宣威火腿中抗氧化肽的分离鉴定及抗氧化机理研究

宣威火腿中抗氧化肽的分离鉴定及抗氧化机理研究摘要：本研究旨在分离鉴定宣威火腿中的抗氧化肽，并深入探究其抗氧化机理。通过对宣威火腿进行酶解，运用高效液相色谱-质谱联用等技术对酶解产物进行分析，成功分离并鉴定出具有抗氧化活性的多肽。同时，借助多种体外抗氧化实验以及细胞实验，系统研究了这些抗氧化肽的抗氧化活性及作用机制。研究结果表明，宣威火腿中的抗氧化肽具有显著的抗氧化效果，能够通过多种途径发挥抗氧化作用。本研究为宣威火腿中抗氧化肽的开发利用提供了重要的实验依据，也为进一步提升火腿品质及相关产品研发奠定了理论基础。关键词：宣威火腿；抗氧化肽；分离鉴定；抗氧化机理一、引言抗氧化物质在维持生物体内氧化还原平衡、保护细胞免受氧化损伤方面发挥着关键作用。氧化应激与众多疾病的发生发展密切相关，如心血管疾病、癌症、神经退行性疾病等。因此，寻找高效、安全的抗氧化剂成为当前生命科学和食品科学领域的研究热点之一。宣威火腿作为我国著名的传统发酵肉制品，历史悠久，风味独特。其在加工过程中，蛋白质在微生物和内源酶的共同作用下发生降解，产生了丰富的多肽类物质。近年来的研究发现，火腿中的一些多肽具有抗氧化活性，这为宣威火腿的功能性研究开辟了新的方向。然而，目前对于宣威火腿中抗氧化肽的分离鉴定及抗氧化机理的研究仍相对较少，深入开展这方面的研究对于充分挖掘宣威火腿的潜在价值、推动其产业升级具有重要意义。二、材料与方法2.1材料选取具有代表性的宣威火腿样品，购自当地正规市场。主要试剂包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、高效液相色谱流动相试剂（乙腈、甲醇、三氟乙酸等）、抗氧化活性测定相关试剂（DPPH、ABTS、铁氰化钾等）、细胞培养相关试剂（DMEM培养基、胎牛血清、胰酶等）。主要仪器设备有高速冷冻离心机、高效液相色谱仪（HPLC）、质谱仪（MS）、酶标仪、细胞培养箱等。2.2宣威火腿中抗氧化肽的提取将宣威火腿样品去除表面脂肪和筋膜，切成小块后用组织匀浆机匀浆。采用不同的酶解方法进行抗氧化肽的提取，分别考察胰蛋白酶、胃蛋白酶单独酶解以及二者分步酶解的效果。酶解条件如下：胰蛋白酶酶解时，底物浓度为10%（w/v），酶与底物比为1:100（w/w），pH值为8.0，温度为37℃，酶解时间为4h；胃蛋白酶酶解时，底物浓度为10%（w/v），酶与底物比为1:100（w/w），pH值为2.0，温度为37℃，酶解时间为3h。酶解结束后，通过加热灭酶（95℃，5min），然后在4℃下以10000r/min的转速离心20min，取上清液，经旋转蒸发浓缩后冷冻干燥，得到宣威火腿酶解粗肽粉。2.3抗氧化肽的分离纯化采用多种色谱技术对粗肽粉进行分离纯化。首先，利用凝胶过滤色谱（SephadexG-25）对粗肽进行初步分离，以0.1mol/LNaCl溶液为洗脱液，流速为0.5mL/min，收集不同洗脱峰的组分。然后，对具有较高抗氧化活性的组分进一步采用离子交换色谱（DEAE-SepharoseFastFlow）进行分离，以不同浓度的NaCl溶液（0-1mol/L）进行梯度洗脱，收集洗脱峰。最后，通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）对目标组分进行精细分离，采用C18色谱柱，以乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，收集单一峰对应的组分，冷冻干燥后备用。2.4抗氧化肽的鉴定采用质谱技术（MS/MS）对纯化后的抗氧化肽进行氨基酸序列测定。将样品溶解于适量的溶剂中，通过电喷雾离子化（ESI）或基质辅助激光解吸电离（MALDI）方式将肽离子化后送入质谱仪进行分析。利用生物信息学软件对质谱数据进行解析，与蛋白质数据库进行比对，确定抗氧化肽的氨基酸序列。2.5抗氧化活性评价采用多种体外抗氧化实验方法对分离纯化后的抗氧化肽进行活性评价。DPPH自由基清除能力测定：将不同浓度的抗氧化肽溶液与DPPH乙醇溶液混合，在黑暗条件下反应30min后，于517nm处测定吸光度。以抗坏血酸（Vc）作为阳性对照，计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率(\%)=(1-\frac{A_{æ

·å“}}{A_{对照}})\times100\%其中，A_{æ

·å“}为加入抗氧化肽溶液后的吸光度，A_{对照}为未加抗氧化肽溶液的DPPH溶液的吸光度。ABTS自由基阳离子清除能力测定：将ABTS溶液与过硫酸钾溶液混合，在室温下避光反应12-16h，生成ABTS自由基阳离子。用乙醇将其稀释至在734nm处吸光度为0.70±0.02。取不同浓度的抗氧化肽溶液与稀释后的ABTS自由基阳离子溶液混合，反应6min后，于734nm处测定吸光度。以Vc作为阳性对照，计算ABTS自由基阳离子清除率。ABTS自由基阳离子清除率(\%)=(1-\frac{A_{æ

·å“}}{A_{对照}})\times100\%其中，A_{æ

·å“}为加入抗氧化肽溶液后的吸光度，A_{对照}为未加抗氧化肽溶液的ABTS自由基阳离子溶液的吸光度。铁离子还原能力（FRAP）测定：FRAP工作液由醋酸缓冲液、TPTZ溶液和FeCl₃溶液按一定比例混合而成。将不同浓度的抗氧化肽溶液与FRAP工作液混合，在37℃下反应10min后，于593nm处测定吸光度。以硫酸亚铁（FeSO₄）溶液作为标准品绘制标准曲线，计算抗氧化肽的铁离子还原能力，以相当于FeSO₄的浓度表示。2.6抗氧化机理研究细胞实验：选用人结肠癌细胞系Caco-2进行细胞实验。将Caco-2细胞接种于96孔板中，培养至对数生长期后，分为对照组、模型组和抗氧化肽处理组。模型组和抗氧化肽处理组用H₂O₂诱导细胞氧化应激损伤，抗氧化肽处理组在H₂O₂处理前先加入不同浓度的抗氧化肽孵育一定时间。采用MTT法检测细胞存活率，以评价抗氧化肽对氧化应激损伤细胞的保护作用。细胞内活性氧（ROS）水平测定：利用DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平。将Caco-2细胞接种于6孔板中，按照上述分组处理后，加入DCFH-DA探针孵育，用荧光显微镜观察细胞内荧光强度，并用流式细胞仪进行定量分析。抗氧化酶活性测定：测定细胞内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性。收集细胞，采用相应的试剂盒，按照说明书操作测定酶活性。信号通路相关蛋白表达检测：采用Westernblot技术检测与氧化应激相关的信号通路蛋白，如Nrf2、Keap1、HO-1等的表达水平，以探讨抗氧化肽的抗氧化作用机制。三、结果与讨论3.1宣威火腿中抗氧化肽的提取通过比较不同酶解方法对宣威火腿中抗氧化肽提取率及抗氧化活性的影响，发现胰蛋白酶和胃蛋白酶分步酶解的效果最佳。在此条件下，得到的酶解粗肽粉中多肽含量较高，且具有较强的抗氧化活性。这可能是由于两种酶在不同的pH条件下作用，能够更充分地降解火腿中的蛋白质，释放出更多具有抗氧化活性的肽段。3.2抗氧化肽的分离纯化经过凝胶过滤色谱、离子交换色谱和反相高效液相色谱的逐步分离纯化，最终得到了多个纯度较高的抗氧化肽组分。通过对各分离步骤中收集的组分进行抗氧化活性测定，发现不同色谱柱对肽段的分离效果不同，且具有抗氧化活性的肽段主要集中在特定的洗脱峰中。其中，经RP-HPLC分离得到的某一组分表现出最强的抗氧化活性，后续对该组分进行了进一步的鉴定和研究。3.3抗氧化肽的鉴定通过质谱分析，确定了该高活性抗氧化肽的氨基酸序列为[具体氨基酸序列]。将该序列与已知的蛋白质数据库进行比对，发现其来源于火腿中的某种蛋白质，经过发酵过程中的酶解作用产生。该抗氧化肽的氨基酸组成中含有一定比例的疏水性氨基酸和具有特殊功能的氨基酸，如组氨酸、半胱氨酸等，这些氨基酸可能与抗氧化活性密切相关。3.4抗氧化活性评价DPPH自由基清除能力：该抗氧化肽对DPPH自由基具有较强的清除能力，随着浓度的增加，清除率逐渐升高。在浓度为[X]mg/mL时，其DPPH自由基清除率达到[X]%，与阳性对照Vc在相同浓度下的清除率相当，表明该抗氧化肽具有良好的供氢能力，能够有效捕获DPPH自由基，使其失去活性。ABTS自由基阳离子清除能力：在ABTS自由基阳离子清除实验中，该抗氧化肽同样表现出显著的活性。随着浓度的升高，ABTS自由基阳离子清除率不断增加，在浓度为[X]mg/mL时，清除率达到[X]%，说明该抗氧化肽能够迅速与ABTS自由基阳离子发生反应，使其还原为无色的ABTS，从而发挥抗氧化作用。铁离子还原能力：FRAP测定结果显示，该抗氧化肽具有较强的铁离子还原能力。其铁离子还原能力随着浓度的增加而增强，以相当于FeSO₄的浓度表示，在浓度为[X]mg/mL时，其铁离子还原能力为[X]mmol/LFeSO₄当量，表明该抗氧化肽能够将Fe³⁺还原为Fe²⁺，形成稳定的络合物，从而中断自由基链式反应，发挥抗氧化作用。3.5抗氧化机理研究细胞存活率：MTT实验结果表明，H₂O₂处理后，模型组细胞存活率显著降低，而抗氧化肽处理组细胞存活率明显提高，且呈浓度依赖性。在抗氧化肽浓度为[X]μmol/L时，细胞存活率达到[X]%，接近正常对照组水平，说明该抗氧化肽能够有效保护Caco-2细胞免受H₂O₂诱导的氧化应激损伤。细胞内ROS水平：荧光显微镜和流式细胞仪检测结果显示，H₂O₂处理导致细胞内ROS水平显著升高，而抗氧化肽预处理能够显著降低细胞内ROS水平。与模型组相比，抗氧化肽处理组细胞内荧光强度明显减弱，ROS水平降低了[X]%，表明该抗氧化肽能够抑制细胞内ROS的产生，减少氧化应激对细胞的损伤。抗氧化酶活性：抗氧化肽处理组细胞内SOD、CAT和GSH-Px的活性均显著高于模型组。其中，SOD活性提高了[X]%，CAT活性提高了[X]%，GSH-Px活性提高了[X]%。这表明该抗氧化肽能够通过激活细胞内抗氧化酶系统，增强细胞的抗氧化防御能力，从而减轻氧化应激损伤。信号通路相关蛋白表达：Westernblot结果显示，抗氧化肽处理后，细胞内Nrf2蛋白表达水平显著上调，而Keap1蛋白表达水平下调，同时HO-1蛋白表达水平明显增加。这说明该抗氧化肽可能通过激活Nrf2/Keap1信号通路，促进Nrf2从细胞质转移至细胞核，与ARE结合，启动下游抗氧化酶基因（如HO-1等）的表达，从而增强细胞的抗氧化能力。综合以上结果，宣威火腿中分离得到的抗氧化肽具有显著的抗氧化活性，其抗氧化机理主要包括直接清除自由基、激活细胞内抗氧化酶系统以及调节氧化应激相关信号通路等多个方面。这些发现为深入理解宣威火腿的抗氧化特性提供了理论依据，也为其在食品、医药等领域的应用提供了新的思路。四、结论本研究成功从宣威火腿中分离鉴定出具有抗氧化活性的肽段，并对其抗氧化机理进行了深入研究。通过酶解、多种色谱技术分离纯化以及质