家蚕杆状病毒表达的hGM - CSF的纯化及糖基化分析

家蚕杆状病毒表达的hGM-CSF的纯化及糖基化分析摘要本研究旨在对家蚕杆状病毒表达系统生产的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）进行纯化，并深入分析其糖基化特征。通过一系列优化的纯化步骤，成功获得高纯度的hGM-CSF，同时利用多种分析技术明确了其糖基化修饰的类型与程度，为该生物制品的进一步开发和质量控制提供了重要依据。引言人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）在临床上具有广泛应用，如促进造血干细胞的增殖与分化、增强机体免疫功能等。家蚕杆状病毒表达系统由于其独特优势，成为生产重组hGM-CSF的有效平台。然而，表达产物往往需要经过纯化和糖基化分析，以确保其质量和生物学活性。材料与方法材料表达hGM-CSF的家蚕幼虫：由本实验室利用家蚕杆状病毒表达系统构建并饲养获得。主要试剂：Ni-NTA亲和层析介质、离子交换层析柱填料、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）相关试剂、凝集素亲和层析试剂、质谱分析相关试剂等。主要仪器：高速冷冻离心机、高效液相色谱仪（HPLC）、蛋白质印迹仪、质谱仪等。纯化方法粗提：将感染表达hGM-CSF的家蚕幼虫研磨破碎，加入适量缓冲液，充分匀浆后离心收集上清液，作为粗提物。Ni-NTA亲和层析：将粗提物上样到预先平衡好的Ni-NTA亲和层析柱，利用hGM-CSF融合蛋白上的His标签与Ni离子的特异性结合进行吸附。然后用不同浓度的咪唑缓冲液进行梯度洗脱，收集含有目的蛋白的洗脱峰。离子交换层析：将Ni-NTA亲和层析纯化后的样品进一步通过离子交换层析柱。根据hGM-CSF的等电点选择合适的离子交换介质和缓冲液pH，使目的蛋白与杂质在离子交换柱上实现分离。通过线性盐梯度洗脱，收集目的蛋白峰。凝胶过滤层析：将离子交换层析后的样品进行凝胶过滤层析，以去除残留的小分子杂质和进一步纯化目的蛋白。选用合适的凝胶过滤介质，按照标准操作进行上样和洗脱，收集单一且对称的目的蛋白峰。糖基化分析方法SDS-PAGE和蛋白质印迹分析：将纯化后的hGM-CSF进行SDS-PAGE电泳，转膜后用针对hGM-CSF的特异性抗体进行蛋白质印迹分析，初步判断目的蛋白的纯度和相对分子质量。同时，通过与已知糖基化和非糖基化蛋白标准品对比迁移率，推测hGM-CSF的糖基化状态。凝集素亲和层析：利用不同凝集素对特定糖基结构的特异性结合，将纯化的hGM-CSF与多种凝集素亲和层析柱分别作用。通过检测结合与未结合组分中的hGM-CSF，确定其糖基化修饰中可能存在的糖基类型，如甘露糖、岩藻糖等。质谱分析：对纯化的hGM-CSF进行质谱分析，包括电喷雾离子化质谱（ESI-MS）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）。通过分析质谱图中目的蛋白的质荷比（m/z）及其同位素分布，精确测定蛋白的相对分子质量，并根据相对分子质量的增加量推断糖基化修饰的程度和可能的糖型。结果纯化结果Ni-NTA亲和层析：经过Ni-NTA亲和层析，从粗提物中初步分离出hGM-CSF融合蛋白，SDS-PAGE分析显示在预期相对分子质量位置出现明显条带，杂蛋白得到部分去除，但仍存在少量杂质。离子交换层析：离子交换层析进一步纯化了hGM-CSF，SDS-PAGE结果表明杂蛋白显著减少，目的蛋白条带更加清晰，纯度得到明显提高。凝胶过滤层析：通过凝胶过滤层析，获得了高纯度的hGM-CSF，SDS-PAGE呈现单一清晰条带，蛋白质印迹分析也仅检测到目的蛋白条带，表明经过三步纯化后，hGM-CSF达到了较高的纯度。糖基化分析结果SDS-PAGE和蛋白质印迹分析：与非糖基化hGM-CSF标准品相比，家蚕杆状病毒表达的hGM-CSF在SDS-PAGE中的迁移率较慢，蛋白质印迹结果显示其相对分子质量略高于理论值，提示该蛋白存在糖基化修饰。凝集素亲和层析：经多种凝集素亲和层析分析发现，hGM-CSF能够与ConA（识别α-甘露糖和α-葡萄糖）和LCA（识别α-岩藻糖）凝集素特异性结合，表明该蛋白糖基化修饰中含有甘露糖和岩藻糖残基。质谱分析：质谱分析结果显示，家蚕杆状病毒表达的hGM-CSF的相对分子质量比理论非糖基化蛋白增加了一定数值，通过计算相对分子质量增加量及结合质谱图中糖基相关碎片离子峰，确定该蛋白存在多种糖基化形式，主要为高甘露糖型和复合型糖基化，且糖基化程度存在一定异质性。讨论本研究成功建立了一套针对家蚕杆状病毒表达的hGM-CSF的纯化及糖基化分析方法。通过优化的三步纯化策略，有效去除了杂蛋白，获得了高纯度的hGM-CSF，为后续生物活性研究和临床应用奠定了基础。在糖基化分析方面，多种技术的联合应用明确了hGM-CSF的糖基化类型和程度。家蚕杆状病毒表达系统产生的hGM-CSF具有独特的糖基化模式，与哺乳动物细胞表达的hGM-CSF糖基化存在差异。这种糖基化差异可能对hGM-CSF的生物学活性、体内半衰期及免疫原性产生影响，需要进一步深入研究。同时，本研究中糖基化分析方法的建立也为其他重组蛋白的糖基化研究提供了参考。结论通过一系列纯化步骤，成功从家蚕杆