂，室温静置15分钟后滴加至细胞，6~8小时后更换新鲜培养基（含血清，避免无血清导致细胞应激）。（三）蛋白的收获与富集转染后48~72小时（根据蛋白半衰期调整），收集上清（分泌蛋白）或裂解细胞（胞内蛋白）。若表达量低，可通过换液延长培养（如96小时）或使用无血清培养基（如CD293）富集蛋白。四、跨系统通用的技巧与问题解决（一）提高蛋白可溶性的策略1.融合标签的妙用：小标签（如His₆、MBP）：简化纯化，MBP还能显著提高可溶性；大标签（如GST、Trx）：增强折叠效率，但需后续酶切去除。2.分子伴侣共表达：在原核系统中，共转化pGro7（含GroEL/GroES）或pKJE7（含DnaK/DnaJ/GrpE）质粒，帮助蛋白正确折叠。3.添加小分子助剂：在培养基或裂解液中加入1~5%甘油、0.1~1mM还原型谷胱甘肽（GSH）或低浓度去污剂（如TritonX-100），稳定蛋白结构。（二）包涵体的复性与挽救若蛋白以包涵体形式存在，可尝试：梯度透析复性：将溶解的包涵体蛋白从8M尿素逐步稀释至生理缓冲液（如PBS），过程中加入氧化型/还原型谷胱甘肽（比例1:10）促进二硫键形成；稀释复性：将变性蛋白缓慢滴入大量复性缓冲液（含辅助因子），降低蛋白浓度以减少聚集。（三）表达量低的排查思路1.转录水平：通过RT-qPCR检测mRNA水平，若低则检查启动子活性、载体整合效率（哺乳动物细胞）；2.翻译水平：优化密码子（原核系统中使用Rosetta菌株补充稀有tRNA）、调整5’UTR序列（避免二级结构抑制翻译）；3.降解问题：在培养基或裂解液中加入蛋白酶抑制剂，或在载体中添加泛素化位点突变（如K48R）减少蛋白酶体降解。五、后续纯化与鉴定（一）纯化策略亲和纯化：利用His₆、GST等标签，通过Ni-NTA、GSH树脂快速富集；离子交换/凝胶过滤：进一步去除杂蛋白，提高纯度（适合结构分析或功能实验）。（二）鉴定方法SDS与WesternBlot：验证分子量与标签完整性；SEC-HPLC或动态光散射（DLS）：分析蛋白聚集体与均一性；质谱或Edman测序：确认N端序列与翻译后修饰。结语蛋白表达是一门“经验+设计”的技术，需结合蛋白特性灵活调整策略。